Artículo de método

Extracción y detección de geosmina y 2-metilisoborneol en agua y peces utilizando sondas de extracción por sorción de alta capacidad y GC-MS

DOI:

10.3791/67280

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3 de julio de 2025

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1Aquaculture Research Institute, University of Maine, 2Markes International Ltd, 3Markes International GmbH, 4USDA-ARS-National Cold Water Marine Aquaculture Center

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta un flujo de trabajo totalmente automatizado para la extracción de geosmina y 2-metilisoborneol del agua y tejidos de peces ricos en lípidos. El método permite la detección temprana de estas moléculas antes de que alcancen los umbrales de olor. Se proporcionan datos representativos de un entorno acuícola.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La geosmina y el 2-metilisoborneol son compuestos orgánicos volátiles de origen microbiano que se encuentran con frecuencia en los sistemas acuícolas de recirculación y confieren olores y sabores desagradables a los peces en ellos, incluso en concentraciones extremadamente bajas. Los métodos analíticos existentes para estos compuestos en los peces luchan por lograr un rendimiento suficiente de las muestras y, a menudo, no están automatizados, lo que requiere una amplia preparación práctica. Hemos desarrollado métodos para analizar la geosmina y el 2-metilisoborneol de tejidos acuáticos y de peces, respectivamente, utilizando una sonda metálica con una fase de extracción de sorción de alta capacidad. Se logró una detección robusta y cuantitativa tanto en el agua como en los tejidos de los peces, con límites mínimos de detección de 1,2 ng/L para la geosmina y de 1,1 ng/L para el 2-metilisoborneol del agua y de 18,1 ng/kg y 13,6 ng/kg, respectivamente, del tejido de los peces. Estas concentraciones estaban muy por debajo de los umbrales de detección humana. Por lo tanto, concluimos que estos métodos podrían detectar la geosmina y el 2-metilisoborneol antes de que fueran perceptibles para los humanos. A diferencia de otras técnicas de extracción por sorción de alta capacidad, como la extracción por sorción con barra agitadora, esta técnica es totalmente automatizable, lo que mejora drásticamente el rendimiento y evita los errores de manipulación manual, mientras que el diseño duradero de la sonda evita la rotura, como es común con la fibra de microextracción en fase sólida (SPME). Este método es adecuado para el monitoreo de olores en todos los entornos de calidad del agua, así como para la detección de compuestos de sabor desagradable en matrices sólidas y semisólidas.

Introducción

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La geosmina (GSM) y el 2-metilisoborneol (MIB) se encuentran de forma natural en el agua y los suelos como subproductos del metabolismo microbiano 1,2. Si bien generalmente no son peligrosos para el medio ambiente o la salud humana, imparten olores y sabores desagradables "terrosos" y "fangosos" al agua, que son perceptibles incluso a concentraciones extremadamente bajas, tan bajas como 10 y 20 ng/L para GSM y MIB, respectivamente 3,4. Como tal, la presencia de estos odorantes reduce la calidad percibida del agua y es altamente indeseable en la mayoría de los contextos. En las vías navegables interiores, los odorantes reducen el atractivo para los visitantes y pueden provocar quejas ante las autoridades ambientales5, mientras que en el agua potable, los odorantes transmiten un olor y sabor desagradables que los consumidores consideran inaceptables6. De hecho, muchos países han impuesto límites regulatorios a los niveles de odorantes en el agua potable, y China estipula 10 ng/L como la concentración máxima GSM permitida7.

Los sistemas de acuicultura de recirculación (RAS) son cada vez más importantes en la industria acuícola como medio de producción de peces. Estos sistemas operan en tierra y reutilizan continuamente el agua, reduciendo así el impacto ambiental, pero se requiere un filtrado extenso del agua RAS para mantener las condiciones óptimas para la cría de peces. Los biofiltros de lecho móvil son colonizados por microbios debido a la abundancia de nutrientes en las heces de los peces y en los alimentos no consumidos8. Estos microbios son beneficiosos para la eliminación de residuos nitrogenados y exceso de nutrientes; sin embargo, algunas especies pueden producir GSM, MIB y otros odorantes4. Estos odorantes luego se filtran en el agua y se absorben en la carne del pescado, donde pueden impartir características de olor y sabor desagradables que los consumidores encuentran objetables. Los valores del umbral de olor en la carne de pescado dependen de la especie, pero los valores para el salmón del Atlántico, una especie común en los RAS, son de 44 a 500 ng/kg para GSM y de >900 ng/kg para MIB4. Por lo tanto, los operadores de RAS deben controlar periódicamente las concentraciones de GSM y MIB en sus sistemas para asegurarse de que no alcancen niveles problemáticos4. El pescado afectado se puede purgar de los compuestos desagradables antes de la cosecha para recuperar la calidad del filete; Sin embargo, este es un proceso costoso que requiere que la instalación detenga la recirculación de agua y, en su lugar, haga fluir agua nueva a través del sistema durante 10 a 14 días9. Dado que GSM y MIB presentan un problema persistente y económicamente costoso en una amplia gama de industrias, tiene sentido reevaluar y mejorar los métodos analíticos para la detección. Idealmente, los operadores de RAS deberían ser capaces de monitorear tanto el agua de RAS para identificar el aumento de las concentraciones de GSM y MIB antes de que se conviertan en problemáticas, como los tejidos de los peces para determinar si los niveles de GSM y MIB han afectado la calidad del producto y en qué medida.

