Summary
Her presenterer vi en alternativ protokoll for aktivt å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos C57BL/6 mus, ved bruk av den immunogene epitopen myelinoligodendrocytt glykoprotein (MOG) 35-55 suspendert i ufullstendig Freunds adjuvans som inneholder den varmedrepte Mycobacterium avium underarten paratuberculosis.
Abstract
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) indusert av myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) krever immunisering av et MOG-peptid emulgert i komplett Freunds adjuvans (CFA) som inneholder inaktivert Mycobacterium tuberculosis. De antigene komponentene i mykobakteriet aktiverer dendrittiske celler for å stimulere T-celler til å produsere cytokiner som fremmer Th1-responsen via toll-lignende reseptorer. Derfor er mengden og arten av mykobakterier som er tilstede under den antigene utfordringen direkte relatert til utviklingen av EAE. Denne metodeartikkelen presenterer en alternativ protokoll for å indusere EAE i C57BL/6-mus ved bruk av en modifisert ufullstendig Freunds adjuvans som inneholder den varmedrepte Mycobacterium avium-underarten paratuberkulosestamme K-10.
M. paratuberculosis, et medlem av Mycobacterium avium-komplekset, er årsaken til Johnes sykdom hos drøvtyggere og har blitt identifisert som en risikofaktor for flere humane T-cellemedierte lidelser, inkludert multippel sklerose. Totalt sett viste mus immunisert med Mycobacterium paratuberculosis tidligere debut og større sykdomsalvorlighetsgrad enn mus immunisert med CFA som inneholdt stammen av M. tuberculosis H37Ra i samme doser på 4 mg / ml. De antigene determinantene til Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stamme K-10 var i stand til å indusere en sterk Th1 cellulær respons under effektorfasen, karakterisert ved signifikant høyere antall T-lymfocytter (CD4+ CD27+), dendrittiske celler (CD11c+ I-A/I-E+) og monocytter (CD11b+ CD115+) i milten sammenlignet med mus immunisert med CFA. Videre syntes den proliferative T-celleresponsen på MOG-peptidet å være høyest hos M. paratuberculosis-immuniserte mus. Bruk av et encefalittogen (f.eks. MOG35-55) emulgert i en adjuvans inneholdende M. paratuberculosis i formuleringen kan være en alternativ og validert metode for å aktivere dendrittiske celler for priming av myelinepitopspesifikke CD4+ T-celler under induksjonsfasen av EAE.
Introduction
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en vanlig modell for studier av humane demyeliniserende lidelser1. Det finnes flere modeller av EAE: aktiv immunisering ved bruk av forskjellige myelinpeptider i kombinasjon med potente adjuvanser, passiv immunisering ved in vitro-overføring av myelinspesifikke CD4+ -lymfocytter og transgene modeller av spontane EAE2. Hver av disse modellene har spesifikke funksjoner som gjør det mulig å studere forskjellige aspekter av EAE, for eksempel utbrudd, effektorfase eller kronisk fase. Myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) -modellen til EAE er en god modell for å studere immunmedierte mekanismer for kronisk nevroinflammasjon og demyelinisering, da den er preget av mononukleær inflammatorisk infiltrasjon, demyelinisering i perifer hvit substans og redusert utvinning etter sykdomstoppen1.
MOG-EAE induseres ved immunisering av følsomme mus med peptidet MOG35-55 i komplett Freunds adjuvans (CFA), etterfulgt av en intraperitoneal injeksjon av kikhostetoksin. Dette øker permeabiliteten til blod-hjernebarrieren og gjør at myelinspesifikke T-celler aktivert i periferien kan nå sentralnervesystemet (CNS), hvor de vil bli reaktivert3. CFA spiller en nøkkelrolle i induksjonen av EAE ved å øke antigenopptaket av antigenpresenterende celler og ekspresjonen av cytokiner relatert til humoral- og cellemedierte responser4. Denne mekanismen skyldes hovedsakelig tilstedeværelsen av drepte Mycobacterium tuberculosis emulgert i olje, hvis komponenter gir en sterk stimulans for immunsystemet5. Faktisk er induksjonen av EAE direkte relatert til mengden mykobakterie som er tilstede under den antigene utfordringen6.
