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मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से कार्यात्मक अग्नाशयी इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65530
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 1,4,5
1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

Summary

यह लेख कोशिकाओं की तरह β सेल के निर्देशित भेदभाव और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हम इंसुलिन उत्पादक अग्नाशय कोशिकाओं को उत्पन्न करने से पहले मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए इष्टतम संस्कृति की स्थिति और मार्ग का वर्णन करते हैं। छह-चरण भेदभाव निश्चित एंडोडर्म गठन से कार्यात्मक β-सेल जैसी कोशिकाओं तक ग्लूकोज के जवाब में इंसुलिन को स्रावित करने वाली कोशिकाओं की तरह आगे बढ़ता है।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) किसी भी प्रकार की कोशिका में अंतर कर सकते हैं, जिससे वे मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट वैकल्पिक स्रोत बन जाते हैं। एचपीएससी या तो भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) हो सकते हैं जो ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त होते हैं या प्रेरित प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं (एचआईपीएससी) एक रिप्रोग्रामिंग प्रक्रिया का उपयोग करके सीधे दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं। यहाँ एक वीडियो आधारित प्रोटोकॉल एचपीएससी के लिए इष्टतम संस्कृति और पारित होने की स्थिति की रूपरेखा प्रस्तुत किया है, उनके भेदभाव और इंसुलिन उत्पादक अग्नाशय कोशिकाओं के बाद पीढ़ी से पहले. यह पद्धति β-सेल निर्देशित भेदभाव के लिए छह-चरण की प्रक्रिया का अनुसरण करती है, जिसमें एचपीएससी निश्चित एंडोडर्म (डीई), आदिम आंत ट्यूब, पश्च अग्रगुट भाग्य, अग्नाशयी पूर्वज, अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज और अंततः अग्नाशयी β-कोशिकाओं में अंतर करते हैं। यह उल्लेखनीय है कि इस भेदभाव पद्धति को मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं को उत्पन्न करने में 27 दिनों की अवधि लगती है। इंसुलिन स्राव की क्षमता का मूल्यांकन दो प्रयोगों के माध्यम से किया गया था, जिसमें इम्यूनोस्टेनिंग और ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव शामिल थे।

Introduction

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) में विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर करने की अनूठी क्षमता होती है, जिससे वे मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बनजाते हैं। इन एचपीएससी को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी), ब्लास्टोसिस्ट2 से व्युत्पन्न, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं (एचआईपीएससी), सीधे दैहिक कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करके उत्पन्नहोती हैं 3. β कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए तकनीक के विकास, मौलिक अनुसंधान और नैदानिक अभ्यास 1,4 दोनों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है. मधुमेह मेलिटस दुनिया भर में >400 मिलियन लोगों को प्रभावित करने वाली एक पुरानी बीमारी है और अग्नाशय की β-कोशिकाओं की खराबी या हानि के कारण ग्लाइसेमिया को विनियमित करने में शरीर की अक्षमता के परिणामस्वरूपहोती है। प्रत्यारोपण के लिए अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता मधुमेह 2,4,6,7 के लिए सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के विकास में बाधा उत्पन्न हुई है. एचपीएससी का उपयोग करके ग्लूकोज-उत्तरदायी इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता मानव आइलेट विकास और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सेलुलर मॉडल के रूप में कार्य करती है। इसका उपयोग नियंत्रित वातावरण में मधुमेह के उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय उम्मीदवारों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, एचपीएससी में अग्नाशयी आइलेट कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता होती है जो आनुवंशिक रूप से रोगी के समान होती हैं, प्रत्यारोपण 2,4,7के बाद प्रतिरक्षा अस्वीकृति के जोखिम को कम करती हैं।

हाल के वर्षों में, एचपीएससी संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल के शोधन में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशयीβ-कोशिकाओं 8,9उत्पन्न करने की दिशा में भेदभाव प्रक्रिया की दक्षता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि हुई है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल अग्नाशय β कोशिकाओं के निर्देशित भेदभाव के आवश्यक चरणों की रूपरेखा. इसमें अलग-अलग समय बिंदुओं पर विशिष्ट सेल सिग्नलिंग मार्गों का विनियमन शामिल है। यह अग्नाशयी β-कोशिकाओं में एचपीएससी की पीढ़ी के लिए सुई एल एट अल.10 (2018) द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है। प्रोटोकॉल को सुई एल एट अल.11 (2021) के हालिया अपडेट में समायोजित किया गया था, क्योंकि नवीनतम शोध β-कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ाने के लिए एफिडिकोलिन (एपीएच) उपचार का उपयोग करने के महत्व पर जोर देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रक्रिया के बाद के चरणों के दौरान माध्यम के लिए APH के अलावा भी शामिल है. इसके अलावा, प्रारंभिक प्रोटोकॉल की तुलना में भेदभाव के प्रारंभिक चरणों के दौरान माध्यम की संरचना में संशोधन किए गए हैं। एक उल्लेखनीय परिवर्तन दिन 6 पर केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ) को जोड़ना और दिन 8 तक जारी रखना है। केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ) को दिन 6 से दिन 8 तक पेश किया जाता है, जो प्रारंभिक प्रोटोकॉल10 से थोड़ा अलग होता है, जहां केजीएफ को चरण 4 माध्यम में शामिल नहीं किया गया था।

β-सेल जैसी कोशिकाओं की पीढ़ी में पहला और आवश्यक कदम एचपीएससी का निश्चित एंडोडर्म (डीई) में निर्देशित भेदभाव है, एक आदिम रोगाणु परत जो अग्न्याशय सहित विभिन्न अंगों के उपकला अस्तर को जन्म देती है। डीई के गठन के बाद, कोशिकाएं आदिम आंत ट्यूब में भेदभाव से गुजरती हैं, जिसके बाद पीछे के अग्रदूत भाग्य के विनिर्देश होते हैं। पीछे का अग्रभाग तब अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं में विकसित होता है, जिसमें अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन कोशिकाओं सहित अग्न्याशय के सभी प्रकार के सेल में अंतर करने की क्षमता होती है। प्रक्रिया में बाद के चरण में अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज शामिल होते हैं जो लैंगरहैंस के टापुओं में पाए जाने वाले हार्मोन-स्रावित कोशिकाओं को जन्म देते हैं। अंत में, भेदभाव प्रक्रिया कोशिकाओं 9,10 की तरह पूरी तरह कार्यात्मक अग्नाशय β सेल उत्पादन के द्वारा अपने अंतिम चरण तक पहुँचता है. यह इस प्रक्रिया जटिल है कि ध्यान दें और अक्सर इस तरह के विशिष्ट विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स घटकों, दक्षता और भेदभाव 9,10 की विशिष्टता में सुधार करने के लिए के रूप में संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन की आवश्यकता है महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, इन विट्रो में एचपीएससी से कार्यात्मक β-सेल जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करना अभी भी एक बड़ी चुनौती है। चल रहे अनुसंधान भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार लाने और परिपक्वता और जिसके परिणामस्वरूपβ कोशिकाओं 9 के समारोह को बढ़ाने पर केंद्रित है.

