Summary
Denne artikkelen presenterer en protokoll for rettet differensiering og funksjonell analyse av β-cellelignende celler. Vi beskriver optimale dyrkningsbetingelser og passasjer for humane pluripotente stamceller før generering av insulinproduserende pancreasceller. Den seks-trinns differensieringen utvikler seg fra definitiv endodermdannelse til funksjonelle β-cellelignende celler som utskiller insulin som respons på glukose.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) kan differensiere til alle slags celler, noe som gjør dem til en utmerket alternativ kilde til humane β-celler i bukspyttkjertelen. hPSCs kan enten være embryonale stamceller (hESCs) avledet fra blastocysten eller induserte pluripotente celler (hiPSCs) generert direkte fra somatiske celler ved hjelp av en omprogrammeringsprosess. Her presenteres en videobasert protokoll for å skissere de optimale dyrknings- og passasjeforholdene for hPSCs, før differensiering og påfølgende generering av insulinproduserende bukspyttkjertelceller. Denne metoden følger sekstrinnsprosessen for β-cellerettet differensiering, hvor hPSCs differensierer til definitiv endoderm (DE), primitivt tarmrør, bakre foregut skjebne, bukspyttkjertelprogenitorer, endokrine progenitorer i bukspyttkjertelen og til slutt bukspyttkjertel β-celler. Det er bemerkelsesverdig at denne differensieringsmetoden tar en periode på 27 dager for å generere humane β-celler i bukspyttkjertelen. Potensialet for insulinsekresjon ble evaluert gjennom to eksperimenter, som inkluderte immunfarging og glukosestimulert insulinsekresjon.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har den unike evnen til å differensiere til forskjellige celletyper, noe som gjør dem til et levedyktig alternativ til humane bukspyttkjertel β-celler1. Disse hPSCene er kategorisert i to typer: embryonale stamceller (hESCs), avledet fra blastocyst2, og induserte pluripotente celler (hiPSCs), generert ved å omprogrammere somatiske celler direkte3. Utviklingen av teknikker for å differensiere hPSCs i β-celler, har viktige implikasjoner for både grunnleggende forskning og klinisk praksis 1,4. Diabetes mellitus er en kronisk sykdom som påvirker > 400 millioner mennesker over hele verden og skyldes kroppens manglende evne til å regulere glykemi på grunn av funksjonsfeil eller tap av bukspyttkjertel β-celler5. Den begrensede tilgjengeligheten av øyceller i bukspyttkjertelen for transplantasjon har hindret utviklingen av celleerstatningsterapier for diabetes 2,4,6,7. Evnen til å generere glukoseresponsive insulinutskillende celler ved hjelp av hPSCs tjener som en nyttig cellulær modell for å studere utvikling og funksjon av menneskelige øyer. Det kan også brukes til å teste potensielle terapeutiske kandidater for diabetesbehandling i et kontrollert miljø. Videre har hPSCs potensial til å produsere øyceller i bukspyttkjertelen som er genetisk identiske med pasienten, noe som reduserer risikoen for immunavstøtning etter transplantasjon 2,4,7.
I de senere år har det vært betydelige fremskritt i forfiningen av hPSC-kultur og differensieringsprotokoller, noe som resulterer i økt effektivitet og reproduserbarhet av differensieringsprosessen mot å generere bukspyttkjertelen β-celler 8,9.
Følgende protokoll skisserer de essensielle stadiene av rettet differensiering av bukspyttkjertelen β-celler. Det innebærer regulering av spesifikke cellesignalveier på forskjellige tidspunkter. Den er basert på protokollen utviklet av Sui L. et al.10 (2018) for generering av hPSCs i bukspyttkjertelen β-celler. Protokollen ble justert til nylige oppdateringer fra Sui L. et al.11 (2021), da den nyeste forskningen understreker betydningen av å bruke aphidicolin (APH) behandling for å forbedre differensieringen av β-celler. Den nåværende protokollen inkluderer tillegg av APH til mediet i de senere stadiene av prosessen. Videre er det gjort endringer i sammensetningen av mediet i de tidlige stadiene av differensiering sammenlignet med den opprinnelige protokollen. En merkbar endring er tilsetningen av keratinocyttvekstfaktor (KGF) på dag 6 og fortsetter til dag 8. Keratinocyttvekstfaktoren (KGF) introduseres fra dag 6 til dag 8, noe som avviker litt fra den opprinnelige protokollen10, hvor KGF ikke var inkludert i stadium 4-mediet.
