Method Article

Exploración de soluciones alternativas de perfusión utilizando portadores de oxígeno basados en hemoglobina polimerizada de próxima generación en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

DOI:

10.3791/66702

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June 14th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1COPPER Laboratory, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University

In This Article

Summary

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Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas.

Abstract

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El trasplante de pulmón se ve obstaculizado por la falta de donantes adecuados. Anteriormente, se descartaban los donantes que se consideraban marginales o inadecuados. Sin embargo, una tecnología nueva y emocionante, como la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP), ofrece a los proveedores de trasplantes de pulmón una evaluación ampliada para los aloinjertos de donantes marginales. Esta plataforma de evaluación dinámica ha provocado un aumento del trasplante pulmonar y ha permitido a los proveedores utilizar donantes que antes se descartaban, ampliando así el grupo de donantes. Las técnicas de perfusión actuales utilizan perfusionados celulares o acelulares, y ambos tienen ventajas y desventajas distintas. La composición de la perfusión es fundamental para mantener un entorno homeostático, proporcionar un apoyo metabólico adecuado, disminuir la inflamación y la muerte celular y, en última instancia, mejorar la función de los órganos. Las soluciones de perfusión deben contener una concentración de proteínas suficiente para mantener una presión oncótica adecuada. Sin embargo, las soluciones de perfusión actuales a menudo conducen a la extravasación de líquido a través del endotelio pulmonar, lo que resulta en edema y daño pulmonar inadvertido. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas soluciones de perfusión que eviten el daño excesivo mientras mantienen una homeostasis celular adecuada. Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Introduction

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Como cualquier campo en el trasplante de órganos sólidos, el trasplante de pulmón sufre de una escasez de órganos de donantes. Con el fin de aumentar el grupo de donantes, se han dedicado importantes investigaciones a investigar el potencial de los aloinjertos que antes se pensaba que no eran adecuados para el trasplante, es decir, los donantes de criterio extendido (ECD). Estos aloinjertos pueden considerarse ECD por una serie de razones, que incluyen calidad cuestionable, mala función, infección, traumatismo, tiempos isquémicos cálidos o fríos prolongados y edad avanzada 1,2. En ciertos casos, en los que estos pulmones son adecuados para el trasplante inmediato3, a menudo es ventajoso tanto para los proveedores como para los receptores evaluar estos pulmones durante un tiempo adicional para determinar su idoneidad para el trasplante. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) es una tecnología que permite una evaluación ampliada de posibles aloinjertos pulmonares en un circuito cerrado fuera del donante 2,4,5,6,7, lo que permite al proveedor del trasplante determinar la idoneidad del trasplante. La EVLP ha demostrado la capacidad de evaluar adecuadamente los órganos del donante 8,9,10,11, disminuir los efectos de la lesión por reperfusión isquémica (IRI)12,13 y aumentar el número de donantes14,15, lo que hace que el trasplante pulmonar sea un tratamiento más accesible para todos.

En general, un sistema EVLP es un sistema cerrado con un circuito ventilatorio (que se logra conectando un ventilador a la tráquea para introducir aire en el sistema) y un circuito vascular (que se logra conectando la aurícula izquierda (AI) a la arteria pulmonar (AP) con tubos)7. El circuito vascular tiene perfusión que corre a través del tubo para proporcionar al pulmón nutrientes vitales y oxígeno, al tiempo que limita el tiempo de isquemia fría (TCE)5,8,16,17. Esta solución es de base sanguínea (es decir, a través de la adición de glóbulos rojos empaquetados (PRBC))16,17 o de base acelular (es decir, sin PRBC)4,5. Sin embargo, existen varias desventajas notables en el uso de PRBC. Si se utilizan PRBC de donantes que murieron por traumatismo o donantes con muerte cerebral (BDD), estos fluidos a menudo contienen grandes cantidades de citocinas inflamatorias, lo que puede aumentar el daño celular durante la EVLP, así como aumentar los niveles de hemoglobina libre de células (Hb), hemo, hierro y fragmentos celulares que causan daño adicional a las células18,19. Además, dado que estos donantes suelen ser multiorgánicos, la recolección de PRBC antes de la obtención podría conducir a una disminución del volumen sanguíneo en el donante y, posteriormente, a un aumento de la isquemia en todos los órganos. Si se utilizan PRBC de otra fuente, los proveedores podrían enfrentar escasez de sangre, ya que este es un material escaso en sí mismo20,21. Por último, los PRBC son propensos a la lisis mecánica en el circuito EVLP, independientemente de su fuente, liberando Hb y otros componentes que contribuyen al daño celular.

