El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .
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Artículo de método
Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe la producción y purificación de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, un método independiente del serotipo para purificar AAV descrito por primera vez en 1999. Los vectores rAAV se utilizan ampliamente en aplicaciones de terapia génica para administrar transgenes a varios tipos de células humanas. En este trabajo, el virus recombinante se produce por transfección de células Expi293 en cultivo en suspensión con plásmidos que codifican los genes transgénicos, de la cápside del vector y de los genes auxiliares adenovirales. La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol purifica las partículas AAV completas en función de la densidad de partículas. Además, se incluyen tres pasos en esta metodología ahora omnipresente para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación debido a proteínas contaminantes y concentrar aún más el producto final del virus, respectivamente: precipitación de partículas virales de medios celulares utilizando una solución de polietilenglicol (PEG) y cloruro de sodio, la introducción de una segunda ronda de centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, y el intercambio de tampón a través de un filtro centrífugo. Con este método, es posible lograr títulos consistentes en el rango de 10a 12 partículas virales/ml de pureza excepcional para uso in vivo .
Introducción
Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) son herramientas ampliamente utilizadas para el tratamiento de enfermedades genéticas, como la atrofia muscular espinal, la distrofia retiniana y la hemofilia A 1,2,3. Los vectores rAAV están diseñados para carecer de genes virales presentes en el AAV4 de tipo salvaje, un virus icosaédrico pequeño y sin envoltura con un genoma lineal de ADN monocatenario de 4,7 kb. El AAV se descubrió por primera vez en la década de 1960 como un contaminante de las preparaciones de adenovirus5
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Protocolo
La composición de las soluciones y tampones utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla 1.
| Solución | Composición | |
| Tampón de lisis AAV | 1,2 ml de solución de NaCl 5 M | |
| 2 ml de solución de Tris-HCl 1 M pH 8,5 | ||
| 80 uL de solución de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ de agua a 40 mL | ||
| Solución de precipitación AAV | ||
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Resultados
Este método se puede utilizar para obtener títulos de al menos 10a 12 partículas virales por ml. Se puede obtener un título (Figura 3) por qPCR utilizando los cebadores ITR proporcionados en la Tabla Suplementaria 1, por ddPCR o por cualquier otro método de titulación. Los títulos subóptimos podrían ser el resultado del uso de un gen de la cápsula que codifica una cápside con una eficiencia de envasado deficiente.
Otra posible .......
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Discusión
El protocolo de purificación de doble gradiente de densidad de yodixanol es el método universal porque es aplicable a cualquier variante mutante de AAV, independientemente de su especificidad de receptor. Los primeros métodos de purificación de AAV se basaban en la densidad de partículas e incluían la centrifugación isopícnica en CsCl y la centrifugación continua en gradiente de densidad de sacarosa19. Posteriormente, se desarrollaron abordajes seroespecíficos que hicieron uso de anticuerpos monoc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones que informar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífuga de sobremesa 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| bomba peristáltica de 8 canales | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Contador de células automatizado | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Cabina de seguridad biológica | Labconco | 322491101 | |
| Incubadora de CO2 con agitador | Ajustado a 8% CO2 y 37 ° C | ||
| Tubos de centrífuga cónicos | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Tubos de centrífuga cónicos | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Micropipetas desechables | Fisherbrand | 21-164-2G | Capilares |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (DPBS) (10 veces) | Microscopio invertido Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL | Nikon | ||
| Expi293 Medio de expresión | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F células | Gibco | A14527 | |
| Puntas de filtro | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µ L |
| Puntas de filtro | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µ L |
| Puntas de filtro | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µ L |
| Puntas de filtro | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µ L |
| Agujas hipodérmicas | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Cubitera con tapa | VWR | 10146-184 | |
| Rotor JS-5.3 | Beckman Coulter | 368690 | |
| Solución de cloruro de magnesio (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Soporte y abrazadera metálicos | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Tubos de microcentrífuga | Eppendorf | 22600028 | 1,5 mL |
| Alicates | |||
| Ultracentrífuga Optima XE-90 | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Medio de suero reducido | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep Medios de gradiente de densidad (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 Solución de | yodixanol al 60% |
| Pipeta Gilson | F144059M | ||
| P2 Pipeta | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipeta | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipeta | Gilson | F144058M | |
| Rojo de fenol solución | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP controlador de pipetas | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plápside | de novo o Addgene, etc. | N/A | Usamos pACGrh74. |
| Plásmido pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plásmido pTransgene | De novo o Addgene, etc. | N/A | Se utilizó pdsAAV-GFP. |
| Solución de poliol Pluronic F-68 (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polietilenglicol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polietilenimina HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Diluir en agua a 40 μ M |
| Tubos de centrífuga de polipropileno, estériles | Corning | 431123 | 500 mL |
| Tubos de centrífuga de polipropileno, estériles | Corning | 430776 | 250 mL |
| Tubos de polipropileno Optiseal Beckman | Coulter | 361625 | |
| Pipetas serológicas | Alkali Scientific | SP250-B | 50 |
| mL Pipetas serológicas | Alkali Scientific | SP225-B | 25 |
| mL Pipetas serológicas | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Pipetas serológicas | Alkali Scientific | SP205-B | Matraces |
| mL Fisherbrand | PBV1000 | 1 L | |
| Matraces agitadores | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Matraces agitadores | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Matraces agitadores | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Solución de cloruro de sodio (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Jeringas estériles | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Filtro de jeringa | Millipore | SLGV013SL | 0,22 micras |
| Tris-HCl pH 8,5 (1 M) | Kd Medical RGE3363 | ||
| Trypan blue solución | Gibco | 15250061 | |
| Conjunto de bastidor de tubos | Beckman Coulter | 361646 | |
| Espaciadores de tubos (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubo para bomba peristáltica | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Tipo 70 Ti rotor de titanio de ángulo fijo | Beckman Coulter | 337922 | |
| Congelador de ultra baja temperatura | Establecido en -70 ° C | ||
| Concentrador centrífugo Vivaspin 20 | Sartorius | VS2041 | |
| Baño de agua | Establecido en 37 ° C |
Referencias
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
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Reimpresiones y permisos