Det første og essensielle trinnet i genereringen av β-cellelignende celler er den rettede differensieringen av hPSCs til definitiv endoderm (DE), et primitivt kimlag som gir opphav til epitelforingen av forskjellige organer, inkludert bukspyttkjertelen. Etter dannelsen av DE gjennomgår cellene differensiering i det primitive tarmrøret, som etterfølges av spesifikasjonen av den bakre foregutskjebnen. Den bakre foregut utvikler seg deretter til bukspyttkjertelprogenitorceller, som har potensial til å differensiere i alle celletyper i bukspyttkjertelen, inkludert endokrine og eksokrine celler. Den påfølgende fasen i prosessen involverer endokrine forfedre i bukspyttkjertelen som gir opphav til hormonutskillende celler som finnes i øyene Langerhans. Til slutt når differensieringsprosessen sitt siste stadium ved å produsere fullt funksjonell bukspyttkjertel β-cellelignende celler 9,10. Det er viktig å merke seg at denne prosessen er kompleks og ofte krever optimalisering av kulturforholdene, for eksempel spesifikke vekstfaktorer og ekstracellulære matrisekomponenter, for å forbedre effektiviteten og spesifisiteten til differensiering 9,10. Videre er det fortsatt en stor utfordring å generere funksjonelle β-cellelignende celler fra hPSCs in vitro. Pågående forskning fokuserer på å forbedre differensieringsprotokoller og forbedre modningen og funksjonen til de resulterende β-cellene9.
I denne protokollen er bruk av mild celledissosiasjon under kulturen og passasjen av hPSCs avgjørende for å opprettholde cellens levedyktighet og pluripotens, noe som betydelig forbedrer effektiviteten av differensiering i bukspyttkjertelen β-celler. I tillegg har hvert trinnsspesifikt medium blitt omhyggelig optimalisert etter protokollen utviklet av Sui L. et al.10 for å fremme et høyt utbytte av insulinutskillende celler i klynger som ligner den menneskelige øyen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før differensiering initieres, anbefales det å bestemme det nødvendige antall holmelignende organoider for eksperimentelle formål. I en 6-brønns plate består en enkelt brønn med over 80% samløp typisk av 2-2,3 millioner hPSCer. Mens en nøyaktig prediksjon er utfordrende på grunn av variasjoner i hPSC-linjer og differensieringseffektivitet, er et grovt estimat 1,5 ganger antall innledende brønner. En effektivt rettet differensiering gir vanligvis 1, 6 til 2 millioner celler per brønn i seksbrønnsplater, som omfatter alle celler i klyngene i stedet for utelukkende insulinproduserende celler. For en 50 μm klynge kan den tilnærmes til å inneholde rundt 10.000 celler. Tabell 1 gir en oppsummering av mediesammensetningen som brukes for hver dag/stadium av rettet differensiering på toppen av stamcellematrise og medium, sammen med glukosestimulert insulinsekresjonsbuffer.
1. Passering av humane pluripotente stamceller før differensiering i 6 brønnplater
MERK: Riktig passering av humane stamceller før differensiering til β-cellelignende celler er et avgjørende skritt i å etablere den eksperimentelle prosessen. Feil passasjefortynning eller festecellenummer kan kompromittere differensieringseffektivitet og gjengivelse.
- Forbered stamcellekulturmedium, belegg og dissosiasjonsløsninger (som angitt i tabell 1).
- 1-2 timer før passering, belegg en seks-brønns plate med kald beleggløsning (1 ml per brønn) og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2.
- Varm en alikot av stamcellekulturmedium ved romtemperatur (15-25 °C) i 20 minutter.
- Aspirer stamcellemediet og tilsett 1 ml kalsium/magnesiumfri D-PBS.
- Gjenta trinn 1.4. to ganger.
MERK: D-PBS tilsettes for å vaske cellene og fjerne det forrige mediet og forbindelsene. Det er viktig å merke seg at ingen spesifikk tidsramme er nødvendig for vasketrinnene, da eksponering for D-PBS ikke skader hPSCene, forhindrer cellebrudd eller krymping forårsaket av osmose. - Aspirat D-PBS, tilsett 500 μL dissosiasjonsløsning for hver brønn, og la den stå i 2-5 minutter ved romtemperatur (15 - 25 °C).
- Mens cellene dissosierer, aspirerer du beleggløsningen til den nye 6-brønnplaten og tilsetter 1-2 ml kalsium / magnesiumfri D-PBS til hver brønn.
- Kontroller regelmessig dissosiasjonsprosessen under det inverterte mikroskopet.
- Aspirer dissosiasjonsløsningen når 80 - 90% av cellene har avrundet, men fortsatt er festet.
- Tilsett 1 ml av stamcellemediet som inneholder 10 μM ROCK-hemmer.
- Samle de dissosierte cellene i et 15 ml konisk rør ved hjelp av 1000 μL sterile filtrerte pipettespisser og en P1000-pipette.
- Triturer cellesuspensjonen sakte opp og ned i pipetten med en 1000 μl steril pipettefiltrert spiss for å bryte koloniene, men ikke overskride 10 ganger.
- Tilsett 1 ml av stamcellemediet som inneholder ROCK-hemmer for å bidra til å løsne de gjenværende hPSCene og overføre cellesuspensjonen til det samme 15 ml koniske røret (1,10).
- Aspirer D-PBS fra den nylig belagte platen og tilsett umiddelbart cellesuspensjonen fra det koniske 15 ml røret. For å sikre optimal cellevekst, frø et område på 2 x 105- 1 x 106 levedyktige celler per brønn når du bruker en 6 brønnplate (1 av 10 til 1 i 50 splitter).