Por lo tanto, por muchas razones, podría ser ventajoso utilizar un sustituto artificial de glóbulos rojos, es decir, portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC), como suplemento de perfusión. Un HBOC particularmente prometedor es la hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). La poliHHb se sintetiza a partir de Hb purificada a partir de PRBC caducados que se consideraron inadecuados para la transfusión inmediata22. Se ha demostrado que son sustitutos viables de la sangre en el shock hemorrágico23 y en el trasplante24 y pueden producirse en grandes cantidades22. Sin embargo, la adopción a gran escala de PolyhHb no ha tenido éxito debido a complicaciones imprevistas como vasoconstricción, aumento de la presión arterial y paro cardíaco23,25. Las razones detrás de estos hallazgos probablemente se debieron a la presencia de Hb libre de células o polímeros de Hb de bajo peso molecular (< 500 kDa) en la solución de PolyhHb, ya que tienen una propensión a extravasarse al espacio tisular, lo que resultó en una disminución de la disponibilidad de óxido nítrico, vasoconstricción posterior, hipertensión sistémica y, finalmente, lesión oxidativa del tejido26,27. Para mejorar estos problemas, el Laboratorio Palmer ha trabajado en el desarrollo de una nueva generación de PolyhHb que contiene un mínimo de especies de bajo MW y Hb libre de células, que ha demostrado mejores características biofísicas y respuestas in vivo 22,28,29,30. Varios estudios de transfusión en animales han demostrado que si se eliminan los polímeros de Hb de bajo peso molecular del HBOC, se pueden mitigar la vasoconstricción, la hipertensión sistémica y el daño oxidativo 28,29,31,32,33,34,35. Por lo tanto, esto convierte a este PolyhHb de próxima generación en un candidato prometedor para perfundir.

Aquí, describimos la aplicación de un PolyhHb de próxima generación para ser utilizado en una perfusión y el protocolo por el cual esta solución de perfusión puede ser probada en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como proporcionar protocolos para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Protocol

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Las ratas Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) se obtuvieron comercialmente y se alojaron en condiciones libres de patógenos en el Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio. Todos los procedimientos se realizaron de manera humanitaria de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio de los NIH y el Consejo Nacional de Investigación y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).

1. Síntesis y purificación de PolyhHb

NOTA: La producción y síntesis del material PolyhHb que se utilizó para los siguientes experimentos de EVLP fueron publicadas inicialmente por Cuddington et al. en 202022. Consulte este trabajo para obtener esquemas y análisis detallados de la síntesis de PolyhHb. A continuación se presenta un resumen de la síntesis y purificación de PolyhHb a escala piloto y su posterior preparación como perfusión.

  1. Lavado, lisis y purificación de Hb de glóbulos rojos
    1. Adquiera 18 unidades de PRBC humanos caducados y viértalas en un recipiente de filtración de 20 L, diluido con solución salina al 0,9% en peso hasta obtener un hematocrito final del 22% (Figura 1B, C).
    2. Realice seis intercambios de volumen del sistema (diaciclos) en un módulo de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietileno sulfona (mPES) modificado de 0,65 μm con solución salina al 0,9 % en peso en la solución RBC. NOTA: El propósito de este paso de lavado es eliminar los glóbulos rojos dañados, los fragmentos de membrana y otros materiales extracelulares antes de la hemólisis (Figura 1B, C).
    3. Lisar la solución de RBC con 10 L de tampón fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) durante 1 h a 4 °C con agitación constante.
    4. Elimine los fragmentos de membrana lisada y otros agregados filtrando la solución sobre un módulo TFF de 500 kDa y recolectando el permeado en la vasija del reactor discontinuo de 30 L (Figura 1A-C).
    5. Una vez que haya 480 g de Hb en el reactor, agregue una carga de sal para convertir el PB en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    6. Recircule la Hb a través de un contactor de gas alimentado con nitrógeno, además de mantener un espacio de cabeza de nitrógeno en el reactor, para desoxigenar la proteína durante la noche. Enfriar a 14 °C para limitar la formación de metahemoglobina (metHb).
  2. Polimerización de Hb
    1. Calentar la solución de Hb a la temperatura fisiológica (37 °C) mientras se recircula la solución en un circuito contactor de gas.
      NOTA: El objetivo es desoxigenar la proteína a unapO2 entre 0-10 mmHg para asegurar que la mayor parte de la Hb esté en el estado cuaternario tenso (Figura 1A).
    2. Agregue 1 g de carga de ditionita de sodio, según sea necesario, para garantizar una desoxigenación efectiva.
    3. Mientras se mantiene el circuito de recirculación y se desgasifica la solución de Hb, se añade una proporción molar de 30:1 de glutaraldehído (GA) a Hb diluido en 3 L de PBS desoxigenado (pH 7,4).
    4. Agregue la solución a la vasija del reactor durante 3 h con una hora adicional de tiempo de reacción.
    5. Apague la reacción de reticulación con una proporción molar de 7:1 de cianoborohidruro de sodio a GA, diluido en 3 L de PBS (pH 7,4). Añadir al reactor durante más de 10 min.
    6. Enfriar el reactor a 14 °C durante la noche.
  3. Purificación de PolyhHb
    1. Bombee el contenido del reactor a un recipiente de filtración de 10 L y comience la circulación a través de un módulo TFF de polietileno sulfona (PES) de 0,2 μm (Etapa 1). Este paso eliminará los agregados grandes y los contaminantes no deseados.
    2. Alimente el permeado en un recipiente de filtración secundario de 10 L que circulará sobre un módulo TFF de polisulfona (PS) de 500 kDa (Etapa 2) una vez lleno. Continúe hasta que se vacíe el reactor (Figura 1B, D).
    3. Una vez que el reactor se vacía en el circuito de purificación, inicie el intercambio de excipientes en la Etapa 1 con una solución de Ringer lactato modificada (pH 7.4). Después de cada intercambio de volumen completo, mida la concentración de proteínas en el permeado de la Etapa 1 utilizando espectroscopía UV-visible.
    4. Cuando el permeado de la Etapa 1 tenga una concentración de menos de 1 mg Hb/mL, transfiera la solución de Ringer modificada a la Etapa 2. Cualquier retención en la Etapa 1 es un desperdicio y debe eliminarse de manera adecuada. En total, asegúrese de que se realicen 12 intercambios de volumen completo de la solución modificada del Ringer en ambas etapas.
    5. Una vez finalizados los diaciclos, concentre el contenido de la Etapa 2 en al menos 10 g/dL en el módulo TFF de 500 kDa.
    6. Envasar la solución concentrada en tubos cónicos de 50 mL y almacenar a -80 °C hasta su uso.

