Este protocolo describe los procedimientos para aislar núcleos de alta calidad de islotes pancreáticos congelados de primates no humanos para su uso en la secuenciación simultánea de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, preservando la fracción citosólica a granel para análisis metabolómicos de las mismas muestras.
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Preparación de islotes fetales congelados de primates no humanos para la secuenciación combinada de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, y la metabolómica a granel
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Resumen
Resumen
Un reto en los estudios con tejido recogido de múltiples cohortes es evitar los efectos de lote cuando se preparan para experimentos multiómicos a gran escala, como la secuenciación combinada de ARN de una sola célula y la metabolómica. El método del estudio actual utiliza islotes pancreáticos congelados rápidamente de primates fetales no humanos recolectados durante un lapso de dos años para su entrada en la secuenciación de ARN de un solo núcleo y los ensayos de secuenciación ATAC. La fracción citosólica generada durante la extracción nuclear se retuvo para la electroforesis capilar posterior-espectrometría de masas y la posterior cuantificación de metabolitos. Este método permite el análisis masivo de metabolitos que contribuyen a los cambios en los paisajes transcriptómicos y epigenómicos dentro de las condiciones experimentales. Es aplicable a muchos tipos de tejidos y maximiza la cantidad de información que se puede extraer de muestras que no están fácilmente disponibles. A medida que se aprecia cada vez más la contribución del metabolismo al establecimiento de la identidad celular a través de modificaciones epigenéticas, son oportunas y necesarias técnicas que permitan identificar la contribución de metabolitos en tipos celulares específicos.
Introducción
Los islotes pancreáticos de Langerhans son fundamentales para el tratamiento de la tolerancia a la glucosa a lo largo de la vida. La falta de ajuste adecuado de los niveles de glucosa en sangre a través de la hormona reductora de la glucosa, la insulina, o la hormona que aumenta la glucosa, el glucagón, da lugar a la diabetes mellitus1. Los factores de riesgo modificables para minimizar el riesgo de diabetes incluyen el ejercicio y la dieta. Además, cada vez está más claro que la dieta materna durante el embarazo también tiene un efecto sobre la susceptibilidad de la descendencia a la diabetes en la edad adulta 2,3. Por lo tanto, se necesitan métodos para analizar los efectos de la dieta materna y otras exposiciones, como los medicamentos utilizados durante el embarazo, sobre las células beta productoras de insulina en organismos modelo durante el desarrollo. Por ejemplo, los islotes de crías fetales de primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) pueden evaluarse para determinar los efectos de las exposiciones al desarrollo. Al igual que los humanos, los NHP suelen tener partos únicos y varían en su respuesta fisiológica ala alimentación con dieta de estilo occidental. Si bien la gestación y el desarrollo fetal de los NHP comparten muchas similitudes con los humanos, lo que los convierte en una especie muy relevante para los estudios de programación metabólica, los desafíos para realizar ensayos bioinformáticos comparativos en la descendencia de NHP incluyen una temporada de apareamiento restringida y una recolección intermitente de muestras. Por lo tanto, los enfoques que permiten el almacenamiento a largo plazo antes del procesamiento y análisis de la muestra son ideales. Este protocolo describe la preparación de muestras para la secuenciación de ARN de un solo núcleo, la secuenciación ATAC y la metabolómica citoplasmática a granel.
Los estudios realizados por otros en el campo de la biología de los islotes han demostrado la superposición en las firmas genéticas observadas en muestras preparadas mediante secuenciación de ARN de una sola célula y secuenciación de ARN de un solo núcleo 5,6. Ambos métodos permiten la identificación de transcripciones que contribuyen a distinguir las características entre varios tipos de células dentro de la población de islotes. Mediante el uso de detergentes suaves en tejido ultracongelado, los núcleos intactos se pueden utilizar simultáneamente para la secuenciación de ATAC, lo que permite la determinación de regiones de cromatina accesibles. La combinación de la secuenciación de ARN de un solo núcleo con la secuenciación de ATAC permite una mejor caracterización de las redes reguladoras de genes7.