Tillegg av andre drepte mykobakterier, som Mycobacterium butyricum, til ufullstendig Freunds adjuvans7, samt effekten av adjuvante kombinasjoner8, kan modulere det kliniske forløpet av EAE og følgelig påvirke reproduserbarheten av resultatene. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), det etiologiske agensen av Johnes sykdom hos drøvtyggere, har vært assosiert med inflammatoriske lidelser i det humane CNS 9, da dets antigene komponenter er i stand til å fremkalle en sterk humoral- og cellemediert respons hos pasienter med multippel sklerose og neuromyelitis optica-spektrumforstyrrelse9. Derfor viser vi i denne protokollen en alternativ og reproduserbar metode for å indusere MOG-EAE ved å erstatte M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Juntendo University School of Medicine (godkjenningsnummer 290238) og ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Generelle kommentarer til eksperimentet
- Oppbevar musene i individuelle bur i dyreavdelingen under kontrollerte, patogenfrie forhold ved 23 °C ± 2 °C med 50 % ± 10 % fuktighet, og en 12 timers lys/mørk syklus med ad libitum-tilgang til mat og vann.
- Injiser musene med fosfatbufret saltvann (PBS) uten antigen og CFA, og bruk dem som henholdsvis negative og positive kontroller.
2. Fremstilling av mykobakterielle antigener
- Dyrk M. paratuberculosis K-10-stammen i Middlebrook flytende medium 7H9 beriket med 10% OADC (oljesyre, albumin, dextrose, katalase), 0,005% mellom 80 og 2 mg / l mykolaktin J i 2 uker i T25 vevskulturflasker ved 37 ° C. Vurder koloniveksten regelmessig ved visuell inspeksjon.
FORSIKTIG: Håndter M. paratuberculosis i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) anlegg. - Dyrk anrikningskulturina 500 ml Erlenmeyer-kolben med en suspensjon på 1,7 × 105 kolonidannende enheter (CFU)/ml i et sluttvolum på 200 ml (samme medium som trinn 2,1) i en risteinkubator i 1 uke.
MERK: Siden forurensende organismer kan påvirke resultatene, må bakteriene inokuleres på Middlebrook 7H10 faste medier for å bestemme kolonimorfologi og for å verifisere renhet ved konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR) deteksjonssett for M. paratuberculosis. - Inaktiver bakterieopphengene i 5-10 min ved 70 °C og sentrifuge ved 3000 × g i 10 minutter. Vasket veid pellet i PBS to ganger, forstyrre ved sonikering, og lagre ved -20 ° C.
- Overfør pelleten til en steril beholder og frys den med tørris eller flytende nitrogen. Overfør umiddelbart til et frysetørkingskammer.
- Frysetørr (4 timer ved -50 °C under vakuum) M. paratuberkulose i henhold til maskinens håndbok.
- På slutten av lyofilisering, fjern beholderen i rustfritt stål fra frysetørkeren og overfør den til en biorensende benk. Bruk en spatel i rustfritt stål til å løsne de tørkede MAP-klumpene som fester seg til innerveggen i beholderen i rustfritt stål og pulveriser dem så fint som mulig.
- Vei de pulveriserte cellene ved hjelp av en elektronisk vekt og plasser dem manuelt i et aseptisk 10 ml hetteglass med en konsentrasjon på 10 mg/ml.
MERK: Celletettheten ble kvantifisert som gram tørrvekt per liter prøve. Etter 3 uker inneholder 1 mg (våtvekt) bakteriell cellepellet ca. 2,5 × 108 CFU.
3. Fremstilling av MOG 35-55 emulsjon
- Mal innholdet i ett hetteglass med tørket M. paratuberculosis (10 mg) til et fint pulver med en morter og støt og tilsett 10 ml til ufullstendig Freunds adjuvans for å oppnå en 10 mg/ml stamoppløsning. Oppbevares ved -4 °C.
- Før immunisering fortynnes stamoppløsningen til en endelig konsentrasjon på 4 mg/ml.