MERK: For volumberegning må hver brønn i en 6-brønns plate inneholde 2 ml stamcellemedium med ROCK-hemmer. - Beveg platen raskt frem og tilbake, og fra side til side 5 - 10 ganger.
- Plasser platen ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.
- Erstatt med friskt stamcellemedium uten ROCK-hemmer neste dag, og deretter hver 2. dag til sammenløpet av hPSCs har nådd 80 - 95%.
2. Human stamcelleavledet β-celler rettet differensiering
MERK: HPSCene kan brukes til direkte differensieringsprosessen i bukspyttkjertelen β-celler når 80-95% sammenløp oppnås.
- Dag -1: Passering av cellene Dag -1 av differensiering:
- 1-2 timer før passasje, belegg en 6 brønnplate med kald beleggløsning i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 1 time.
- Følg trinn 1.1 til 1.10 og fortsett til å telle celler.
- Legg 10 μL av celleblandingen, tilsett et like stort volum Trypan Blue, og bland forsiktig.
- Beregn cellekonsentrasjonen. Bruk 0,8 × 106 celler/ml - 1,0 x 106 celler/ml stamcellemedium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer til å plate den belagte 6-brønnplaten med 2 ml media per brønn.
- Beveg platen raskt frem og tilbake, fra side til side tre ganger.
- Plasser platen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Beveg platen raskt frem og tilbake, og fra side til side igjen 10 ganger. Deretter inkuberer platen i 4 timer.
MERK: Sørg for at maksimal vedlegg og jevn fordeling av celler ikke forstyrrer cellene ved å bevege platen når den er plassert i inkubatoren. Åpne og lukk inkubatoren veldig forsiktig. - Sett flasken med basalmedium i dag 0 til 4 ved 4 °C for å tine den over natten.
- Dag 0
MERK: HPSC-ene må være 80 - 95% sammenflytende, ikke start differensieringsprosessen til definitiv endoderm under den sammenløpet.- Tine både basalmediet for dag 0 til 4 og kosttilskudd på is (se materialfortegnelse).
- Forbered i to koniske rør bare det nødvendige volumet som skal brukes på dag 1 (2 ml per brønn i en 6-brønnsplate), og i et separat rør, doble volumet for dag 2,5 til 4 (2 x 2 ml per brønn på en 6-brønnsplate). Oppbevar dagen 2,5 til dag 4 middels ved 4 °C.
- Varm et alikot med nødvendig volum på dag 1 medium og vaskemedium 1 i et vannbad på 37 °C i 5 minutter.
- Aspirer stamcellemediet og tilsett 2 ml vaskemedium 1.
MERK: Vaskemediet som brukes i protokollen består av basalmediet spesifikt for hver dag/stadium, supplert med 1% antibiotika. Vasketrinnene i den direkte differensieringsprotokollen innebærer bare tilsetning av det angitte vaskemediet (referert til som "vaskemedium 1 eller 2", materialfortegnelse) og påfølgende aspirasjon, etter den beskrevne prosedyren 2.2.4. Det er viktig å nevne at det ikke er angitt noen spesifikk tidsramme for disse vasketrinnene. - Aspirer vaskemedium 1 og tilsett umiddelbart 2 ml av dag 1-mediet til siden av brønnen.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 %CO2 i 24 timer.
- Dag 1
- Forvarm en alikot med nødvendig volum på dag 2,5 til 4 medium i et vannbad på 37 °C i 5 minutter.
- Aspirer dag 1 medium og tilsett umiddelbart 2 ml av dagen 2,5 til 4 medium til siden av brønnen. Ikke vask cellene.
- Sett platen tilbake ved 37 °C og 5 % CO2 i 36 timer.
- Dag 2,5 til 4
- Forvarm en aliquot av dagens gjenværende volum 2,5 til 4 middels i 37 °C vannbad i 5 minutter.
- Aspirer mediet og tilsett umiddelbart 2 ml nylagde dag 2,5 til 4 medium til siden av brønnen.
- Sett platen tilbake ved 37 °C og 5 % CO2 i 36 timer.
- Dag 4
MERK: På dette stadiet er uttrykket av de definitive endodermmarkørene på sitt maksimale, og celler kan initiere primitiv tarmrørdifferensiering.- Forbered en alikot med nødvendig volum av dag 4 primitivt tarmstadiummedium (2 ml per brønn på en seksbrønnsplate) og varm den ved romtemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minutter.
- Aspirate Days 2,5 til 4 middels og tilsett 2 ml vaskemedium 1.
- Aspirer vaskemediet 1, og tilsett umiddelbart 2 ml av dag 4 primitivt tarmstadium til siden av brønnen.
- Sett platen tilbake ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
- Dag 6 til 8
MERK: På dette stadiet initierer cellene ytterligere differensiering på bakre foregut skjebne.- Klargjør nødvendig volum på dag 6 til 8 bakre fortarmmedium (2 ml per brønn på en 6 brønnplate) og varm mediet ved romtemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minutter.
- Aspirer dag 4 medium og tilsett umiddelbart 2 ml av dag 6 til 8 bakre foregut medium til siden av brønnen.