La preparación de muestras para la metabolómica se ha visto tradicionalmente limitada por la necesidad de una entrada de alto volumen de muestra para la cromatografía líquida. Además, se deben tener muy en cuenta los tampones utilizados durante la preparación de la muestra para evitar falsos picos de RMN en los datos de espectrometría de masas. Dado el bajo número de muestras que son difíciles y costosas de adquirir en los estudios con primates, la asignación de islotes de diferentes descendientes hacia experimentos transcriptómicos versus metabolómicos puede ser difícil. Por lo tanto, este protocolo hace uso de la fracción citosólica normalmente descartada generada durante el fraccionamiento celular para experimentos de un solo núcleo. Este método permite la caracterización simultánea de transcripciones y regiones abiertas de cromatina que definen subconjuntos celulares en los islotes fetales, al tiempo que mide cuantitativamente los metabolitos producidos dentro de los islotes (Figura 1). Este protocolo es una adaptación de un protocolo demostrado publicado por 10x genomics para el aislamiento de núcleos de tejido cerebral de ratón embrionario congelado rápidamente (versión CG000366 RevD 8)7.
Protocolo
La recuperación de islotes se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC) y la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y fue aprobada por la ONPRC IACUC. La ONPRC se rige por la Ley de Bienestar Animal y las Regulaciones aplicadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado y el Uso Humanitario del Laboratorio. El protocolo aquí se aplicó a los islotes de macacos Rhesus fetales que se necropsiaron en el día de gestación 145 (la gestación del macaco Rhesus suele ser de 173 a 175 días). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento de islotes
- Extirpe el páncreas fetal de los tejidos circundantes9 y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato helada.
- Extraer el páncreas del PBS e inflarlo con colagenasa P (0,6 mg/mL) mediante la canulación del conducto pancreático con un inyector de cánula cerebral de roedores de 33 G.
- Divida el páncreas en seis secciones con tijeras quirúrgicas estériles y digiera durante 27-30 min a 37 °C en solución de colagenasa.
- Prepare los medios RT combinando 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina en RPMI 1640.
- Vierta la colagenasa y agregue 10 mL de medio RT.
- Agite suavemente durante 1 minuto para interrumpir el tejido conectivo restante.
- Elimine el material no digerido colándolo a través de un filtro de 500 μm.
- Lave los islotes dos veces con 50 mL de medio RT.
- Incubar los islotes en DNasa I bovina (0,8 U/mL) en un baño de agua a 37 °C durante 10 min.
- Cultivar los islotes durante la noche en medio RT con DNasa I bovina (0.4 U/mL) a 37 °C con 5% de CO2.
- Envíe islotes en empaques especializados a temperatura ambiente con paquetes de gel de control de temperatura.
2. Banco de muestras para almacenamiento a largo plazo
- Evalúe el tamaño de los islotes utilizando una retícula escalada y observe el grado de tejido acinar y ductal en preparación.
- Seleccione los islotes a mano con una pipeta automática en una placa de 60 mm que contenga 5 mL de DMEM de glucosa de 2,8 mM.
NOTA: Es imperativo minimizar la cantidad de tejido acinar y tejido ductal que se almacenará en la preparación final de los islotes. Los detalles de los islotes ideales para su uso se informan en un protocolo anterior9. - Recoja los islotes en un tubo de 1,5 ml y gírelos a ~300 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Resuspendió los islotes en 1x PBS libre de calcio y magnesio.
- Centrifugar durante 5 min a ~300 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.3-2.5 dos veces más.
- Congele rápidamente los islotes en un tubo de 1,5 ml durante 10 s en nitrógeno líquido.
- Almacene el pellet a -80 °C hasta el día del aislamiento nuclear.
3. Fraccionamiento celular para el aislamiento de núcleos y fracción citoplasmática
- Preparación de tampones para la extracción de núcleos (Tabla 1).
- Asegúrese de que el banco, las pipetas y los reactivos estén libres de ARNasa.
- Prepare los tampones de lavado, lisis concentrada, dilución de lisis y núcleos diluidos de acuerdo con la Tabla 1.
- Prepare un tampón de lisis 0,1x en un tubo de 5 ml utilizando el tampón de dilución de lisis para diluir el tampón de lisis concentrado.
- Homogeneización de tejidos
- Retire las muestras del congelador a -80 °C y colóquelas inmediatamente en hielo.