इस प्रोटोकॉल में, संस्कृति और एचपीएससी के पारित होने के दौरान कोमल सेल पृथक्करण का उपयोग सेल व्यवहार्यता और प्लुरिपोटेंसी को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, अग्नाशयी β कोशिकाओं में भेदभाव की दक्षता में काफी सुधार करता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक चरण-विशिष्ट माध्यम को सुई एल एट अल 10 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के बाद सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया है ताकि मानव आइलेट से मिलते-जुलते समूहों में इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं की उच्च उपज को बढ़ावा दिया जा सके।

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Protocol

भेदभाव शुरू करने से पहले, प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए आइलेट जैसे ऑर्गेनोइड की आवश्यक संख्या निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। 6 अच्छी प्लेट में, 80% से अधिक संगम वाले एक कुएं में आमतौर पर 2-2.3 मिलियन एचपीएससी होते हैं। जबकि एचपीएससी लाइनों और भेदभाव दक्षता में भिन्नता के कारण एक सटीक भविष्यवाणी चुनौतीपूर्ण है, एक मोटा अनुमान प्रारंभिक कुओं की संख्या का 1.5 गुना है। एक प्रभावी ढंग से निर्देशित भेदभाव आमतौर पर छह-अच्छी प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 1.6 से 2 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करता है, जिसमें विशेष रूप से इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं के बजाय समूहों के भीतर सभी कोशिकाएं शामिल होती हैं। 50 माइक्रोन क्लस्टर के लिए, इसमें लगभग 10,000 कोशिकाएं हो सकती हैं। तालिका 1 ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव बफर के साथ-साथ स्टेम सेल मैट्रिक्स और माध्यम के शीर्ष पर निर्देशित भेदभाव के प्रत्येक दिन/चरण के लिए उपयोग की जाने वाली मीडिया संरचना का सारांश प्रदान करता है।

1. 6 अच्छी तरह से प्लेटों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल पूर्व भेदभाव को पार करना

नोट: β-सेल जैसी कोशिकाओं में अंतर करने से पहले मानव स्टेम कोशिकाओं का उचित पासिंग प्रयोगात्मक प्रक्रिया को स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। गलत मार्ग कमजोर पड़ने या लगाव सेल नंबर भेदभाव दक्षता और निष्ठा समझौता कर सकते हैं.

  1. स्टेम सेल संस्कृति माध्यम, कोटिंग, और पृथक्करण समाधान तैयार करें (जैसा कि तालिका 1में निर्दिष्ट है)।
  2. 1-2 घंटे गुजर से पहले, ठंड कोटिंग समाधान (अच्छी तरह से 1 एमएल) के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली कोट और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेते हैं.
  3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 -25 डिग्री सेल्सियस) पर स्टेम सेल संस्कृति माध्यम का एक विभाज्य गर्म.
  4. स्टेम सेल माध्यम को एस्पिरेट करें और कैल्शियम / मैग्नीशियम मुक्त डी-पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
  5. 1.4 कदम दोहराएँ. दो बार।
    नोट: डी-पीबीएस कोशिकाओं को धोने और पिछले माध्यम और यौगिकों को हटाने के लिए जोड़ा जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि धोने के चरणों के लिए कोई विशिष्ट समय सीमा की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि डी-पीबीएस के संपर्क में एचपीएससी को नुकसान नहीं पहुंचाता है, सेल टूटना या परासरण के कारण संकोचन को रोकता है।
  6. एस्पिरेट डी-पीबीएस, प्रत्येक अच्छी तरह से पृथक्करण समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें, और इसे कमरे के तापमान (15 - 25 डिग्री सेल्सियस) पर 2-5 मिनट के लिए बैठने दें।
  7. जबकि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, नई 6 अच्छी तरह से थाली के कोटिंग समाधान महाप्राण और प्रत्येक अच्छी तरह से कैल्शियम / मैग्नीशियम मुक्त डी पीबीएस के 1-2 एमएल जोड़ें.
  8. नियमित रूप से उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत पृथक्करण प्रक्रिया की जांच करें।
  9. पृथक्करण समाधान को महाप्राण करें जब 80 - 90% कोशिकाएं गोल हो जाती हैं लेकिन अभी भी पालन करती हैं।
  10. स्टेम सेल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें जिसमें 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक है।
  11. 1,000 माइक्रोन बाँझ फ़िल्टर्ड विंदुक सुझावों और एक P1000 विंदुक का उपयोग कर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं लीजिए.
  12. धीरे-धीरे कालोनियों को तोड़ने के लिए 1,000 माइक्रोन बाँझ विंदुक फ़िल्टर्ड टिप के साथ विंदुक में सेल निलंबन ऊपर और नीचे triturate, लेकिन 10 बार से अधिक नहीं है.
  13. शेष एचपीएससी को अलग करने में मदद करने के लिए रॉक अवरोधक युक्त स्टेम सेल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को उसी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (1.10) में स्थानांतरित करें।
  14. नई लेपित प्लेट से डी-पीबीएस को महाप्राण करें और तुरंत 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से सेल निलंबन जोड़ें। इष्टतम सेल विकास सुनिश्चित करने के लिए, बीज 2 x 105- 1 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से जब एक 6 अच्छी तरह से थाली (10 में 1 से 1 50 विभाजन में) का उपयोग कर.
    नोट: वॉल्यूम गणना के लिए, 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में रॉक अवरोधक के साथ स्टेम सेल माध्यम के 2 एमएल होना चाहिए।
  15. प्लेट को जल्दी से आगे-पीछे करें, और साइड से साइड 5 - 10 बार।
  16. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर रखें।
  17. अगले दिन रॉक अवरोधक के बिना ताजा स्टेम सेल माध्यम के साथ बदलें, और फिर हर 2 दिनों तक एचपीएससी का संगम 80 - 95% तक पहुंच गया है।

2. मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न β-कोशिकाओं ने भेदभाव निर्देशित किया