- Plasser platen ved 37 °C inkubator inneholdende 5% CO2 i 48 timer.
- Dag 8 til 12
MERK: Cellene er klare til å gjennomgå differensiering av bukspyttkjertelprogenitorer.- Klargjør nødvendig volum på dag 8 til 12 pankreatisk progenitors stadiummedium (2 ml per brønn på en 6 brønnplate) og varm mediet ved romtemperatur (15 °C -25 °C) i 20 minutter.
- Aspirer dagene 6 til 8 middels og tilsett umiddelbart 2 ml av dag 6 til 8 bakre foregut medium til siden av brønnen.
- Plasser platen i en inkubator ved 37 °C som inneholder 5% CO2 i 48 timer.
- Dag 12: Utføre klyngetrinnet
MERK: På dette stadiet danner cellene et tett monolag, og vil bli overført til 3D-cellekultur for å danne klynger. Dette trinnet er avgjørende for differensieringen for å forbedre den strukturelle likheten til β-lignende celler til innfødte menneskelige øyer, men forbedrer også deres funksjonelle likhet på både cellulært og klyngenivå11 (figur 1).- Behandle en 6-brønnsplate som inneholder mikrobrønner som er 400 μm (som spesifisert i materialtabellen: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, dag 12) med 2 ml skylleløsning mot adherens ved romtemperatur (15 °C - 25 °C).
MERK: Mikrobrønnen hindrer celler i å feste seg til brønnbunnen og muliggjør mekanisk dannelse av 3D-klynger. - Sentrifugeplate ved 1,300 x g i 5 min.
- Kontroller tilstedeværelsen av bobler under et omvendt mikroskop. Hvis ingen bobler observeres, aspirer skylleoppløsning mot overholdelse og tilsett umiddelbart 2 ml vaskemedium 2 (materialfortegnelse).
- Gjenta trinn 1.8.3. to ganger.
- Tilbered nødvendig volum av klyngemediet og varm det ved romtemperatur (15-25 °C) i 20 minutter. Sørg for at to brønner på en 6 brønns plate går inn i en brønn på 400 μm microwells 6 well plate med 4 ml av klyngemediet.
- Aspirat pankreatisk stammedium og legg til dissosiasjonsbuffer (0,5 ml per brønn).
- Inkuber ved romtemperatur (15 °C - 25 °C) i 2-5 minutter. Kontroller regelmessig dissosiasjonsprosessen under et invertert mikroskop og aspiratdissosiasjonsbuffer når de fleste cellene har avrundet, men fortsatt er festet.
- Aspirer dissosiasjonsbufferen og tilsett umiddelbart 1 ml klyngemedium til hver brønn.
- Dissosiere celler ved å pipettere forsiktig opp og ned seks ganger med en P1000-pipette og 1000 μL filterspisser.
- Overfør cellene og klyngemediumblandingen til et 50 ml konisk rør.
- Legg til 1 ml av klyngemediet for å samle alle gjenværende celler.
- Tilsett klyngemediet til det totale volumet som trengs, slik at hver brønn på mikrobrønnplaten har 4 ml blandingsklyngemedium/cellet.
- Aspirer vaskemediet 2 fra microwells 6-brønnsplate og overfør cellesuspensjonen. Inkuber platen ved 37 °C i 24 timer.
- Behandle en 6-brønnsplate som inneholder mikrobrønner som er 400 μm (som spesifisert i materialtabellen: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, dag 12) med 2 ml skylleløsning mot adherens ved romtemperatur (15 °C - 25 °C).
- Dag 13: Håndtering av cellene etter klynging og endring av medier fra dag 13 og utover.
MERK: Klynger er svært følsomme og krever nøye håndtering for å sikre deres integritet og levedyktighet i de følgende dagene. Derfor er det avgjørende å følge nøye med på klyngene i perioden etter dag 12. Regelmessig evaluering og justeringer er avgjørende for å fremme vellykkede resultater i eksperimentell prosess.- Klargjør det nødvendige volumet av dag 13 medium (2 ml per brønn på en 6 brønnplate), og i et separat konisk rør på 50 ml for dag 15 til 20 pankreas endokrine stammedium.
- Samle sakte klynger fra microwells 6-brønnplaten til et 50 ml konisk rør ved hjelp av en p1000-pipette og 1000 μL filtrerte spisser.
- Tilsett 1 ml av dag 13 medium for å samle de resterende klyngene og overføre klyngene inn i røret.
- La cellene sette seg naturlig under tyngdekraften til bunnen av det koniske røret i 5 minutter.
- Aspirer så mye supernatant som mulig fra røret uten å forstyrre celleklyngene. Pipettespissene skal ikke berøre eller aspirere klyngene, men bare supernatanten.
- Legg til nødvendig volum av Dag 13 medium i henhold til følgende: 1 brønn med mikrobrønner 6 brønnplate går inn i tre brønner med lav vedlegg 6 brønnplate (2 ml media per brønn).
- Pipetter forsiktig opp og ned, unngå aspirerende klynger.