- Añadir 500 μL de tampón de lisis 0,1x a los gránulos de tejido e incubar durante 3 min en hielo.
- Con un mortero de pellets desechable sin RNasa, homogeneice suavemente el tejido 15 veces en hielo.
- Incubar las muestras en hielo durante 10 min.
- Añadir 500 μL de tampón de lavado al homogeneizado y pipetear suavemente con hielo.
- Prepare un filtro de preseparación de 30 μm agregando 300 mL de tampón de lavado al filtro sobre un tubo de 5 mL.
- Filtre el homogeneizado celular de 1 mL utilizando el filtro de preseparación de 30 μM en el tubo de 5 mL.
- Centrifugar el homogeneizado filtrado a 500 x g durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante a 4 °C.
- Recolección y almacenamiento de sobrenadante para metabolómica
- Retire 1 mL del sobrenadante del paso 3.2.8 con una pipeta y agréguelo a un criovial de 1,5 mL sobre hielo.
- Congelar inmediatamente el sobrenadante a -80 °C. Este sobrenadante se utilizará para la metabolómica.
- Preparación de núcleos para la secuenciación de ARN y ATAC de un solo núcleo
- Vuelva a suspender suavemente el pellet de núcleos añadiendo 1 mL de tampón de lavado al pellet gota a gota. Pipetear lentamente 5 veces.
- Centrifugar el pellet lavado a 1000 x g durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante a 4 °C.
- Repita los pasos 3.4.1 y 3.4.2 una vez más.
- Después del lavado final, vuelva a suspender los núcleos en 1 mL de tampón de lavado. Mantener la preparación nuclear en hielo.
- Aspirar 10 μL de suspensión de núcleos con una pipeta y mezclar con 10 μL de azul de tripano al 0,4% pipeteando suavemente.
- Añada 10 μL de los núcleos y la mezcla de azul de tripano a un portaobjetos de contador de células automatizado con una pipeta y colóquelo en el instrumento.
- Determine la concentración de núcleos en núcleos/μL.
NOTA: A diferencia de las preparaciones celulares para la secuenciación de ARN de una sola célula, los contadores de células automatizados detectarán los núcleos como células muertas. No más del 95% de esta preparación debe estar viva en contadores de células automatizados. Si más del 5% de la población nuclear está viva, la suspensión de los núcleos puede filtrarse una vez más a través del filtro de preseparación de 30 μm y centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g a 4 °C. A continuación, la concentración de núcleos se puede recalcular como se indica en el paso 3.4.6. - En función de la recuperación deseada de los núcleos objetivo, vuelva a suspender los núcleos a la concentración necesaria utilizando un tampón de 1x núcleos y proceda a la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN de un solo núcleo y ATAC10.
4. Preparación de fracción citosólica para electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS)
- Combine 80 μL de fracción citosólica recogida en el paso 3.3.1 con 20 μL de agua nanopura que contenga patrones internalizados.
- Proceda con la CE-MS y el análisis como se describió anteriormente 11,12,13.
Resultados
La calidad de los resultados de la secuenciación depende en gran medida de la calidad de los insumos nucleares. La formación de burbujas nucleares y el daño a la membrana nuclear externa darán lugar a la contaminación ambiental del ARN y el ADN en el análisis, lo que introducirá ruido en los datos. Un extracto nuclear puro tendrá evidencia mínima de núcleos encapsulados con componentes citoplasmáticos (Figura 2A) o sobredigestión, evidenciada por núcleos estallados (Figura 2B). Una entrada nuclear ideal contendrá núcleos intactos (Figura 2C).
Los detalles del análisis de los datos de secuenciación de ARN y ATAC de un solo núcleo se proporcionan ampliamente en otros lugares 5,14. En la Figura 3A se ilustran grupos representativos de poblaciones celulares de una preparación nuclear NHP fetal a través de UMAP. Los datos metabolómicos se analizan fácilmente utilizando software de código abierto, como se describió anteriormente15. Los espectros generados se pueden visualizar, y los metabolitos enriquecidos en los islotes de un feto de una madre alimentada por WSD se pueden comparar con los de una madre alimentada por CD (Figura 3B-F).