नोट: एचपीएससी का उपयोग अग्नाशयी β कोशिकाओं में प्रत्यक्ष भेदभाव प्रक्रिया के लिए किया जा सकता है जब 80-95% संगम प्राप्त होता है।

  1. दिन -1: कोशिकाओं का पासिंग: भेदभाव का दिन -1:
    1. पारित होने से पहले 1-2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस में ठंड कोटिंग समाधान के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट कोट, 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
    2. 1.1 से 1.10 चरणों का पालन करें और कोशिकाओं की गिनती के लिए आगे बढ़ें।
    3. सेल मिश्रण के 10 माइक्रोन लोड करें, ट्रिपैन ब्लू की बराबर मात्रा जोड़ें, और धीरे से मिलाएं।
    4. सेल एकाग्रता की गणना. प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 2 एमएल के साथ लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक युक्त स्टेम सेल माध्यम के 0.8 × 106 कोशिकाओं / एमएल का उपयोग करें।
    5. प्लेट को जल्दी से आगे-पीछे, अगल-बगल तीन बार घुमाएँ।
    6. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। जल्दी से प्लेट को आगे-पीछे करें, और अगल-बगल फिर से 10 बार ले जाएं। फिर 4 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
      नोट: सुनिश्चित करें कि अधिकतम लगाव और कोशिकाओं का भी वितरण इनक्यूबेटर में एक बार रखी गई प्लेट को स्थानांतरित करके कोशिकाओं को परेशान नहीं करता है। इनक्यूबेटर को बहुत सावधानी से खोलें और बंद करें।
    7. बेसल माध्यम की बोतल को दिन 0 से 4 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि इसे रात भर पिघलाया जा सके।
  2. दिन 0
    नोट: एचपीएससी 80 - 95% संगम होना चाहिए, उस संगम के तहत निश्चित एंडोडर्म के लिए भेदभाव प्रक्रिया शुरू न करें।
    1. बर्फ पर, दिन 0 से 4 के लिए बेसल माध्यम दोनों को पिघलाएं और पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. दो शंक्वाकार ट्यूबों में केवल आवश्यक मात्रा 1 दिन (6 अच्छी तरह से थाली के 2 एमएल प्रति कुएं) पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार करें, और एक अलग ट्यूब में, दिन 2.5 से 4 (2 x 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से थाली) के लिए मात्रा दोगुनी करें। दिन 2.5 से दिन 4 मध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. दिन 1 मध्यम की आवश्यक मात्रा का एक विभाज्य गर्म करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मध्यम 1 धो लें।
    4. स्टेम सेल माध्यम महाप्राण और धोने के माध्यम के 2 एमएल जोड़ें 1.
      नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले धोने के माध्यम में प्रत्येक दिन/चरण के लिए विशिष्ट बेसल माध्यम होता है, जो 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक होता है। प्रत्यक्ष भेदभाव प्रोटोकॉल के धोने के चरणों में केवल वर्णित प्रक्रिया 2.2.4 के बाद नामित वाशिंग माध्यम ("वाशिंग माध्यम 1 या 2", सामग्री की तालिका) और बाद की आकांक्षा के अलावा शामिल है। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि इन धोने के चरणों के लिए कोई विशिष्ट समय सीमा नहीं बताई गई है।
    5. महाप्राण धोने का माध्यम 1 और तुरंत कुएं के किनारे पर दिन 1 मध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
    6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 1
    1. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में दिन 2.5 से 4 मध्यम की आवश्यक मात्रा का पूर्व-गर्म।
    2. दिन 1 मध्यम महाप्राण और तुरंत अच्छी तरह से के पक्ष में दिन 2.5 से 4 मध्यम के 2 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को न धोएं।
    3. प्लेट को 36 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर वापस रखें।
  4. दिन 2.5 से 4
    1. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में दिन 2.5 से 4 मध्यम की शेष मात्रा का एक विभाज्य पूर्व गर्म.
    2. मध्यम को महाप्राण करें और तुरंत अच्छी तरह से तैयार दिनों के 2.5 से 4 मध्यम को अच्छी तरह से जोड़ें।
    3. प्लेट को 36 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर वापस रखें।
  5. दिन 4
    नोट: इस स्तर पर, निश्चित एंडोडर्म मार्करों की अभिव्यक्ति अपने अधिकतम पर है, और कोशिकाएं आदिम आंत ट्यूब भेदभाव शुरू कर सकती हैं।
    1. दिन 4 आदिम आंत चरण मध्यम (छह अच्छी तरह से प्लेट के अच्छी तरह से 2 एमएल) की आवश्यक मात्रा का एक विभाज्य तैयार करें और इसे 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म करें।
    2. एस्पिरेट दिन 2.5 से 4 मध्यम और धोने के माध्यम के 2 एमएल जोड़ें 1.
    3. धोने के माध्यम 1 महाप्राण, और तुरंत अच्छी तरह से के पक्ष में दिन 4 आदिम आंत चरण के 2 एमएल जोड़ें.
    4. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर वापस रखें।
  6. दिन 6 से 8
    नोट: इस स्तर पर, कोशिकाएं पीछे के अग्रगुट भाग्य पर आगे भेदभाव शुरू करती हैं।
    1. दिन 6 से 8 पीछे के अग्रगुट मध्यम (6 अच्छी तरह से प्लेट के 2 एमएल प्रति कुआं) की आवश्यक मात्रा तैयार करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर मध्यम गर्म करें।
    2. दिन 4 मध्यम महाप्राण और तुरंत अच्छी तरह से के पक्ष में दिन 6 से 8 पीछे foregut माध्यम के 2 एमएल जोड़ें.
    3. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर रखें जिसमें 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 हो।
  7. दिन 8 से 12
    नोट: कोशिकाएं अग्नाशयी पूर्वज के भेदभाव से गुजरने के लिए तैयार हैं।
    1. दिन 8 से 12 अग्नाशयी पूर्वज चरण मध्यम (6 अच्छी तरह से प्लेट के 2 एमएल प्रति कुआं) की आवश्यक मात्रा तैयार करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर मध्यम गर्म करें।
    2. एस्पिरेट डेज़ 6 से 8 मध्यम और तुरंत कुएं के किनारे पर 6 से 8 पोस्टीरियर फोरगट माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
    3. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें जिसमें 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 हो।
  8. दिन 12: क्लस्टरिंग चरण निष्पादित करना