- Overfør suspensjonen til en 6-brønnplate med svært lav klebevirkning.
- Beveg platen raskt frem og tilbake, fra side til side seks ganger.
- Inkuber platen ved 37 °C i 48 timer.
- Utfør middelendringene i alle de neste trinnene til slutten av differensieringen som beskrevet i dette avsnittet 2.9.
- Dag 15 til 20
- Bytt til pankreas endokrine stamstadiummedium hver 48. time til dag 21 av differensiering ved å samle cellesuspensjonen i et 50 ml konisk rør og følge trinn 2.9.4 til 2.9.10 for dag 13.
- Dag 21 til 27
MERK: På dette stadiet skiller klynger seg på bukspyttkjertelen β-celler.- Forbered bukspyttkjertel β-celle stadium medium.
- Bytt medium annenhver dag som beskrevet for dag 15 til 21.
MERK: Etter dag 25 kan de holmelignende organoidene gjennomgå analyse for å bekrefte at de er fullt funksjonelle.
3. Farging av bukspyttkjertel β-celle klynger
MERK: Utfør dette trinnet for å studere funksjonsvurderingen av klynger etter differensiering
- Samle fem til ti klynger i et 1,5 ml mikrosentrifugerør på slutten av differensieringen.
- Fest celleklyngene med 200 μL på 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 1 ml PBS i klyngene og fjern PBS med en 1000 μL pipettespiss uten å forstyrre klyngene.
- Tilsett 200 μL 30 % sukrose i klyngene og rug over natten ved 4 °C.
- Overfør klyngene til en cryomold, fjern ekstra sukrose, tilsett en dråpe O.C.T. medium, og bland klyngene med O.C.T. medium.
- Frys kryomolen på tørris og oppbevar ved -80 °C.
- Klipp 5 μm seksjoner fra den frosne blokken på mikroskopglass ved hjelp av en mikrotome / eller kryostat.
- Oppbevar lysbilder ved -80 °C fryseren til flekker.
- På fargedagen tar du lysbildene ut av fryseren ved -80 °C.
- Fjern forsiktig isen rundt kryomoldens seksjoner.
- Sirkle celleklynger på lysbilder med en hydrofob penn.
- Rehydrer skliene i en glassfargekrukke som inneholder PBS i 15 minutter.
- Tilsett kald metanol i glideglasset og legg glasset med lysbilder ved -20 °C i 10 minutter.
- Fordyp lysbilder i en PBS-krukke.
- Gjenta trinn 3.14 tre ganger.
MERK: Bruk denne metoden for alle følgende vasketrinn. - Fjern PBS fra lysbildene og dekk umiddelbart med 100 μL blokkeringsløsning med 2-5% BSA i PBS-T.
- Legg blokkeringsløsning til hvert lysbilde og dekk med parafinfilm.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur (15-25 °C).
- Fortynn de primære antistoffene i blokkeringsløsningen ved hjelp av forholdene gitt i avsnittet Reagenser og oppløsninger.
- Fjern blokkeringsløsningen fra lysbildene.
- Tilsett umiddelbart fortynnede antistoffer og dekk lysbilder med parafilm for å forhindre at lysbildet blir tørt.
- Inkuber over natten ved 4 °C.
- Neste dag vaskes lysbildene 3 - 5 ganger med PBS-T.
- Forbered fortynnede sekundære antistoffer og DNA-flekk.
- Fjern overflødig PBS-T fra lysbildene.
- Tilsett fortynnede sekundære antistoffer og DNA-flekk. Inkuber i 45 minutter ved romtemperatur (15 -25 °C).
- Vask lysbildene 3 - 5 ganger med PBS-T.
- Fjern væske fra lysbildene.
- Legg til en dråpe histologimonteringsmedium til hver seksjon.
- Dekk lysbildet med et glassdeksel.
- Ta bilder av fargede lysbilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
4. GSIS (glukosestimulert insulinsekresjonsanalyse)
- Forbered tre forskjellige løsninger: lav glukose KREBS-løsning, høy glukose KREBS-løsning og lav glukose KREBS-løsning med KCl.
- Varm alle løsningene ved 37 °C vannbad.
- Velg nøye ut rundt 10–15 klynger av tilsvarende størrelse ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss og overfør dem til et 1,5 ml rør sammen med en liten mengde differensiert medium for å unngå å tørke ut klyngene.
MERK: Klyngene skal være synlige for det blotte øye, men hvis ikke, plasser platen som inneholder differensierte klynger under et omvendt mikroskop for å velge klyngene og overføre dem til et 1,5 ml rør. - Plasser røret med klynger og medium på et rørstativ og vent til klyngene synker til bunnen av røret.
- Aspirer supernatanten langsomt med en 200 μL pipette og tilsett 200 μL KREBS-oppløsning med lav glukose.
- Inkuber øyene i lavglukoseoppløsningen i 1 time ved 37 °C.