2. Formulación perfumada

  1. Prepare la perfusión hasta un volumen final de 165 mL. Diluya PolyhHb hasta una concentración final de 3,7 g/dL con William's E Medium.
  2. Añadir albúmina sérica humana (HSA) hasta una concentración final de 3% de HSA en peso. Agregue 1 mL de heparina a la solución final.

3. Configuración del circuito de perfusión pulmonar ex vivo

  1. Coloque la perfusión de PolyhHb en el depósito del circuito EVLP y abra el baño de agua tibia a 37 °C. Asegúrese de que la perfusión circule dentro del circuito encendiendo las bombas de rodillos.
  2. Conecte el gas de desoxigenación (es decir, 6% de O2, 8% de CO2, 84% de N2) al oxigenador de fibra hueca para desoxigenar la perfusión. Esto se hace para evaluar la capacidad del pulmón para oxigenar la perfusión.
  3. Abra el software de adquisición de datos en una computadora cercana. Asegúrese de que la presión de la arteria pulmonar, la presión diferencial traqueal, la presión diferencial del flujo respiratorio, el peso pulmonar y los transductores de velocidad de la bomba estén conectados tanto al circuito como a la caja convertidora de datos.
  4. Asegúrese de que no haya fugas en todo el sistema examinando cuidadosamente todas las conexiones de los tubos y que el agua caliente circule por todas partes (Figura 2). Presione Ejecutar en el software de adquisición de datos para asegurarse de que todos los transductores de presión estén funcionando. Una vez que el sistema funcione correctamente, apague las bombas de rodillos.