    नोट: इस स्तर पर, कोशिकाएं एक घने मोनोलेयर बनाती हैं, और क्लस्टर बनाने के लिए 3 डी सेल संस्कृति में परिवर्तित हो जाएंगी। यह कदम भेदभाव के लिए देशी मानव आइलेट्स के लिए β जैसी कोशिकाओं की संरचनात्मक समानता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन सेलुलर और क्लस्टर स्तर11(चित्रा 1)दोनों पर उनकी कार्यात्मक समानता में भी सुधार करता है।
    1. कमरे के तापमान पर 2 एमएल विरोधी पालन रिंसिंग समाधान के साथ 400 माइक्रोन (जैसा कि सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट है: मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न β-कोशिकाओं निर्देशित भेदभाव, दिन 12) युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेट का इलाज करें।
      नोट: माइक्रोवेल कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे संलग्न करने से रोकता है और 3 डी समूहों के यांत्रिक गठन की सुविधा प्रदान करता है।
    2. 5 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र प्लेट।
    3. एक औंधा खुर्दबीन के तहत किसी भी बुलबुले की उपस्थिति के लिए जाँच करें. यदि कोई बुलबुले नहीं देखे जाते हैं, तो विरोधी पालन रिंसिंग समाधान को एस्पिरेट करें और तुरंत धोने के माध्यम 2 (सामग्री की तालिका) के 2 एमएल जोड़ें।
    4. 1.8.3 कदम दोहराएँ. दो बार।
    5. क्लस्टर माध्यम की आवश्यक मात्रा तैयार करें और इसे 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 -25 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म करें। सुनिश्चित करें कि एक 6 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं क्लस्टर माध्यम के 4 एमएल के साथ 400 माइक्रोन माइक्रोवेल्स 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में जाना.
    6. अग्नाशयी पूर्वज माध्यम को महाप्राण करें और पृथक्करण बफर (अच्छी तरह से प्रति 0.5 एमएल) जोड़ें।
    7. 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 डिग्री सेल्सियस - 25 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं। नियमित रूप से एक उल्टे माइक्रोस्कोप और एस्पिरेट पृथक्करण बफर के तहत हदबंदी प्रक्रिया की जांच करें जब अधिकांश कोशिकाएं गोल हो जाती हैं लेकिन अभी भी पालन करती हैं।
    8. पृथक्करण बफर को महाप्राण करें और तुरंत प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल क्लस्टर माध्यम जोड़ें।
    9. धीरे एक P1000 विंदुक और 1,000 μL फिल्टर सुझावों का उपयोग कर छह बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग करना.
    10. कोशिकाओं और क्लस्टर मध्यम मिश्रण को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. सभी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए क्लस्टर माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    12. क्लस्टर माध्यम को आवश्यक कुल मात्रा में जोड़ें ताकि माइक्रोवेल्स प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिश्रण क्लस्टर मध्यम/कोशिकाओं का 4 एमएल हो।
    13. माइक्रोवेल्स 6-वेल प्लेट से धोने के माध्यम 2 को एस्पिरेट करें और सेल निलंबन को स्थानांतरित करें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. दिन 13: कोशिकाओं को पोस्ट-क्लस्टरिंग संभालना और दिन 13 से उनके मीडिया को बदलना।
    नोट: क्लस्टर अत्यधिक संवेदनशील होते हैं और आने वाले दिनों में उनकी अखंडता और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। इसलिए, दिन 12 के बाद पोस्ट-क्लस्टरिंग अवधि के दौरान समूहों की बारीकी से निगरानी करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया में सफल परिणामों को बढ़ावा देने के लिए नियमित मूल्यांकन और समायोजन आवश्यक हैं।
    1. दिन 13 मध्यम (6 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से प्रति 2 एमएल) की आवश्यक मात्रा तैयार करें, और दिन 15 से 20 अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज माध्यम के लिए 50 एमएल की एक अलग शंक्वाकार ट्यूब में।
    2. धीरे-धीरे माइक्रोवेल्स 6 अच्छी तरह से प्लेट से एक p1000 विंदुक और 1,000 माइक्रोन फ़िल्टर्ड युक्तियों का उपयोग करके 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में क्लस्टर इकट्ठा करें।
    3. शेष समूहों को इकट्ठा करने और ट्यूब में समूहों को स्थानांतरित करने के लिए दिन 13 माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूब के नीचे गुरुत्वाकर्षण के तहत स्वाभाविक रूप से सेट करते हैं।
    5. सेल समूहों को परेशान किए बिना ट्यूब से जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें। विंदुक सुझावों को स्पर्श नहीं करना चाहिए और न ही समूहों लेकिन सतह पर तैरनेवाला ही महाप्राण चाहिए.
    6. निम्नलिखित के अनुसार दिन 13 मध्यम की आवश्यक मात्रा जोड़ें: माइक्रोवेल्स का 1 कुआं 6 अच्छी तरह से प्लेट कम लगाव 6 अच्छी तरह से प्लेट (अच्छी तरह से प्रति मीडिया के 2 एमएल) के तीन कुओं में जाता है।
    7. धीरे ऊपर और नीचे विंदुक, महाप्राण समूहों से परहेज.
    8. निलंबन को बहुत कम-पक्षपाती 6 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
    9. प्लेट को जल्दी से आगे-पीछे, अगल-बगल छह बार घुमाएं।
    10. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    11. इस खंड 2.9 में वर्णित भेदभाव के अंत तक अगले सभी चरणों में मध्यम परिवर्तन करें।
  10. दिन 15 से 20
    1. अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज चरण माध्यम में बदलें हर 48 घंटे तक भेदभाव के दिन 21 तक सेल निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करके और दिन 13 के लिए 2.9.10 से 2.9.10 चरणों का पालन करें।
  11. दिन 21 से 27
    नोट: इस स्तर पर, क्लस्टर अग्नाशयी β-कोशिकाओं पर अंतर करते हैं।
    1. अग्नाशय β सेल चरण माध्यम तैयार करें.
    2. 15 से 21 दिनों के लिए वर्णित हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
      नोट: दिन 25 के बाद, आइलेट की तरह organoids वे पूरी तरह कार्यात्मक हैं पुष्टि करने के लिए विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं.