MERK: For å sikre nøyaktig vurdering av klyngenummer og konsistens i eksperimenter, anbefales det å kontrollere tilstedeværelsen av alle klynger i løsningen under overføring, da de pleier å feste seg til røret. - Fjern røret fra inkubatoren og sakte aspirer 200 μL KREBS-oppløsning uten å aspirere noen klynger.
- Tilsett 200 μL KREBS-oppløsning med lav glukose og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Aspirer volumet på 200 μL KREBS-oppløsning med lav glukose i et 500 μL rør og oppbevar det umiddelbart ved -80 °C for insulinmålinger. Gjenta for separate behandlinger.
- For å vaske klyngene, tilsett 200 μL KREBS-oppløsning uten glukose til røret som inneholder klyngene. La klyngene legge seg til bunnen av røret, og fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre klyngene.
- Tilsett 200 μL KREBS-oppløsning med høy glukose og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Aspirer 200 μL høy glukose KREBS inn i et 500 μL rør og oppbevar det umiddelbart ved -80 °C for insulinmåling. Gjenta for separate behandlinger.
- For å vaske klyngene, tilsett 200 μL KREBS-oppløsning uten glukose til røret som inneholder klyngene. La klyngene legge seg til bunnen av røret, og fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre klyngene.
- Tilsett 200 μL KCl KREBS-oppløsning og gjenta for separate behandlinger.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Aspirer 200 μL KCl KREBS-oppløsning til et 500 μL rør og oppbevar det umiddelbart ved -80 °C for insulinmålinger. Gjenta for andre behandlinger.
- Tilsett 50 μL ultrarent vann og fortsett med å måle totalt insulininnhold.
- Tilsett 150 μL syreetanoloppløsning til røret med holmer og ultrarent vann.
- Oppbevar prøver ved 4 °C over natten (12-15 timer).
- Dagen etter tar du hver prøve.
- Utfør sonikering med en elektrisk sonikator satt til 20% effekt i 1 s for å sikre fullstendig lysering av øyvevet.
MERK: Gjenta trinn 4.21 til ingen gjenværende klynger er synlige. - Sentrifuge alle prøver ved 10 000 × g i 10 minutter og hold supernatanten.
- Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et nanodrop spektrofotometer, som deretter kan brukes til å normalisere insulinmålinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet i denne artikkelen gir en svært effektiv tilnærming for å skille β-lignende celler fra hPSCs10. Denne prosessen benytter et 2D-kultursystem som er lett skalerbart, slik at det kan brukes i ulike eksperimentelle innstillinger, for eksempel læringsdifferensiering, mindre prosjekter og laboratorier, og pilottester for å vurdere potensialet til en iPSC-linje for differensiering.
Det er viktig å karakterisere de funksjonelle egenskapene til differensierte β celler i øyer for å få innsikt i glukosehomeostase. Dette oppnås vanligvis gjennom ulike eksperimenter som immunfarging for β-cellemarkører og insulinuttrykk, samt glukosestimulert insulinsekresjon (GSIS) analyser, som tester øyfunksjonen som respons på lave og høye glukosekonsentrasjoner12,13. β-celler har signaturgener, inkludert Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 og Neurod1, som er kritiske for å etablere og opprettholde β-celleidentitet9. Immunfargingsteknikker er verdifulle for å undersøke proteinuttrykk og lokalisering i vevssnitt. Immunfarging for β-cellemarkører kan vurdere ekspresjonsnivåene til viktige bukspyttkjertellinjemarkører, og gi innsikt i differensieringsprosessens troskap og optimalisering for spesifikke applikasjoner 9,12.
I denne studien ble Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC-reporterlinjen brukt til å skille klynger som omfatter forskjellige celletyper, inkludert β-celler som ligner de som finnes i menneskelige innfødte øyer. Figur 2 i denne artikkelen gir betydelige funn angående effektiviteten og nøyaktigheten av differensieringsprosessen. Resultatene viser en høy anrikning av insulinuttrykkende celler i bukspyttkjertelen, og disse cellene utviser glukosestimulert insulinsekresjon. Dette indikerer vellykket generering av funksjonelle β-lignende celler gjennom differensieringsprosessen.
De differensierte cellene ble stimulert med lave og høye glukosekonsentrasjoner, og GSIS-resultater viste at klyngene avledet fra Mel1-celler fungerte på samme måte som øyer i deres insulinsekresjonsrespons på glukose. De Mel1-avledede klyngene ble funnet å utskille 100 ganger mer insulin som respons på høye glukosekonsentrasjoner sammenlignet med lave glukosekonsentrasjoner. Spesielt var insulininnholdet 0,003 ± 0,002 % ved 3,3 mM lav glukose og 0,236 ± 0,197 % ved 16,7 mM høy glukose.