4. Obtención de un bloque pulmonar de rata donante

  1. Coloque la mesa quirúrgica y coloque los instrumentos (Figura 3). Autoclave todos los instrumentos a 121 °C durante 30 min.
  2. Preparar 1200 U/kg de heparina, una mezcla de ketamina y xilacina anestésica (60 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg), así como suturas de seda de 5-10 cm de largo (3-0 o 4-0).
  3. Inyecte la solución de ketamina/xilacina por vía intraperitoneal en la rata. Espere de 5 a 10 minutos para que se desarrolle el plano anestésico. Para asegurar un nivel adecuado de anestesia, pellizca la rata con los dedos de los pies para provocar una reacción. Si no hay reacción, entonces se ha alcanzado el nivel adecuado de anestesia.
  4. Afeitar el abdomen de la rata y colocarla en posición supina sobre la tabla quirúrgica. Limpiar el abdomen con povidona yodada y etanol al 70%. Coloque ungüento oftálmico debajo de los ojos de la rata para prevenir la sequedad.
  5. Mueva la rata a la tabla quirúrgica y asegúrela en su lugar (Figura 4A). Encienda el software de adquisición de datos y comience a grabar. Encienda el ventilador a 4 mL/kg y asegúrese de que la presión positiva al final de la espiración (PEEP) esté en torno a los 2 cm/H2O.
    NOTA: Estos ajustes iniciales son específicos del experimento. Corresponde a todos los investigadores determinar las mejores estrategias ventilatorias para los experimentos individuales.
  6. Una vez que se alcanza la profundidad anestésica adecuada, realice una laparotomía de línea media desde el proceso xifoides hasta la sínfisis púbica con un par de tijeras. A continuación, realizar una rotación visceral medial-lateral y visualizar la vena cava inferior infrahepática mediante un instrumento contundente (VCI)36,37,38 (Figura 4B). Inyecte heparina en la VCI con una aguja de 20 g (Figura 4C).
  7. Dirige la atención al cuello y corta la piel desde la muesca esternal hasta justo debajo del ángulo de la mandíbula con unas tijeras. A continuación, comience a diseccionar hacia la tráquea (Figura 5A).
  8. En el cuello, diseccione sin rodeos los músculos de la correa necesarios para exponer la tráquea (Figura 5B). Haga una incisión transversal con un par de tijeras en la tráquea anterior entre los anillos cartilaginosos lo suficientemente grandes para el tubo endotraqueal (ET) (varios milímetros), pero no corte a través de la porción posterior de la tráquea. Coloque una sutura de seda 5-0 alrededor de la tráquea (Figura 5C).
  9. Inserte el tubo endotraqueal y asegúrelo en su lugar con la sutura de seda 5-0 antes mencionada (Figura 5D). Conecte el tubo endotraqueal al ventilador y asegúrese de que el tórax se eleve correctamente.
  10. Realizar una esternotomía mediana y volver a entrar en la cavidad torácica con unas tijeras. Coloque retractores de la pared torácica para exponer el corazón y los pulmones (figura 6A). Evite cualquier manipulación inadvertida de los pulmones, ya que son increíblemente friables.
  11. Extirpar el timo del mediastino anterior mediante una combinación de disecciones afiladas (tijeras) y romas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes o los pulmones.
  12. Identificar la arteria pulmonar (AP; Figura 6B) y coloque una sutura de seda 5-0 a su alrededor para prepararse para la canulación (Figura 6C). Debido a la anatomía microscópica de los grandes vasos de la rata, a menudo es más fácil colocar la sutura alrededor de la PA y la aorta al mismo tiempo.
  13. Realizar una incisión de 2-3 mm en la vía de salida del ventrículo derecho (TSVD) con unas tijeras (Figura 6D-E) para colocar la cánula arterial dentro de la AP y asegurarla con la sutura 5-0 descrita un paso antes (Figura 6F).
  14. Realice una incisión de 5 mm en el ventrículo izquierdo (VI) y en la VCI infrahepática con unas tijeras para aplicar la eutanasia a la rata. Conecte rápidamente el líquido de preservación pulmonar a la cánula arterial para lavar los pulmones por gravedad con aproximadamente 20 mL (Figura 7A-B). Asegúrese de que el líquido de preservación pulmonar se desairee antes de conectarlo a la cánula arterial, ya que los émbolos aéreos son muy dañinos para los pulmones.
  15. Conecte la cánula arterial al circuito EVLP. Encienda la bomba de rodillo y permita que una pequeña cantidad de perfusión fluya a través del pulmón y salga del ventrículo izquierdo hacia la cavidad torácica. Una vez que la perfusión comience a fluir fuera de la aurícula izquierda, apague la bomba de rodillo (Figura 7C). Al mismo tiempo que permite que fluya la perfusión, asegúrese de que la presión de PA no aumente, lo que indicaría un bloqueo o una ubicación incorrecta.
  16. Coloque pinzas pequeñas en el ventrículo izquierdo y estire suavemente el anillo de la válvula mitral, lo que permitirá la introducción de la cánula de la aurícula izquierda (AI) (Figura 8A). Coloque una corbata de seda 5-0 alrededor del corazón y átela sin apretar (Figura 8B).
  17. Inserte la cánula LA en el ventrículo izquierdo y avance la cánula AI hasta que se pueda ver dentro de la aurícula. Termine de asegurar el AI con la sutura 5-0 preatada (Figura 8C).
  18. Identifique el esófago y sujételo con un hemostático lo más cerca posible del diafragma. Corte el esófago por debajo del hemostático para asegurarse de que no haya derrames en la cavidad torácica (Figura 9A).
  19. Usando la columna vertebral como guía, corte todas las uniones ligamentosas que conectan el bloqueo corazón-pulmón con las estructuras circundantes con un par de tijeras (Figura 9B). Una vez que el bloqueo corazón-pulmón se haya movido libremente, diseccione la tráquea desde el cuello y, finalmente, corte la tráquea por encima del tubo endotraqueal con unas tijeras para liberar el bloqueo corazón-pulmón (Figura 9C).
  20. Mueva el bloqueo corazón-pulmón a la cubierta torácica dentro del circuito EVLP y conecte la cánula LA al circuito EVLP (Figura 9D). Encienda la bomba de rodillos y conecte el monitor del ventilador.
  21. Revise la trampa de burbujas para asegurarse de que no se introduzcan émbolos de aire en el sistema.
  22. Cambie lentamente los ajustes de ventilación y perfusión a los niveles experimentales deseados durante los 15 minutos iniciales 36,37,38. Además, durante esta fase inicial de aceleración, aumente el caudal de perfusión hasta la tasa y/o presión deseadas.
  23. En los puntos de tiempo designados por el experimento, verifique los niveles de gas de perfusión, así como las pruebas de función pulmonar.