Figura 1: Resumen del protocolo para el aislamiento de núcleos y fracción citosólica. Los islotes pancreáticos fetales se almacenaron a -80 °C hasta el día del ensayo. Los núcleos se aislaron y utilizaron para la secuenciación de ARN y ATAC de un solo núcleo. La fracción citosólica después del primer lavado del aislamiento de los núcleos se conservó para la electroforesis capilar-espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Demostración de la entrada adecuada de núcleos en un ensayo multiómico de un solo núcleo. Ejemplos de (A) Núcleo encapsulado por citoplasma, (B) Núcleo en estallido con membrana nuclear comprometida y (C) Núcleo intacto con morfología redondeada. Barras de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos representativos de la combinación de multiómica de un solo núcleo y metabolómica a granel. (A) Agrupamiento UMAP de subtipos celulares dentro de islotes NHP fetales aislados basado en la expresión génica. Estimación cuantitativa de los metabolitos glucolíticos, (B) Fosfato de dihidroxiacetona y (C) Glicerol-3-fosfato en la fracción citosólica de islotes fetales de NHP aislados cuando la madre fue alimentada con un WSD (mWSD) o un CD (mCD). La dieta materna también puede regular diferencialmente el metabolismo a través del ciclo del ácido cítrico (D) (2-oxoglutarato), (E) el metabolismo de los aminoácidos (creatina) y alterando el estado redox celular (F) (glutatión) en los islotes fetales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Formulaciones tampón para el aislamiento de núcleos. Se muestran los componentes detallados de los núcleos, la lisis, la dilución de lisis y los tampones de lavado. Si es necesario, diluya los reactivos hasta la concentración de existencias antes de preparar el tampón. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discusión
Históricamente, los métodos de aislamiento nuclear para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y ATAC han utilizado tampones que contienen detergentes que son incompatibles con la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), una técnica común utilizada para la cuantificación de metabolitos16,17. El protocolo actual permite la combinación de técnicas transcriptómicas y metabolómicas a partir de la misma preparación de la muestra mediante el uso de un detergente suave para el fraccionamiento celular, y seguir este fraccionamiento con electroforesis capilar, una técnica que requiere una entrada de muestra más pequeña en relación con la cromatografía líquida para la separación de metabolitos18.
El aspecto más crítico de este protocolo es la preservación de la membrana nuclear durante el aislamiento nuclear para evitar la degradación del material genético y reducir la contaminación por nucleótidos y macromoléculas ambientales. Los tiempos de exposición de la muestra al tampón de lisis se pueden modular para evitar la digestión excesiva de los tejidos y el daño de los núcleos. Además, la congelación rápida de los islotes durante el banco de muestras y del sobrenadante que contiene la fracción citosólica es imprescindible para evitar la degradación del material genético y los metabolitos. Todas las muestras deben recogerse de la misma formulación de medios (DMEM de glucosa de 2,8 mM en este estudio) para evitar el efecto de confusión de la alteración del metabolismo debido a la disponibilidad de nutrientes en los medios de cultivo.
Una limitación de este enfoque metabolómico combinado es que algunos metabolitos pueden no ser capturados debido al detergente utilizado para el aislamiento de los núcleos. Por lo tanto, para un análisis más completo de los metabolitos, este enfoque podría complementarse con análisis a partir de tejidos congelados y metabolitos aislados utilizando tampones de lavado no orgánicos y LC-MS. Un enfoque complementario recomendado es la metabolómica espacial dirigida a través de MALDI-MS para localizar cambios metabólicos dentro de los órganos19. Además, las tecnologías actuales para evaluar la variabilidad de la transcripción y la accesibilidad de la cromatina dentro del mismo núcleo son limitadas debido a la poca profundidad de secuenciación para la secuenciación ATAC. En los análisis de datos, los investigadores solo podrán evaluar regiones abiertas de cromatina dentro de grupos celulares amplios en lugar de subgrupos específicos dentro del conjunto de datos.