3. अग्नाशयी β-सेल समूहों का धुंधला हो जाना

नोट: भेदभाव के बाद समूहों के कार्यात्मक मूल्यांकन का अध्ययन करने के लिए यह चरण करें

  1. भेदभाव के अंत में एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पांच से दस समूहों को इकट्ठा करें।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए के 200 माइक्रोन के साथ सेल समूहों को ठीक करें।
  3. समूहों में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और समूहों को परेशान किए बिना 1,000 माइक्रोन विंदुक टिप के साथ पीबीएस को हटा दें।
  4. समूहों में 30% सुक्रोज के 200 माइक्रोन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  5. क्लस्टर को क्रायोमोल्ड में स्थानांतरित करें, अतिरिक्त सुक्रोज को हटा दें, ओसीटी माध्यम की एक बूंद जोड़ें, और समूहों को ओसीटी माध्यम के साथ मिलाएं।
  6. क्रायोमोल्ड को सूखी बर्फ पर फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. माइक्रोटोम/या क्रायोस्टेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जमे हुए ब्लॉक से 5 माइक्रोन वर्गों को काटें।
  8. धुंधला होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर स्टोर स्लाइड।
  9. धुंधला हो जाना के दिन, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर स्लाइड ले.
  10. क्रायोमोल्ड के वर्गों के आसपास की बर्फ को सावधानी से हटा दें।
  11. एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ स्लाइड पर सर्कल सेल क्लस्टर।
  12. 15 मिनट के लिए पीबीएस युक्त एक स्लाइड धुंधला जार में पुनर्जलीकरण स्लाइड.
  13. स्लाइड धुंधला जार में ठंडा मेथनॉल जोड़ें और 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड के साथ जार रखें।
  14. एक पीबीएस जार में स्लाइड विसर्जित करें।
  15. दोहराएँ कदम 3.14 तीन बार.
    नोट: निम्नलिखित सभी धुलाई चरणों के लिए इस विधि का उपयोग करें।
  16. स्लाइड से पीबीएस निकालें और पीबीएस-टी में 2-5% बीएसए के साथ अवरुद्ध समाधान के 100 माइक्रोन के साथ तुरंत कवर करें।
  17. प्रत्येक स्लाइड में अवरोधन समाधान जोड़ें और पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें।
  18. कमरे के तापमान (15 -25 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  19. अभिकर्मकों और समाधान अनुभाग में प्रदान किए गए अनुपात का उपयोग करके अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
  20. स्लाइड्स से ब्लॉकिंग समाधान निकालें।
  21. स्लाइड को सूखने से रोकने के लिए तुरंत पतला एंटीबॉडी और कवर स्लाइड को पैराफिल्म के साथ जोड़ें।
  22. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  23. अगले दिन पीबीएस-टी के साथ स्लाइड 3 - 5 बार धो लें।
  24. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी और डीएनए दाग तैयार करें।
  25. स्लाइड्स से अतिरिक्त पीबीएस-टी निकालें।
  26. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी और डीएनए दाग जोड़ें। कमरे के तापमान (15 -25 डिग्री सेल्सियस) पर 45 मिनट के लिए सेते हैं.
  27. पीबीएस-टी के साथ स्लाइड 3 - 5 बार धोएं।
  28. स्लाइड्स से किसी भी तरल निकालें।
  29. प्रत्येक अनुभाग में ऊतक विज्ञान बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
  30. स्लाइड को कांच के कवर से ढक दें।
  31. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग सना हुआ स्लाइड की तस्वीरें ले लो.

4. जीएसआईएस (ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव परख)

  1. तीन अलग-अलग समाधान तैयार करें: कम ग्लूकोज KREBS समाधान, उच्च ग्लूकोज KREBS समाधान, और KCl के साथ कम ग्लूकोज KREBS समाधान।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर सभी समाधान गर्म.
  3. ध्यान से एक 1000 माइक्रोन विंदुक टिप का उपयोग कर समान आकार के आसपास 10 - 15 समूहों का चयन करें और उन्हें समूहों बाहर सुखाने से बचने के लिए विभेदित माध्यम की एक छोटी राशि के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब में हस्तांतरण.
    नोट: क्लस्टर नग्न आंखों को दिखाई देना चाहिए, लेकिन यदि नहीं, तो क्लस्टर का चयन करने और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत विभेदित समूहों वाली प्लेट रखें।
  4. एक ट्यूब रैक पर समूहों और मध्यम के साथ ट्यूब प्लेस और ट्यूब के नीचे करने के लिए समूहों सिंक करने के लिए इंतजार.
  5. धीरे-धीरे एक 200 माइक्रोन विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और कम ग्लूकोज KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कम ग्लूकोज समाधान में आइलेट्स को इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रयोगों में क्लस्टर संख्या और स्थिरता का सटीक मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए, स्थानांतरण के दौरान समाधान में सभी समूहों की उपस्थिति की जांच करना उचित है, क्योंकि वे ट्यूब का पालन करते हैं।
  7. इनक्यूबेटर से ट्यूब निकालें और धीरे-धीरे किसी भी क्लस्टर को एस्पिरेट किए बिना KREBS समाधान के 200 माइक्रोन को एस्पिरेट करें।
  8. कम ग्लूकोज KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. 500 माइक्रोन ट्यूब में कम ग्लूकोज क्रेब्स समाधान के 200 माइक्रोन की मात्रा को एस्पिरेट करें और तुरंत इसे इंसुलिन माप के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अलग-अलग उपचारों के लिए दोहराएं।
  10. समूहों को धोने के लिए, क्लस्टर युक्त ट्यूब में ग्लूकोज के बिना KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। समूहों ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने के लिए अनुमति दें, और ध्यान से समूहों परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
  11. उच्च ग्लूकोज KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. 500 माइक्रोन ट्यूब में उच्च ग्लूकोज केआरईबीएस के 200 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और तुरंत इंसुलिन माप के लिए इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अलग-अलग उपचारों के लिए दोहराएं।
  13. समूहों को धोने के लिए, क्लस्टर युक्त ट्यूब में ग्लूकोज के बिना KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। समूहों ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने के लिए अनुमति दें, और ध्यान से समूहों परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
  14. KCl KREBS समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और अलग उपचार के लिए दोहराएं।
  15. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  16. KCl KREBS समाधान के 200 μL को 500 μL ट्यूब में एस्पिरेट करें और तुरंत इसे इंसुलिन माप के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अन्य उपचारों के लिए दोहराएं।
  17. अल्ट्राप्योर पानी के 50 माइक्रोन जोड़ें और कुल इंसुलिन सामग्री को मापने के लिए आगे बढ़ें।
  18. आइलेट्स और अल्ट्राप्योर पानी के साथ ट्यूब में एसिड इथेनॉल समाधान के 150 माइक्रोन जोड़ें।
  19. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (12 - 15 घंटे) पर नमूने स्टोर करें।
  20. अगले दिन, भंवर प्रत्येक नमूना।
  21. आइलेट ऊतक का पूरा lysis सुनिश्चित करने के लिए 1 एस के लिए 20% बिजली के लिए सेट एक बिजली sonicator के साथ sonication प्रदर्शन.
    नोट:: चरण 4.21 दोहराएँ जब तक कोई शेष क्लस्टर दिखाई नहीं देता।
  22. 10 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर सभी नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला रखें।
  23. नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें, जिसका उपयोग इंसुलिन माप को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल एचपीएससी10 से β जैसी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक अत्यधिक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह प्रक्रिया एक 2 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करती है जो आसानी से स्केलेबल है, विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में इसके उपयोग को सक्षम करती है, जैसे कि भेदभाव सीखना, छोटी परियोजनाएं और प्रयोगशालाएं, और भेदभाव के लिए आईपीएससी लाइन की क्षमता का आकलन करने के लिए पायलट परीक्षण।