Results

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En la Figura 10 se demuestra la validación de nuestra perfusión basada en PolyhHb y, además, la estabilidad de esta perfusión durante varias horas. Durante la primera 1 h, todas las perfusionadas probadas (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), basadas en RBC) mostraron una ligera disminución de LA pO2 (Post pO2). Sin embargo, la perfusión basada en glóbulos rojos mostró una disminución significativa a 1 h en comparación con el polihHb (p < 0,05). Cuando se probaron durante las siguientes horas, tanto las perfusiones de PolyhHb como las de control tuvieron una LA pO2 estable, mientras que la PolyhHb tuvo una tendencia no significativa (p > 0,05) depO2 más alta (Figura 10A). Delta pO2, es decir, el cambio en la pO2 de LA desde PA pO2, nuevamente disminuyó significativamente a 1 h en el grupo de perfusión de glóbulos rojos (p < 0,05), mientras que se mantuvo estable en las perfusiones PolyhHb y Control con una tendencia no significativa (p > 0,05) de mayorpO2 en el grupo de PolyhHb (Figura 10B). El LA pCO2 fue significativamente menor en la perfusión de glóbulos rojos y en la perfusión de control en comparación con la perfusión de PolyhHb después de la primera hora (p < 0,05), y esto se mantuvo durante las siguientes horas cuando se compararon la perfusión de PolyhHb y la de control (Figura 10C). Finalmente, el delta pCO2 (es decir, el cambio en el pCO2 de PA pCO2) aumentó significativamente en la perfusión de glóbulos rojos después de 1 h (p < 0,05), y después de varias horas permaneció estable tanto en la perfusión de PolyhHb como en la de control (Figura 10D).

Los datos fisiológicos pulmonares en tiempo real recogidos a través del software de adquisición proporcionan información complementaria a los niveles de gas de perfusión (Figura 11). La resistencia vascular pulmonar (RVP) volvió a mostrar que la perfusión de glóbulos rojos aumentó significativamente durante la primera hora (p < 0,05). Durante las horas restantes, tanto la perfusión de PolyhHb como la de control tuvieron una PVR estable y baja (Figura 11A). El cambio en el peso pulmonar también aumentó significativamente en la perfusión de glóbulos rojos durante la primera hora (p < 0,05) y aumentó tanto en la perfusión de PolyhHb como en la de control durante las horas restantes, con un peso ligeramente mayor en la perfusión de PolyhHb (Figura 11B). Finalmente, la distensibilidad disminuyó significativamente en el grupo de perfusión de glóbulos rojos dentro de la primera hora (p < 0,05), mientras que hubo una disminución no significativa en la perfusión de PolyhHb y control (p > 0,05), siendo PolyhHb la que presentó la mayor distensibilidad después de 4 h (Figura 11C).

En términos de éxito y/o fracaso técnico (Figura 12), es importante destacar varias cosas. En la figura 12A podemos ver el fracaso del aloinjerto debido a una necrosis del lóbulo superior derecho debido a un posible coágulo dentro de la vasculatura pulmonar. En la Figura 12B, observamos un edema tisular severo dentro del lóbulo derecho también, lo que lleva al fracaso experimental. La Figura 12C-E muestra la preservación y apariencia adecuada del tejido dentro de las condiciones experimentales respectivas. Finalmente, en la Figura 12F, podemos ver la preservación ideal del tejido después del lavado con una solución de preservación pulmonar.