- Fortynn peptidet MOG35-55 i ddH 2 O til en endelig konsentrasjon på2mg/ml og oppbevares ved -20 °C.
- Bruk en homogenisator, bland MOG35-55-løsningen (2 mg / ml) med et likt volum adjuvans (4 mg / ml) fra trinn 3,2 i et 5 ml rør til en tykk emulsjon dannes. Etter hver 10 s blanding, legg løsningen på is i 20 s, og spinn røret for å gjenopprette all løsningen.
- Overfør emulsjonen til en 1 ml sprøyte, fjern all luft og tilsett en 27 G kanyle. Emulsjonen er nå klar til injeksjon.
NOTAT. Siden noe tap av den viskøse emulsjonen av MOG35-55 oppstår under fremstilling, er det best å forberede 1,5 ganger mengden som trengs.
4. Immunisering av dyr
- Bedøv dyrene med innånding av isofluran for å minimere stress på dyrene.
- Injiser emulsjonen (200 μL inneholdende 200 mikrogram/mus MOG35-55) subkutant i korsryggen.
- Administrer en dose kikhostetoksin (100 μL inneholdende 200 ng/mus) intraperitonealt på dag 0 og 2 etter immunisering.
FORSIKTIG: Kikhostetoksin har en multippel undertrykkende effekt på immunsystemet; Unngå inntak og kontakt med øyne og hud.
5. Klinisk vurdering
- Overvåk musene daglig for vekt og kliniske tegn. Bruk følgende skåringssystem: 0 = ingen kliniske tegn; 1 = slapp hale; 2 = svekkelse av høyre refleks og svakhet i bakre lemmer; 3 = fullstendig lammelse av bakre lemmer; 4 = fullstendig lammelse av bakre lemmer med delvis lammelse av forbenene; 5 = døende.
MERK: Ved første observasjon av kliniske tegn får dyrene økt tilgang til vann og mat. Gnagere chow er myknet og fuktet, og deretter plassert på burgulvet fra matbeholderen. Når det gjelder dehydrerte dyr, administreres subkutant væsketilskudd, eller en gnageroppslemming gis via oral gavage. Hvis en mus trenger denne typen hjelp i over 3 dager, vil eutanasi bli gjennomført. - For å unngå eller minimere smerte og ubehag hos dyr, bruk følgende menneskelige endepunkter: vekttap større enn 20 %, klinisk score ≥4,0, fravær av høyrerefleks ved score 3, og når dyret ikke har tilgang til fôr eller vann i 24 timer.
MERK: Musene ble avlivet på dag 30 etter EAE-induksjon ved intraperitoneale injeksjoner av pentobarbital (≥150 mg / kg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grupper av C57BL/6 mus (totalt n = 15/gruppe) ble immunisert med MOG35-55 i en emulsjon inneholdende M. paratuberculosis eller ved vanlig metode med CFA. Alle grupper av mus manifesterte en akutt monofasisk sykdom preget av en enkelt topp av funksjonshemming observert etter 14-17 dager, etterfulgt av en delvis gjenoppretting av symptomer i løpet av de neste 10 dagene (figur 1A). Mus immunisert med adjuvans med M. paratuberculosis, uavhengig av kjønn, debuterte tidligere fra 8 til 9 dager etter immunisering og større alvorlighetsgrad i akuttfasen enn mus immunisert med CFA (figur 1B). Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom gruppene (figur 1C). Cytofluorimetrisk analyse av miltceller fra EAE-mus og proliferativ aktivitet av T-lymfocytter vurdert ved 3H-tymidininkorporering ble utført, som tidligere publisert11. Alle miltceller fra EAE-mus, uavhengig av adjuvansen som ble brukt, viste en sterk proliferativ respons på peptidet MOG35-55, mens de ikke prolifererte som respons på kontrollpeptidet ovalbumin (figur 1D). M. paratuberculosis-immuniserte EAE-mus viste en økt andel T-lymfocytter (CD4+ CD27+), dendrittiske celler (CD11c+I-A/I-E+) og monocytter (CD11b+CD115+) i milten sammenlignet med CFA-immuniserte mus i den akutte fasen av EAE (figur 1E). Histologisk analyse med hematoksylin-eosin viste en typisk perivaskulær og meningeal mononukleær inflammatorisk infiltrasjon i hjerne og ryggmarg (figur 1F).