Klyngene avledet fra Mel1 INS-GFP hESCs ble gjenstand for ytterligere analyser for å bestemme deres sammensetning og funksjonalitet, i tillegg til GSIS-analysen. Spesielt ble uttrykket av β-celle signaturgener og tilstedeværelsen av forskjellige celletyper i klyngene undersøkt. Resultatene viste at bukspyttkjertellinjen oppnådd fra denne prosessen er sterkt beriket i insulinpositive celler, noe som indikerer et høyt suksessnivå i differensieringsprosessen av hESCs i β-cellelignende celler. Videre ble uttrykket av signaturgener, som Nkx6.1 og Pdx1, viktige for etablering og vedlikehold av β-celleidentiteter, undersøkt. Analysen viste at omtrent 25 % og 40 % av cellene uttrykte henholdsvis Nkx6.1 og Pdx1, noe som ga ytterligere bevis for at klyngene inneholdt differensierte β-lignende celler (gjennomsnittlige Nkx6.1+-celler per klynge 24.9 % ± 6.2 %, n=9 klynger, Pdx1+-celler 40.2 % ± 6.2 %, n=9, SEM, figur 2). I tillegg inneholdt klyngene andre celletyper, for eksempel glukagon-positive celler, som utgjorde rundt 15% av den totale cellepopulasjonen. Disse cellene finnes vanligvis i alfa-celler av innfødte øyer av Langerhans, noe som tyder på at klyngene ligner menneskelige øyer når det gjelder cellesammensetning.
Figur 1 Differensiering av hPSCs mot pankreas β-celler. (A) Skjematisk fremstilling av in vitro-rettet differensiering av hPSCs i pankreatisk β-celler, som involverer seks påfølgende stadier: definitiv endoderminduksjon, primitiv tarmrørdannelse, bakre foregut skjebnespesifikasjon, pankreasprogenitorgenerering, endokrin stamdannelse i bukspyttkjertelen, og til slutt bukspyttkjertel- β-celledifferensiering. Bukspyttkjertel β-celle differensiering bruker viktige stadier av menneskelig øyutvikling, med regulering av spesifikke cellesignalveier på bestemte tidspunkter. B27: B-27 Tillegg; Ri: rho-assosiert proteinkinasehemmer eller ROCK-hemmer; T3: skjoldbruskhormon; KGF: humant KGF / FGF-7 protein; RepSox: Activin / Nodal / TGF-β banehemmer; hemmer ALK5; RA: Retinsyre; ZS: sinksulfat; UFH: ufraksjonert heparin; XX: gamma-sekretasehemmer XX; APH: aphidicolin; EGF: epidermal vekstfaktor; LDN: BMP-hemmer III, LDN-212854; Cyclo: Cyclopamine- KAAD. (B) Bilder av cellulær morfologi fanget på ulike stadier av differensiering fra pluripotente stamceller til bukspyttkjertel β-celler. Det første bildet viser humane pluripotente stamceller på den første dagen av differensiering (monolag av HPSC). (C) På dag 11 er cellene i stamstadiet i bukspyttkjertelen. Skala bar på 100 μm. (D) På dag 12 dannes klynger i mikrobrønnene av 6-brønnsplate etter dissosiasjon av celler i bukspyttkjertelen. (E) På dag 13 er klynger i en 6-brønnsplate med lavt vedlegg. Skala bar på 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klynger hentet fra differensiert Mel1 InsGFP/w hESC reporter linje14 ble evaluert for tilstedeværelse av insulinproduserende celler som uttrykker β-cellemodenhetsmarkører. (A) Immunfluorescensbilder av hopene ble tatt fra kryomoldsnitt (5 μm) ved hjelp av konfokalmikroskopi av spinnskive, som viste overvekt av insulinproduserende celler (ca. 60 %) sammenlignet med glukagonproduserende celler (ca. 15 %) (n=9 klynger, ca. 18 000 celler, SEM). (B) Immunfluorescensbilder av klyngene ble tatt fra kryomoldsnitt (5 μm) ved hjelp av spinnende disk konfokalmikroskopi, som viste overvekt av insulinproduserende celler som samtidig uttrykker bukspyttkjertelen β-cellemarkørene Nkx6.1 (n = 9 klynger, ca. 18 000 celler). (C) ImageJ-celletellermakro, spesielt utviklet for immunfarging av markører, ble brukt til å bestemme prosentandelen insulinpositive, glukagonpositive og β-cellemarkører Nkx6.1 positive celler og β-cellemarkører Pdx1 positive celler. (D) Den glukosestimulerte insulinsekresjonen av Mel1 InsGFP/w hESC-deriverte klynger ble evaluert, som viste en økning på 100 ganger som respons på høy glukosestimulering (16,7 mM glukose) i de differensierte klyngene (n = 9, SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammendrag av mediesammensetning for rettet differensiering. Denne tabellen gir et sammendrag av mediesammensetningen som brukes for hver dag/stadium av rettet differensiering på toppen av stamcellematrise og medium, sammen med glukosestimulert insulinsekresjonsbuffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vellykkede differensieringen av hPSCs i bukspyttkjertelen β-celler avhenger av å optimalisere alle aspekter av rutinemessig dyrking og passasje av de valgte hPSCene. Dette inkluderer å sikre at cellelinjen har en normal karyotype, er negativ for mykoplasmainfeksjon, og er fri for plasmid- eller virale vektorgenomer. Videre, når du bruker hiPSCs, er det viktig å unngå å bruke den tidligste passasjen som fortsatt gjennomgår omprogrammering, for piloteksperimenter. Disse eksperimentene bør utføres i liten skala for å identifisere hPSC-linjen med det beste differensieringspotensialet og det optimale antall passasjer.