ग्लूकोज होमियोस्टेसिस में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आइलेट्स में विभेदित β-कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों को चिह्नित करना आवश्यक है। यह आम तौर पर β सेल मार्करों और इंसुलिन अभिव्यक्ति के लिए immunostaining के रूप में विभिन्न प्रयोगों के माध्यम से प्राप्त किया है, साथ ही ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव (GSIS) परख, जो परीक्षण आइलेट कम और उच्च ग्लूकोज सांद्रता12,13 के जवाब में समारोह है. β-कोशिकाओं में एनकेएक्स 2-2, पीडीएक्स 1, एनकेएक्स 6-1, और न्यूरोडी 1 सहित हस्ताक्षर जीन होते हैं, जो β-सेल पहचान9 को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऊतक वर्गों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की जांच के लिए इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक मूल्यवान हैं। β सेल मार्करों के लिए immunostaining प्रमुख अग्नाशयी वंश मार्करों की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन कर सकते हैं, भेदभाव प्रक्रिया की निष्ठा औरविशिष्ट अनुप्रयोगों 9,12 के लिए अनुकूलन में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

इस अध्ययन में, Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC रिपोर्टर लाइन का उपयोग विभिन्न सेल प्रकारों वाले समूहों को अलग करने के लिए किया गया था, जिसमें मानव देशी आइलेट्स में पाए जाने वाले β-सेल शामिल हैं। इस पत्र में चित्रा 2 भेदभाव प्रक्रिया की दक्षता और सटीकता के बारे में महत्वपूर्ण निष्कर्ष प्रदान करता है। परिणाम अग्नाशयी वंश के भीतर इंसुलिन-व्यक्त कोशिकाओं के एक उच्च संवर्धन को प्रदर्शित करते हैं, और ये कोशिकाएं ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव प्रदर्शित करती हैं। यह भेदभाव प्रक्रिया के माध्यम से कार्यात्मक β जैसी कोशिकाओं की सफल पीढ़ी को इंगित करता है।

विभेदित कोशिकाओं को कम और उच्च ग्लूकोज सांद्रता के साथ उत्तेजित किया गया था, और जीएसआईएस परिणामों से पता चला है कि मेल 1 कोशिकाओं से प्राप्त क्लस्टर ग्लूकोज के लिए उनके इंसुलिन स्राव प्रतिक्रिया में आइलेट्स के समान कार्य करते हैं। मेल 1-व्युत्पन्न क्लस्टर कम ग्लूकोज सांद्रता की तुलना में उच्च ग्लूकोज सांद्रता के जवाब में 100 गुना अधिक इंसुलिन का स्राव करने के लिए पाए गए थे। विशेष रूप से, इंसुलिन सामग्री 3.3 मिमी कम ग्लूकोज पर 0.003 ± 0.002% और 16.7 मिमी उच्च ग्लूकोज पर 0.236 ± 0.197% थी।