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Figura 1: Síntesis y purificación de PolyhHb a escala piloto. (A) Biorreactor para polimerización. (B) Los procesos de filtración de flujo tangencial (TFF) se configuran en un refrigerador a 4 °C. (C) Primer plano de la configuración paralela de TFF para el lavado de glóbulos rojos (RBC) y la purificación de la hemoglobina (Hb). (D) Primer plano del sistema TFF de la serie de dos etapas para la purificación de PolyhHb. Los recipientes para las etapas uno y dos están ubicados a la izquierda y a la derecha de los filtros, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Descripción general del circuito de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP). (A) Dibujo esquemático del circuito EVLP. (B) Colocación in vivo de cánula de arteria pulmonar y cánula auricular izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Instrumental quirúrgico utilizado para la perfusión pulmonar ex vivo. A) Sutura de seda. (B) Pinzas de punta fina (longitud media). (C) Pinzas de punta fina (longitud larga). (D) Pinzas curvas de punta fina. (E) Tijeras de mayo. F) Cánula traqueal. (G) Cánula de la arteria pulmonar (AP). (H) Cánula auricular izquierda (LA). (I) Retractores de caja torácica. (J) Tijeras de resorte. (K) Pinzas DeBakey. (L) Hemostático. (M) Tijeras pequeñas. (N) Pinzas pequeñas curvas de punta fina. (O) Pick-ups Adson. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Posicionamiento quirúrgico y exposición de la vena cava inferior (VCI). (A) Posicionamiento de la rata para la obtención de pulmón. (B) Exposición de la VCI infrahepática. (C) Canular la VCI e inyectar heparina con una aguja de 27G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Canulación de la tráquea con el tubo endotraqueal (ET). (A) Comience cortando la piel del área del cuello. (B) Diseccionar los músculos de la correa y el tejido conectivo para exponer la tráquea. (C) Hacer una incisión transversal en la tráquea anterior entre los anillos cartilaginosos lo suficientemente grandes para el tubo endotraqueal. (D) Inserte el tubo endotraqueal en la tráquea y asegúrelo en su lugar con sutura de seda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Colocación de la cánula de la arteria pulmonar. (A) Exposición de la cavidad torácica para visualizar el corazón y los pulmones. (B) Identificar la AP y aislarla. (C) Colocación de sutura alrededor de PA. (D) Cortar un pequeño orificio en el tracto de salida del ventrículo derecho (TSVD) para la cánula de PA. (E) Colocación adecuada de la cánula de PA dentro de la PA . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Lavado de los pulmones con solución de conservación. (A) Conexión de la cánula de descarga a la cánula de la arteria pulmonar (AP). (B) Debe salir líquido transparente de la aurícula izquierda (LA). (C) Conectar la cánula de PA al circuito de perfusión pulmonar ex vivo para garantizar el flujo y la colocación adecuados de la cánula de PA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Colocación de la cánula auricular izquierda (AI). Dilatar suavemente el anillo de la válvula mitral con un par de pinzas. (B) Colocación sin apretar una sutura de seda alrededor del ventrículo izquierdo (VI). Colocación de la cánula AI dentro de la aurícula izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Extracción del bloqueo corazón-pulmón. (A) Ligadura del esófago por debajo del hemostático. (B) La disección libera el bloqueo corazón-pulmón de la columna vertebral. (C) Disección libre de la tráquea. (D) Conexiones adecuadas y colocación de cánula de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10. Perfundir los niveles de gas con el tiempo. (A) Post pO2, es decir, aurícula izquierda (LA)pO 2, durante una perfusión de 4 h. (B) Delta pO2, es decir, el cambio en la pO2 de la LA de la arteria pulmonar (PA) pO2 durante una perfusión de 4 h. (C) Post pCO2, es decir, LA pO2, durante una perfusión de 4 h. (D) Delta pCO2, es decir, el cambio en el LA pO2 de PA pO2 durante una perfusión de 4 h. El azul representa la perfusión de PolyhHb, el negro representa la perfusión de control (medio estándar de William) y el rojo representa la perfusión basada en RBC. N=6 por grupo. Las barras de error indican la desviación estándar. La significación se evaluó mediante una prueba T de Student y se denota con un *, p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 11. Datos fisiológicos pulmonares en tiempo real. (A) Resistencia vascular pulmonar (RVP) durante 4 h de reperfusión. (B) Cambio (denotado por Δ) en el peso pulmonar a lo largo del tiempo. (C) Cumplimiento durante 4 h de reperfusión. El azul representa la perfusión de PolyhHb, el negro representa la perfusión de control (medio estándar de William) y el rojo representa la perfusión basada en RBC. N=6 por grupo. Las barras de error indican la desviación estándar. La significación se evaluó mediante una prueba T de Student y se denota con un *, p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 12: Resultados técnicos representativos. (A) Fracaso del injerto por infarto de lóbulo superior derecho. (B) Fracaso del injerto debido a un edema severo del lóbulo derecho. (C) Canulación y perfusión exitosas de aloinjerto pulmonar con perfusión de glóbulos rojos. (D) Canulación y perfusión exitosas de aloinjerto pulmonar con perfusión de PolyhHb. (E) Canulación y perfusión exitosas de aloinjerto pulmonar con perfusato estándar. (F) Preservación ideal del tejido después del lavado con solución de preservación pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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El desarrollo y las pruebas de soluciones de perfusión es un esfuerzo novedoso en el que se están embarcando muchas personas en todo el mundo. Tradicionalmente, las perfusiones estándar ofrecen la capacidad de suspender el tiempo isquémico y mitigar las lesiones asociadas a la isquemia, así como la reperfusión18. Sin embargo, la próxima evolución de la EVLP es mejorar la tecnología actual de perfusión, así como incorporar terapias de reparación y reacondicionamiento 39,40,41,42,43.