Figur 1: Representative EAE-resultater. (A) Klinisk score på mus evaluert daglig; (B) forskjeller i sykdomsforløp; (C) kroppsvekt; (D) T-celle proliferativ respons på MOG35-55 peptidet; (E) immuncellepopulasjoner i splenocytter i den akutte fasen; (F) histologiske bilder av ryggmargssnitt (4x forstørrelse) farget med hematoksylin-eosin (skala bar = 200 μm) i akuttfasen. Piler indikerer inflammatoriske infiltrater. Dataene viser kombinerte resultater fra tre uavhengige eksperimenter (n = 5 mus/gruppe/eksperiment). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post hoc-test eller Mann-Whitney U-test. Forkortelser: EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; MOG = myelinoligodendrocytt glykoprotein; PBS = fosfatbufret saltvann; CFA = komplett Freunds adjuvans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerte en robust alternativ protokoll for aktivt å indusere alvorlig EAE i C57BL/6J-mus ved bruk av peptidet MOG35-55 emulgert i en adjuvans inneholdende M. paratuberculosis10. Induksjonen av EAE ved denne metoden resulterte i en mer alvorlig sykdom enn den som induseres av den vanlige protokollen med CFA. Denne forskjellen kan skyldes de forskjellige lipidiske komponentene i celleveggen til mykobakteriene11. Faktisk, i motsetning til andre mykobakterier, produserer M. paratuberculosis et lipopentapeptidantigen på celleveggoverflaten i stedet for glykopeptidolipider11. Dette lipopentapeptidet kryssreagerte ikke med andre nært beslektede arter og har vist seg å være et mål for en sterk spesifikk humoral respons hos pasienter med autoimmune sykdommer12. Mykobakterier har patogenassosierte molekylære mønstre som spiller forskjellige roller i immunresponser9. For eksempel har vi nylig vist at oral immunisering med M. paratuberculosis øker alvorlighetsgraden av MOG-EAE13, mens vaksinasjon med bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 ser ut til å ha en beskyttende rolle i utviklingen av aktive og spontane EAE-modeller14.
Potensielle begrensninger i protokollen inkluderer det selvbegrensede monofasiske forløpet av EAE, som kan bli kronisk hvis konsentrasjonene av mykobakterie i adjuvansen og kikhostetoksinet dobles. Dette aspektet er svært viktig å vurdere, spesielt når man studerer det neurodegenerative aspektet av EAE ved bruk av knockout-mus, da fraværet av gjenopprettingsfase kan skyldes de høye dosene av reagensene som brukes og ikke av mangel på funksjon av visse gener. Videre, selv om protokollen beskrevet ovenfor kan brukes på andre EAE-protokoller ved å variere stammer og alder av mus eller typen og mengden protein, for å sikre at EAE-eksperimenter utføres på en metodisk korrekt måte, må eksperimentelle grupper matches for alder og kjønn.
Siden forekomsten av sykdommen kan variere, er anbefalinger for feilsøking: den optimale M. paratuberculosis-konsentrasjonen kan variere fra 2 til 4 mg / ml, og en treveiskontakt kan brukes til å blande små volumer av antigenet i vannfasen. Vi har beskrevet en metode for fremstilling av emulsjonen ved å bruke en homogenisator; Imidlertid innebærer en alternativ og enkel metode for å blande små mengder antigen i vannfasen, i oljefasen, bruk av en treveis koblingsbeslag, som to glasssprøyter er koblet til. Avslutningsvis identifiserte vi M. paratuberculosis som en potent adjuvanskandidat i induksjonen av aktiv EAE. Videre studier av virkemåten og typen immunitet indusert i forskjellige dyrearter vil øke tilliten til muligheten for å vedta denne alternative metoden for å forstå mekanismen for nevroinflammasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet mottok støtte fra et stipend fra Japanese Society for the Promotion of Science (stipend nr. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G.
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