A medida que el uso de tejidos que no están fácilmente disponibles, en particular los de humanos y primates no humanos, se vuelve más frecuente, es imperativo maximizar la cantidad de información que se puede extraer de una réplica biológica. El enfoque multiómico descrito anteriormente permite a los investigadores correlacionar las firmas genéticas con la disponibilidad máxima en torno a los promotores clave de la identidad celular, al tiempo que considera cómo el metabolismo celular puede haber contribuido a tales cambios. La identificación de los metabolitos que son más abundantes dentro de las preparaciones celulares dará pistas sobre las modificaciones epigenéticas específicas que impulsarían la especificación de subtipos celulares para un linaje particular. De hecho, se han establecido nuevos protocolos para integrar los hallazgos de experimentos transcriptómicos y metabolómicos, aunque procedentes de diferentes fuentes de tejidos20. La importancia de este protocolo es que la accesibilidad de la cromatina, los cambios transcripcionales y el enriquecimiento de metabolitos se pueden evaluar a partir de una sola entrada de muestra. Las aplicaciones futuras de esta técnica permitirán una mejor caracterización de los estados de enfermedad en tejidos adquiridos de poblaciones de muestras dispersas, como los tejidos de pacientes con enfermedades raras. En el campo de la biología de los islotes, la caracterización de las redes reguladoras de genes y las firmas metabólicas que se correlacionan pueden proporcionar información crítica sobre los mecanismos de preservación de la identidad y la función de las células beta para evitar la aparición de diabetes.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a todo el equipo de la Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón por cuidar de la colonia de primates no humanos y por la adquisición de tejidos. Además, Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics proporcionó experiencia técnica y asesoramiento sobre diseño experimental. DTC contó con el apoyo de una beca predoctoral F31 de los NIH/NIDK (1F31DK135164). PK fue apoyado por el NIH/NIDDK (1R01DK128187). MG fue respaldado por un premio al Mérito de VA (I01 BX005399), el NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) y el JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). El trabajo en el Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC, por sus siglas en inglés) contó con el apoyo de P51OD011092 para el apoyo operativo del Centro.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inyector de cánula cerebral de rata de 33 G | Protech International | 8IC315IS5SPC | Para canulación de conductos e inflación del páncreas |
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher | 15-140-122 | Para medios RT |
| FBS | Millipore/Sigma | F4135-500ML | Para medios RT |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | Para medios RT |
| Colagenasa P | Sigma Aldrich | 11213865001 | Para la digestión del páncreas |
| Dnase I Bovino | Sigma Aldrich | 11284932001 | Para medios RT y aislamiento |
| Dextrosa | Fisher | D16-1 | concentración final será de 2,8 |
| mM Cloruro de calcio | Fisher | C4901-500G | La concentración final será de 0,5 mM |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final la concentración será de 10 mM |
| Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción 5 | Investigación Internacional | A30075100 | La concentración final será de 0,5 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | Para la selección manual de islotes |
| 20x Nuclei Buffer | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Digitonina (5%) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | Es posible que sea necesario calentar la digitonina a 65 °C; C para disolver el precipitado blanco |
| MACS SmartStrainers (30 µ M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Solución madre (10%) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | Prepare un caldo al 10% utilizando agua MilliQ |
| Solución de clorhidrato de Trizma, pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| Solución de cloruro de sodio, 5 m | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| Solución de cloruro de magnesio, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Sigma Protector Inhibidor de la rnasa | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | Research Products International | D11000-5.0 | |
| Morteros de pellets desechables sin ARNasa | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Biorreactivos Fisher | BP337-500 | Prepare un caldo del 20 % con agua MilliQ |
| Agua sin nucleasas | Promega | PR-P1193 | |
| Tubos DNA LoBind (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
| Cryoviales (1,5 mL) | VWR | 20170-225 | |
| Tubos Posi-Click (0,6 mL) | Denville | C-2177 | |
| Azul Trypan (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| portaobjetos de recuento de células de doble cámara | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ Sistema de agua ultrapura | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
| Filtro de corte de 5 kDa | HMT Metabolome Technologies | ||
| Metabolome Technologies | |||
| Pipetas P10, P20, P200 y P1000 | Eppendorf | 2231000602 | |
| Puntas de pipeta, 10 y micro; L | VWR | 76322-528 | |
| Puntas de pipeta, 1000 y micro; L | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
| Puntas de pipeta, 20 µ L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| Puntas de pipeta, 200 y micro; L | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Microscopio de contraste de fase | Olympus | BX41-PH-B | |
| Countess II Contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Centrífuga Allegra X-30R | Beckman-Coulter | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