El polihHb descrito en este trabajo se coloca entre 500 kDa y 0,2 μm para evitar que el material se extravase del circuito al pulmón, lo que evitará la vasoconstricción y el aumento de la presión de PA30. Es fundamental que a lo largo de las etapas de polimerización de esta síntesis, la presión parcial de oxígeno (pO2) se mantenga en el valor apropiado para el producto de PolyhHb de afinidad de oxígeno deseado. Esto incluye todas las soluciones añadidas a lo largo de la reacción (es decir, reticulante, solución de enfriamiento, etc.) que tienen una pO2 coincidente con el biorreactor (es decir, desgasificadas con nitrógeno, oxigenadas, etc.). Una ventaja importante de este procedimiento de síntesis es que el producto final tiene equilibrios de oxígeno modificables para permitir diferentes aplicaciones con diferentes demandas de oxígeno (es decir, PolyhHb de baja afinidad por el oxígeno para la medicina transfusional, afinidad moderada por el oxígeno para la perfusión pulmonar o alta afinidad por el oxígeno para el suministro de oxígeno dirigido). También es importante asegurarse de que haya un mecanismo de calentamiento en el biorreactor que no provoque un calentamiento excesivo en los puntos de contacto, lo que provocará la formación de proteínas dañadas. Descubrimos que una bobina de cobre en todo el recipiente proporcionaba un calentamiento/enfriamiento más uniforme y menos dañino que una camisa calefactora aislada en el exterior del recipiente (Figura 1A).

Si bien el desarrollo de un modelo de rata EVLP no es nuevo37,38, hemos observado varias áreas que pueden conducir a mejores resultados. En primer lugar, es necesario hacer pequeñas incisiones en la VCI en el momento del sacrificio para asegurarse de que no haya aire adicional que pueda entrar en los pulmones a través de la circulación. Al lavar el aloinjerto pulmonar con la solución de preservación pulmonar, un color blanco pálido uniforme de los pulmones le permite al microcirujano saber que hay éxito técnico para el proceso de adquisición. Si todavía hay un pulmón de color rosado dentro del parénquima, a veces es aconsejable ajustar la cánula de PA para que todo el pulmón se perfunda uniformemente. Si bien la cánula PA suele ser la parte más fácil del procedimiento de completar, la introducción de la cánula LA es un poco más difícil. Siempre es necesario dilatar el anillo de la válvula mitral para que la cánula de AI llegue a la LA. Sin embargo, esto debe hacerse con extrema precaución, ya que es fácil perforar el ventrículo o las aurículas. Una vez que la punta de la cánula está dentro de las aurículas, a menudo puede extraviarse mientras asegura la sutura alrededor del ventrículo. A menudo es necesario ajustar el ángulo de la mesa (más horizontal) o colocar un trozo de gasa en la parte inferior de la cánula para que permanezca en su lugar.

Limitaciones
Este modelo tiene algunas limitaciones. Si bien es útil evaluar la eficacia de las perfusiones y su capacidad para mejorar los aloinjertos potenciales, este no es un modelo de trasplante que pueda decirnos los resultados in vivo de diferentes perfusiones y tecnologías. Además, si bien PolyhHb es una nueva y emocionante tecnología de perfusión, su uso, eficacia y posibles limitaciones deberán justificarse aún más en experimentos de perfusión preclínicos y clínicos adicionales antes de que se pueda considerar la adopción generalizada de esta tecnología.

Conclusiones
Aquí, demostramos la aplicación de una perfusión de PolyhHb de próxima generación y el protocolo por el cual esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. A medida que avance la tecnología de perfusión, será ventajoso explorar las posibilidades de utilizar el PolyhHb como un posible sustituto de las perfusionas tradicionales30. Las generaciones anteriores de PolyhHb han provocado efectos secundarios perjudiciales en función de su composición; Sin embargo, las mejoras en la síntesis han creado un polímero que es menos probable que se extravase, provoque edema y, por lo tanto, cause lesiones celulares30. Con PolyhHb, es posible realizar EVLP sin necesidad de glóbulos rojos y, al mismo tiempo, satisfacer la demanda metabólica de los aloinjertos pulmonares. Esto, sin duda, permitirá una mejor función del aloinjerto ex vivo. Sin embargo, se necesita una mayor validación de la polihHb tanto en el entorno preclínico como en el clínico. Esperamos que este protocolo proporcione a la comunidad de trasplantes de pulmón información clave para diseñar y desarrollar nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Disclosures

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Para el material presentado en este trabajo, A.F.P., A.G. y C.C. son inventores en la solicitud de patente de EE. UU. PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. y S.M.B. son inventores en la solicitud de patente estadounidense PCT/US2023/017765.