Mel1 INS-GFP hESCs से प्राप्त समूहों को GSIS परख के अलावा, उनकी संरचना और कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए आगे के विश्लेषण के अधीन किया गया था। विशेष रूप से, β-सेल हस्ताक्षर जीन की अभिव्यक्ति और समूहों के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों की उपस्थिति की जांच की गई। परिणामों से पता चला है कि इस प्रक्रिया से प्राप्त अग्नाशयी वंश इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं में अत्यधिक समृद्ध है, जो β-सेल जैसी कोशिकाओं में एचईएससी की भेदभाव प्रक्रिया में उच्च स्तर की सफलता का संकेत देता है। इसके अलावा, β-सेल पहचान की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण एनकेएक्स 6.1 और पीडीएक्स 1 जैसे हस्ताक्षर जीन की अभिव्यक्ति की जांच की गई। विश्लेषण से पता चला कि लगभग 25% और 40% कोशिकाओं ने क्रमशः Nkx6.1 और Pdx1 व्यक्त किया, अतिरिक्त सबूत प्रदान करते हुए कि समूहों में विभेदित β जैसी कोशिकाएं थीं (मतलब Nkx6.1+ कोशिकाएं प्रति क्लस्टर 24.9% ± 6.2%, n = 9 क्लस्टर, Pdx1 + कोशिकाएं 40.2% ± 6.2%, n = 9, SEM, चित्रा 2)। इसके अतिरिक्त, समूहों में ग्लूकागन-पॉजिटिव कोशिकाओं जैसे अन्य सेल प्रकार होते हैं, जो कुल सेल आबादी का लगभग 15% हिस्सा होते हैं। ये कोशिकाएं आमतौर पर लैंगरहैंस के देशी आइलेट्स की अल्फा कोशिकाओं में पाई जाती हैं, यह सुझाव देते हुए कि क्लस्टर सेल संरचना के मामले में मानव आइलेट्स से निकटता से मिलते जुलते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: अग्नाशयी β कोशिकाओं की ओर एचपीएससी का भेदभाव। (ए) इन विट्रो निर्देशित एचपीएससी के अग्नाशयी β-कोशिकाओं में भेदभाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, जिसमें छह क्रमिक चरण शामिल हैं: निश्चित एंडोडर्म प्रेरण, आदिम आंत ट्यूब गठन, पीछे के अग्रदूत भाग्य विनिर्देश, अग्नाशयी पूर्वज पीढ़ी, अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज गठन, और अंततः, अग्नाशयी β-सेल भेदभाव। अग्नाशयी β-सेल भेदभाव विशिष्ट समय पर विशिष्ट सेल सिग्नलिंग मार्गों के नियमन के साथ मानव आइलेट विकास के प्रमुख चरणों का उपयोग करता है। बी 27: बी -27 पूरक; Ri: rho-associated protein kinase inhibitor or ROCK inhibitor; टी 3: थायराइड हार्मोन; केजीएफ: मानव केजीएफ / एफजीएफ -7 प्रोटीन; रेपसॉक्स: एक्टिविन / नोडल / टीजीएफ -β मार्ग अवरोधक; ALK5 को रोकता है; आरए: रेटिनोइक एसिड; जेडएस: जिंक सल्फेट; यूएफएच: अविभाजित हेपरिन; XX: गामा-सीक्रेटेज इनहिबिटर XX; एपीएच: एफिडिकोलिन; ईजीएफ: एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर; एलडीएन: बीएमपी अवरोधक III, एलडीएन-212854; साइक्लो: साइक्लोपामाइन- केएएडी। (बी) प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से अग्नाशयी β-कोशिकाओं में भेदभाव के विभिन्न चरणों में कैप्चर की गई सेलुलर आकृति विज्ञान की छवियां। पहली छवि भेदभाव (एचपीएससी की मोनोलेयर) के पहले दिन मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को दिखाती है। (सी) 11 दिन, कोशिकाओं अग्नाशय पूर्वज चरण में हैं. 100 माइक्रोन के स्केल बार। (डी) 12 दिन, अग्नाशयी पूर्वज चरण में कोशिकाओं के पृथक्करण के बाद 6 अच्छी तरह से थाली के microwells में समूहों का गठन कर रहे हैं. (ई) 13 दिन पर, समूहों एक कम लगाव 6 अच्छी तरह से थाली में हैं. 100 माइक्रोन के स्केल बार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विभेदित Mel1 InsGFP/w hESC रिपोर्टर लाइन14 से प्राप्त समूहों β सेल परिपक्वता मार्करों व्यक्त इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया. (ए) समूहों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों क्रायोमोल्ड वर्गों (5 माइक्रोन) कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर से कब्जा कर लिया गया, जो ग्लूकागन-उत्पादक कोशिकाओं (लगभग 15%) की तुलना में इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (लगभग 15%) की प्रबलता का पता चला (एन = 9 समूहों, लगभग 18,000 कोशिकाएं, एसईएम)। (बी) क्लस्टर की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां क्रायोमोल्ड वर्गों (5 माइक्रोन) से कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं, जिसमें इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं की प्रबलता को अग्नाशयी β-सेल मार्कर एनकेएक्स 6.1 (एन = 9 क्लस्टर, लगभग 18,000 कोशिकाएं) सह-व्यक्त किया गया था। (सी) इमेजजे सेल काउंटर मैक्रो, विशेष रूप से मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया था, इंसुलिन पॉजिटिव, ग्लूकागन-पॉजिटिव और β-सेल मार्कर एनकेएक्स 6.1 पॉजिटिव कोशिकाओं और β-सेल मार्कर पीडीएक्स 1 पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था। (डी) मेल 1 इंसजीएफपी/डब्ल्यू एचईएससी व्युत्पन्न समूहों के ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव का मूल्यांकन किया गया था, जिसने विभेदित समूहों (एन = 9, एसईएम) में उच्च ग्लूकोज उत्तेजना (16.7 एमएम ग्लूकोज) के जवाब में 100 गुना की वृद्धि प्रदर्शित की थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: निर्देशित भेदभाव के लिए मीडिया संरचना का सारांश। यह तालिका ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव बफर के साथ-साथ स्टेम सेल मैट्रिक्स और माध्यम के शीर्ष पर निर्देशित भेदभाव के प्रत्येक दिन/चरण के लिए उपयोग की जाने वाली मीडिया संरचना का सारांश प्रदान करती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अग्नाशयी β-कोशिकाओं में एचपीएससी का सफल भेदभाव नियमित संवर्धन और चयनित एचपीएससी के पारित होने के सभी पहलुओं को अनुकूलित करने पर निर्भर करता है। इसमें यह सुनिश्चित करना शामिल है कि सेल लाइन में एक सामान्य कैरियोटाइप है, माइकोप्लाज्मा संक्रमण के लिए नकारात्मक है, और प्लास्मिड या वायरल वेक्टर जीनोम से मुक्त है। इसके अलावा, जब hiPSCs का उपयोग कर, यह जल्द से जल्द मार्ग जो अभी भी reprogramming के दौर से गुजर रहे हैं का उपयोग करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, पायलट प्रयोगों के लिए. इन प्रयोगों को छोटे पैमाने पर आयोजित किया जाना चाहिए ताकि एचपीएससी लाइन को सर्वोत्तम भेदभाव क्षमता और मार्ग की इष्टतम संख्या के साथ पहचाना जा सके।

भेदभाव दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं कि अन्य मापदंडों स्टेम सेल माध्यम इस्तेमाल की गुणवत्ता, कोटिंग घनत्व, और मार्ग10,12 की संख्या शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल को यह सुनिश्चित करके भेदभाव की दक्षता को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि सभी प्रासंगिक मापदंडों को10 अनुकूलित किया गया है।

β-कोशिकाओं में एचपीएससी के भेदभाव का समर्थन करने के लिए प्रत्येक चरण में विशिष्ट योगों के साथ भेदभाव मीडिया का उपयोग किया जाता है। एक्टिविन ए और एक डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट का उपयोग भेदभाव माध्यम में निश्चित एंडोडर्म कोशिकाओं में संक्रमण शुरू करने के लिए किया जाता है। आदिम आंत ट्यूब चरण के दौरान, KGF β कोशिकाओं15 में आगे भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए माध्यम में जोड़ा जाता है, और KGF के इस समावेश 6 से 8 दिन तक बनाए रखा है, Sui, Egli, एट अल.10द्वारा मूल प्रोटोकॉल से भिन्न. अग्नाशयी पूर्वज चरण के दौरान, विशिष्ट मीडिया संरचना को पीडीएक्स 1 प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जाता है। यह रेटिनोइक एसिड (आरए), केजीएफ और LDN193189 की उच्च सांद्रता का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) मार्ग8 को रोकता है। जैसे-जैसे भेदभाव अंतःस्रावी चरण में आगे बढ़ता है, संस्कृति माध्यम को नॉच सिग्नलिंग को डाउनरेगुलेट करने के लिए संशोधित किया जाता है। यह XXI, एक γ-स्रावित अवरोधक को शामिल करके प्राप्त किया जाता है, साथ ही T3 (थायराइड हार्मोन), RA, और RepSox, एक्टिविन / BMP / TGF-β मार्ग8 का अवरोधक है। यौगिकों के इस विशिष्ट संयोजन का उपयोग अंतःस्रावी पूर्वज में अग्नाशयी पूर्वजों के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। अंत में, प्रत्यक्ष भेदभाव प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए, एफिडिकोलिन (एपीएच) को अग्नाशयी पूर्वजों से अंतःस्रावी पूर्वज में भेदभाव के दौरान पेश किया जाता है। एपीएच के इस अतिरिक्त आगे β सेल भेदभाव को बढ़ाने के लिए करना है, और यह Sui, Egli, एट अल10,11 द्वारा प्रस्तावित प्रारंभिक प्रोटोकॉल से एक अलग संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है.

भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, सेल घनत्व की निगरानी करना और अति-संगम को रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उचित भेदभाव में बाधा डाल सकता है। उच्च घनत्व संस्कृतियों उच्च Oct4 अभिव्यक्ति बनाए रख सकते हैं, निश्चित endoderm के लिए भेदभाव बाधित. पहले धोने के चरण के दौरान रॉक अवरोधक को हटाना भेदभाव शुरू करने और एचपीएससी के प्लुरिपोटेंट राज्य को बदलने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। इंसुलिन स्थान पर एकीकृत जीएफपी के साथ मेल 1 आईएनएस-जीएफपी जैसे प्रतिदीप्ति मार्कर का उपयोग करना, अग्नाशयी पूर्वज और β-सेल चरणों में भेदभाव प्रगति के आकलन की सुविधा प्रदान करता है, डाउनस्ट्रीम प्रयोगों14 की सहायता करता है।

अग्नाशयी β जैसी कोशिकाओं में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल ने विभिन्न एचपीएससी लाइनों10के बीच दक्षता में परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया है। इसके अतिरिक्त, परिणामी β जैसी कोशिकाएं मानव अग्नाशयी आइलेट्स की तुलना में कार्यात्मक अपरिपक्वता प्रदर्शित करती हैं, जो प्रति कोशिका कम इंसुलिन स्राव दिखाती हैं। आगे इस सीमा को संबोधित करने के लिए, β की तरह कोशिकाओं के विवो परिपक्वता में भेदभाव 6,7 के अंतिम चरणों के दौरान पशु मॉडल में आइलेट organoids के प्रत्यारोपण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

इन सीमाओं के बावजूद, अग्नाशय β कोशिकाओं में hPSCs के भेदभाव मौजूदा तरीकों 8,9,10 के संबंध में महत्वपूर्ण क्षमता है. यह तकनीक बड़ी संख्या में β-सेल जैसी कोशिकाओं का उत्पादन करने की अनुमति देती है जो ग्लूकोज के प्रति उत्तरदायी हैं और β-सेल मार्करों को व्यक्त करती हैं (पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1, चित्र 2 देखें)। यह मानव अग्नाशयी आइलेट्स के उपयोग से जुड़े नैतिक, तकनीकी और स्रोत सीमाओं के बिना किया जाता है। इसके अलावा, इस तकनीक में व्यक्तिगत दवा पर लागू होने की क्षमता है, क्योंकि रोगी-विशिष्ट β-कोशिकाओं को दवा परीक्षण औररोग मॉडलिंग 4,6,7के लिए उत्पन्न किया जा सकता है। तकनीक भी अग्नाशयβ कोशिकाओं 4,6,7 के नुकसान या रोग शामिल है कि मधुमेह के इलाज में भविष्य के अनुप्रयोगों हो सकता है.

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Acknowledgments

इनेस चेरकौई को डायबिटीज यूके स्टूडेंटशिप (बीडीए 18/0005934) द्वारा जीएआर का समर्थन किया गया था, जो एक अन्वेषक पुरस्कार (212625/Z/18/Z) के लिए वेलकम ट्रस्ट को भी धन्यवाद देता है, एक कार्यक्रम अनुदान के लिए UKRI MRC (MR/R022259/1), प्रोजेक्ट ग्रांट के लिए डायबिटीज यूके (BDA16/0005485), स्टार्ट-अप फंड के लिए CRCHUM, जॉन आर. इवांस लीडर अवार्ड (CFI 42649) के लिए इनोवेशन कनाडा, परियोजना अनुदान के लिए एनआईएच-एनआईडीडीके (R01DK135268), और टीम अनुदान के लिए सीआईएचआर, जेडीआरएफ (सीआईएचआर-आईआरएससी:0682002550; जेडीआरएफ 4-एसआरए-2023-1182-एसएन)। केमिली डायोन और डॉ हैरी लीच मानव hiPSCs पीढ़ी और संस्कृति के साथ उनकी मदद के लिए, NIHR इंपीरियल BRC (बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर) ऑर्गेनॉइड सुविधा, लंदन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube Starlabs S1615-5500
6-well Cell culture plate ThermoFisher Scientific 165218
AggreWell 400 6-well plate  STEMCELL Technologies 34425
Anti-Glucagon  Sigma-aldrich G2654-100UL
Anti-Insulin  Dako A0564
Anti-NKX6.1 Novus Biologicals NBP1-49672SS
Anti-PDX1  Abcam ab84987
Aphidicolin Sigma-Aldrich A4487
B-27 Supplement (50X), serum free  Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free Sigma-Aldrich A3803-100G
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Cyclopamine-KAAD Calbiochem 239804
D-(+)-Glucose,BioXtra Sigma-Aldrich G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous Sigma-Aldrich 94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566016 For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Thermo Fisher Scientific 10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher Scientific 10149870
Ethanol VWR 20821.33
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX Thermo Fisher Scientific J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Thermo Fisher Scientific A1413302 Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 Abcam ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Thermo Fisher Scientific A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11011
Heparin Sigma-Aldrich H3149
HEPES buffer Sigma-Aldrich H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein Thermo Fisher Scientific PHG0094
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Agar Scientific AGG4582
LDN193189 Sigma-Aldrich SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272-500G
OCT Compound 118 mL Agar Scientific AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS) Thermo Fisher Scientific, 15070-063
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein R&D Systems 236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm VWR 631-0137
RepSox (Hydrochloride) STEMCELL Technologies 72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement   Thermo Fisher Scientific 61870036 For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous Sigma-Aldrich 7558-80-7
STEMdiff Endoderm  STEMCELL Technologies 5110
StemFlex Medium Thermo Fisher Scientific A3349401 Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid Reprocell 04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3) Sigma-Aldrich T6397
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
TrypL Express Enzyme (1X) Thermo Fisher Scientific 12604013
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture Thermo Fisher Scientific 38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)  STEMCELL Technologies 72302
Zinc Sulfate Sigma-Aldrich  Z4750

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References

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जीवविज्ञान अंक 204
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से कार्यात्मक अग्नाशयी इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल
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Cherkaoui, I., Du, Q., Egli, D., Misra, S., Rutter, G. A. Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (204), e65530, doi:10.3791/65530 (2024).

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