Andre parametere som kan påvirke differensieringseffektiviteten inkluderer kvaliteten på stamcellemediet som brukes, beleggets tetthet og antall passeringer10,12. Denne protokollen er optimalisert for å maksimere effektiviteten av differensiering ved å sikre at alle relevante parametere er optimalisert10.
Differensieringsmedier med spesifikke formuleringer brukes på hvert trinn for å støtte differensieringen av hPSCs i β-celler. Activin A og en Wnt-agonist brukes i differensieringsmediet for å initiere overgangen til definitive endodermceller. Under det primitive tarmrørstadiet blir KGF tilsatt mediet for å fremme ytterligere differensiering i β-celler15, og denne inkluderingen av KGF opprettholdes fra dag 6 til 8, forskjellig fra den opprinnelige protokollen av Sui, Egli, et al.10. Under stamstadiet i bukspyttkjertelen optimaliseres den spesifikke mediesammensetningen for å forbedre ekspresjonen av Pdx1-transkripsjonsfaktoren. Dette oppnås ved å bruke en høy konsentrasjon av retinsyre (RA), KGF og LDN193189, som hemmer benmorfogenetisk protein (BMP) vei8. Etter hvert som differensieringen utvikler seg til det endokrine stadiet, blir kulturmediet modifisert for å nedregulere Notch-signalering. Dette oppnås ved å inkorporere XXI, en γ-sekretasehemmer, sammen med T3 (skjoldbruskhormon), RA og RepSox, en hemmer av Activin / BMP / TGF-β-banen8. Denne spesifikke kombinasjonen av forbindelser brukes til å fremme differensiering av bukspyttkjertelprogenitorer til endokrine progenitorer. Til slutt, for å optimalisere den direkte differensieringsprosessen, blir aphidicolin (APH) introdusert under differensieringen fra bukspyttkjertelprogenitorer til endokrine progenitorer. Denne tilføyelsen av APH har som mål å ytterligere forbedre β-celle differensiering, og det representerer en tydelig modifikasjon fra den opprinnelige protokollen foreslått av Sui, Egli, et al.10,11.
Under differensieringsprosessen er det avgjørende å overvåke celletetthet og forhindre overkonfluens, da dette kan hindre riktig differensiering. Kulturer med høy tetthet kan opprettholde høyt Oct4-uttrykk, noe som hemmer differensiering til definitiv endoderm. Fjerning av ROCK-hemmeren under det første vasketrinnet er avgjørende for å initiere differensiering og la den pluripotente tilstanden til hPSC endres. Ved å bruke en fluorescensmarkør, som Mel1 INS-GFP med en GFP integrert i insulinlokuset, letter vurderingen av differensieringsfremgang ved bukspyttkjertelprogenitor- og β-cellestadiene, og hjelper nedstrømseksperimenter14.
Den nåværende protokollen for å differensiere humane pluripotente stamceller i bukspyttkjertelen β-lignende celler har vist variabilitet i effektivitet mellom forskjellige hPSC-linjer10. I tillegg viser de resulterende β-lignende cellene funksjonell umodenhet sammenlignet med humane bukspyttkjerteløyer, og viser lavere insulinsekresjon per celle. For å adressere denne begrensningen ytterligere, kan in vivo modning av β-lignende celler oppnås ved transplantasjon av øyorganoider i dyremodeller i sluttfasen av differensiering 6,7.
Til tross for disse begrensningene har differensiering av hPSCs i bukspyttkjertel β-celler betydelig potensial med hensyn til eksisterende metoder 8,9,10. Denne teknikken gjør det mulig å produsere et stort antall β-cellelignende celler som reagerer på glukose og uttrykker β-cellemarkører (Pdx1 og Nkx6.1, se figur 2). Dette gjøres uten de etiske, tekniske og kildemessige begrensningene knyttet til bruk av menneskelige bukspyttkjerteløyer. I tillegg har denne teknikken potensial til å bli brukt på personlig medisin, da pasientspesifikke β-celler kan genereres for narkotikatesting og sykdomsmodellering 4,6,7. Teknikken kan også ha fremtidige anvendelser i behandling av diabetes som involverer tap eller dysfunksjon av bukspyttkjertelen β-celler 4,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ines Cherkaoui ble støttet av et Diabetes UK-studentskap (BDA 18/0005934) til GAR, som også takker Wellcome Trust for en Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC for et programstipend (MR/R022259/1), Diabetes UK for prosjektstipend (BDA16/0005485), CRCHUM for oppstartsmidler, Innovation Canada for en John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) for prosjektstipend, og CIHR, JDRF for teamstipend (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion og Dr. Harry Leitch for deres hjelp med menneskelig hiPSCs generasjon og kultur, NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid anlegg, London.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
| Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
| DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
| DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Ethanol | VWR | 20821.33 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
| Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
| Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
| Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
References
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
- Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
- Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
- Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).
- Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
- Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
- Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).