Acknowledgements

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Esta investigación fue generosamente apoyada por el Jewel and Frank Benson Family Endowment y la Cátedra de Investigación Jewel and Frank Benson. B.A.W. cuenta con el apoyo parcial de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL143000. A.F.P. cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 y R01HL138116 y de la W81XWH1810059 de subvenciones del Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los EE. UU. S.M.B. cuenta con el apoyo de la DK123475 NIH R01.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jeringa de insulina de 10 cc Aguja de 29 G x 1/2"B-D309301
30 L Vidrio Batch BiorreactorAce Glass
30g AgujaMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacina) Tabletas AntibacterianasElancoNA
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8Para el lactato de Ringer modificado
Amplificador de puente de frecuencia portadora CFBA tipo 672Harvard Apparatus 731747
Connect kit D150Cole-Parmer  VK 73-3763
Dumont #5 PinzasHerramientas de ciencia fina11252-50
Pinzas Dumont Medical #5/45 - Angulado 45°;Herramientas de Fine Science11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Calentador de aguaLaudaLCK 1879
Unidades de leuco-glóbulos rojos caducadas, empaquetadas y leucoreducidasWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
PinzasHerramientas de Fine Science11027-12
Glutaraldehído (C5H8O2 70 % en peso)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparina 30.000 unidades por 30 mlAPP Pharmaceuticals
Albúmina sérica humana (HSA)OctaPharma PlasmaAditivo de perfusión
IL2 Juego de tubos para perfusarAparato de Harvard733842
Sistema básico de perfusión pulmonar IPL-2Aparato
Harvard Ketamina 500 mg por 5 mlJHP Pharmaceuticals
Cánula de aurícula izquierdaAparato Harvard730712
Liqui-Cel Serie EXF G420 Contactor de membrana3MG420contactor de gas
solución de glucosa de dextrano bajo en potasio (perfadex)Solución XVIVOque lava el pulmón
Tubo recubierto de platino Masterflex (Tamaño: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-acetil-L-cisteína (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)Para lactato de Ringer modificado
Nalgene Vasos ( 10L, 20L)Bombarecipientes de filtración
&nbsp; Ismatec  ISM 827B
PES, 0,65 y micro; m Módulo TFFRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polietersulfona (PES), 0,2 y micro; m Módulo TFFRepligenN02-S20U-05-N
Polisulfona (PS), 500 kDa Módulo TFFRepligenN02-P500-05-N
Cloruro de potasio (KCl)Fisher Scientific7447-40-7para PBS
PowerLab 8/35  Instrumentos730045
cánula de la arteria pulmonarAparato Harvard730710
Tubo de cabeza de bomba (tamaño: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube  Ungüento oftálmicoDechraNA
TijerasHerramientas de ciencia fina14090-11
SCP Servocontrolador para perfusión tipo 704Aparato Harvard732806
Ventilador para animales pequeños modelo 683Aparato Harvard55-000
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)Para PBS y solución salina
Cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Ditionito de sodio (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Hidróxido de sodio (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2Para lactato
de Ringer modificadoLactato de sodio (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1Para lactato de Ringer modificado
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4para PBS
Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7para
PBS SomnoSuite Sistema de anestesia para animales pequeñosKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratasEnvigo
TAM-A módulo amplificador tipo 705/1Aparatode Harvard 73-0065
Amplificador de transductor TAM-D tipo 705/2Aparato de Harvard  73-1793
Módulo de control de tiempo TCM tipo 686Aparato Harvard731750
Cánula traquealAparato Harvard733557
Juego de tubos para cámara húmedaAparato Harvard  73V83157
Casete de tuboCole-ParmerIS 0649
Pinza #5 DumostarKent Scientific Corporation  Pinza INS500085-A
#5 de acero inoxidable, curvadaKent Scientific CorporationPinza de IND500232
#7 TitanioKent Scientific Corporation 
Tygon E-3603 Tubo de 2,4 mm de diámetro internoAparato de Harvard 721017línea de perfusión que ingresa al pulmón
Tygon E-3603 Tubo de 3,2 mm de diámetro internode 721019 líneaperfusión
Vannas-Tubingen Tijeras de resorte Herramientasfina15008-08
Módulo de control de ventilador VCM tipo 681Aparato de Harvard731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Aditivo perfusivo
Xilacina 100 mg por 1 mlAkorn
humanas de peristáltica de Nalgene INS600187 de de Harvard que sale del pulmón de ciencia

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Ex Vivo Lung PerfusionPolymerized HemoglobinOxygen CarrierLung TransplantationPerfusion SolutionPulmonary EdemaRat EVLP ModelPulmonary Vascular ResistanceLung ComplianceHemoglobin Based Perfusate

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