Este protocolo describe los procedimientos para aislar núcleos de alta calidad de islotes pancreáticos congelados de primates no humanos para su uso en la secuenciación simultánea de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, preservando la fracción citosólica a granel para análisis metabolómicos de las mismas muestras.
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Artículo de método
Preparación de islotes fetales congelados de primates no humanos para la secuenciación combinada de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, y la metabolómica a granel
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Resumen
Resumen
Un reto en los estudios con tejido recogido de múltiples cohortes es evitar los efectos de lote cuando se preparan para experimentos multiómicos a gran escala, como la secuenciación combinada de ARN de una sola célula y la metabolómica. El método del estudio actual utiliza islotes pancreáticos congelados rápidamente de primates fetales no humanos recolectados durante un lapso de dos años para su entrada en la secuenciación de ARN de un solo núcleo y los ensayos de secuenciación ATAC. La fracción citosólica generada durante la extracción nuclear se retuvo para la electroforesis capilar posterior-espectrometría de masas y la posterior cuantificación de metabolitos. Este método permite el análisis masivo de metabolitos que contribuyen a los cambios en los paisajes transcriptómicos y epigenómicos dentro de las condiciones experimentales. Es aplicable a muchos tipos de tejidos y maximiza la cantidad de información que se puede extraer de muestras que no están fácilmente disponibles. A medida que se aprecia cada vez más la contribución del metabolismo al establecimiento de la identidad celular a través de modificaciones epigenéticas, son oportunas y necesarias técnicas que permitan identificar la contribución de metabolitos en tipos celulares específicos.
Introducción
Los islotes pancreáticos de Langerhans son fundamentales para el tratamiento de la tolerancia a la glucosa a lo largo de la vida. La falta de ajuste adecuado de los niveles de glucosa en sangre a través de la hormona reductora de la glucosa, la insulina, o la hormona que aumenta la glucosa, el glucagón, da lugar a la diabetes mellitus1. Los factores de riesgo modificables para minimizar el riesgo de diabetes incluyen el ejercicio y la dieta. Además, cada vez está más claro que la dieta materna durante el embarazo también tiene un efecto sobre la susceptibilidad de la descendencia a
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Protocolo
La recuperación de islotes se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC) y la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y fue aprobada por la ONPRC IACUC. La ONPRC se rige por la Ley de Bienestar Animal y las Regulaciones aplicadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado y el Uso Humanitario del Laboratorio. El protocolo aquí se aplicó a los islotes de macacos Rhesus fetales que se necropsiaron en el día de gestación 145 (la....
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Resultados
La calidad de los resultados de la secuenciación depende en gran medida de la calidad de los insumos nucleares. La formación de burbujas nucleares y el daño a la membrana nuclear externa darán lugar a la contaminación ambiental del ARN y el ADN en el análisis, lo que introducirá ruido en los datos. Un extracto nuclear puro tendrá evidencia mínima de núcleos encapsulados con componentes citoplasmáticos (Figura 2A) o sobredigestión, evidenciada por núcleos estallados (Figu.......
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Discusión
Históricamente, los métodos de aislamiento nuclear para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y ATAC han utilizado tampones que contienen detergentes que son incompatibles con la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), una técnica común utilizada para la cuantificación de metabolitos16,17. El protocolo actual permite la combinación de técnicas transcriptómicas y metabolómicas a partir de la misma preparación de.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a todo el equipo de la Universidad de Ciencias de la Salud de Oregón por cuidar de la colonia de primates no humanos y por la adquisición de tejidos. Además, Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics proporcionó experiencia técnica y asesoramiento sobre diseño experimental. DTC contó con el apoyo de una beca predoctoral F31 de los NIH/NIDK (1F31DK135164). PK fue apoyado por el NIH/NIDDK (1R01DK128187). MG fue respaldado por un premio al Mérito de VA (I01 BX005399), el NIH/NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) y el JDRF (2-SRA-2024-1455-S-B). El trabajo en el Centro Nacional de Investigación de Primates d....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inyector de cánula cerebral de rata de 33 G | Protech International | 8IC315IS5SPC | Para canulación de conductos e inflación del páncreas |
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher | 15-140-122 | Para medios RT |
| FBS | Millipore/Sigma | F4135-500ML | Para medios RT |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | Para medios RT |
| Colagenasa P | Sigma Aldrich | 11213865001 | Para la digestión del páncreas |
| Dnase I Bovino | Sigma Aldrich | 11284932001 | Para medios RT y aislamiento |
| Dextrosa | Fisher | D16-1 | concentración final será de 2,8 |
| mM Cloruro de calcio | Fisher | C4901-500G | La concentración final será de 0,5 mM |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final la concentración será de 10 mM |
| Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción 5 | Investigación Internacional | A30075100 | La concentración final será de 0,5 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | Para la selección manual de islotes |
| 20x Nuclei Buffer | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Digitonina (5%) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | Es posible que sea necesario calentar la digitonina a 65 °C; C para disolver el precipitado blanco |
| MACS SmartStrainers (30 µ M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Solución madre (10%) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | Prepare un caldo al 10% utilizando agua MilliQ |
| Solución de clorhidrato de Trizma, pH 7.5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| Solución de cloruro de sodio, 5 m | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| Solución de cloruro de magnesio, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Sigma Protector Inhibidor de la rnasa | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | Research Products International | D11000-5.0 | |
| Morteros de pellets desechables sin ARNasa | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Biorreactivos Fisher | BP337-500 | Prepare un caldo del 20 % con agua MilliQ |
| Agua sin nucleasas | Promega | PR-P1193 | |
| Tubos DNA LoBind (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
| Cryoviales (1,5 mL) | VWR | 20170-225 | |
| Tubos Posi-Click (0,6 mL) | Denville | C-2177 | |
| Azul Trypan (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| portaobjetos de recuento de células de doble cámara | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ Sistema de agua ultrapura | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
| Filtro de corte de 5 kDa | HMT Metabolome Technologies | ||
| Metabolome Technologies | |||
| Pipetas P10, P20, P200 y P1000 | Eppendorf | 2231000602 | |
| Puntas de pipeta, 10 y micro; L | VWR | 76322-528 | |
| Puntas de pipeta, 1000 y micro; L | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
| Puntas de pipeta, 20 µ L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| Puntas de pipeta, 200 y micro; L | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Microscopio de contraste de fase | Olympus | BX41-PH-B | |
| Countess II Contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Centrífuga Allegra X-30R | Beckman-Coulter | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Referencias
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L.
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Reimpresiones y permisos