La mayoría de los métodos para la detección de GSM y MIB utilizan cromatografía de gases (GC) con un espectrómetro de masas (MS) o un detector de ionización de llama (FID) para la separación y detección, pero la forma en que los odorantes se extraen inicialmente de la matriz de agua varía mucho, con muchos métodos publicados10. El hecho de que se haya probado tal variedad de métodos y, de hecho, todavía se utilicen de manera rutinaria habla del hecho de que cada uno tiene inconvenientes significativos. Estos inconvenientes incluyen el requisito de un gran tamaño de muestra y grandes volúmenes de disolvente, como en la extracción líquido-líquido (LLE), baja sensibilidad e interferencia de agua, como en los métodos basados en el espacio de cabeza, o problemas extensos con el arrastre y la contaminación del sistema, como en la purga y la trampa (P y T).

La extracción por sorción abarca una serie de técnicas de extracción en las que se puede utilizar una fase de adsorción sólida para extraer odorantes del espacio de cabeza por encima de una muestra o de la propia muestra mediante inmersión directa10. Estas técnicas son compatibles con volúmenes de muestra más pequeños que otras técnicas, no requieren solventes y, por lo general, no se ven gravemente afectadas por la interferencia del agua. Sin embargo, la forma más común de extracción por sorción, la microextracción en fase sólida (SPME), utiliza solo un pequeño volumen de fase de adsorción con baja capacidad de analitos, lo que limita la eficiencia de la extracción. Además, las fibras frágiles involucradas pueden dañarse o romperse11, interrumpiendo los flujos de trabajo. La extracción por sorción con barra agitadora (SBSE) supera estas dificultades con un mayor volumen de fase y un diseño más duradero, pero no es fácilmente automatizable, ya que requiere la transferencia manual de las barras agitadoras a las muestras y de las muestras a los tubos de desorción térmica12. En el contexto del cribado rutinario del agua, donde el alto rendimiento es crucial, esta falta de automatización es una barrera significativa.

El objetivo de nuestro método es mejorar los métodos antes mencionados con respecto al rendimiento de la muestra y la capacidad general de extracción por sorción. Por lo tanto, desarrollamos una técnica que utiliza sondas de extracción por sorción de alta capacidad (HCSE), combinando la alta capacidad de analito y la robustez de SBSE con la selección de fase y la automatización de SPME para el análisis cuantitativo y de alto rendimiento de GSM y MIB. Con algunas modificaciones, la técnica se puede aplicar tanto a muestras de agua como a muestras de tejido de peces homogeneizados. Aquí, describimos el protocolo en su totalidad y presentamos datos de validación que demuestran que es reproducible, lineal y altamente sensible. Aunque las muestras de acuicultura se utilizan con fines de demostración aquí, el protocolo es adecuado para monitorear los odorantes en una amplia gama de tipos de muestras, incluidas aguas, suelos y diversos productos alimenticios. Gracias a la automatización completa, el protocolo es particularmente beneficioso cuando se espera que el número de muestras sea alto.

Protocolo

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Las muestras de peces se recolectaron de animales que ya habían sido sacrificados para el consumo humano. Por lo tanto, no se requería ninguna autorización ética.

1. Preparación de la calibración y de los patrones internos

  1. Preparación del estándar de calibración
    1. Prepare la solución madre C1 añadiendo 10 μL de geosmina y solución de 2-metilisoborneol (100 μg/mL) a un matraz aforado de 100 mL y llene hasta el volumen con metanol de grado LC-MS. La solución resultante contendrá cada analito a 10 μg/L (ppb).
    2. Prepare los patrones de calibración añadiendo la solución madre C1 en el volumen indicado en la Tabla 1 a un matraz aforado de 100 ml y llenando hasta el volumen con agua desionizada.
    3. Prepare nuevos patrones de calibración a diario, ya que son extremadamente perecederos.
      NOTA: Es importante preparar estas soluciones madre frescas todos los días.
  2. Preparación de normas internas
    1. Prepare la solución madre (I1) añadiendo 10 mg de 2-isopropil-3-metoxipirazina (IPMP) (>98% de pureza) a un matraz aforado de 1 L lleno hasta el volumen con metanol de grado LC-MS, haciendo un caldo de 10 mg/L.
    2. Pipetear 100 μL de solución I1 en un matraz aforado de 100 mL y llenar hasta llenar con agua desionizada para dar solución I2 (10 μg/L). Inyecte 50 μL en cada vial de muestra para alcanzar una concentración final de 100 ng/L.

2. Análisis del agua

  1. Preparación de la muestra
    1. Coloque un vial de 20 ml por cada muestra de agua que se esté analizando en la bandeja de muestras.
    2. Usando una báscula calibrada, pese y coloque 2,5 g de NaCl en cada vial de muestra de 20 ml con tapa engarzada.
      NOTA: La adición de sal mejora la transferencia de la MIB y la geosmina del agua al espacio de cabeza.
    3. Con una pipeta o un dispensador de tapa de botella, agregue 5 ml de agua de muestra a cada vial de muestra de 20 ml con tapa engarzada.
    4. Pipetear 50 μL de la solución patrón interna I2 para cada muestra, patrón de calibración y cualquier muestra de QA/QC, incluidos los blancos.
    5. Coloque la tapa en la parte superior del vial y séllela con una herramienta de engarzado de viales para minimizar la pérdida de analitos.
    6. Solo procese 1-2 muestras a la vez y selle rápidamente cada vial una vez completado para minimizar la pérdida de analitos volátiles.
  2. Extracción de analitos (agua)
    1. Coloque la bandeja de muestras en el soporte de la bandeja del muestreador automático.
    2. Para preparar un método de instrumento, abra el programa de instrumento y haga clic en el Editor de métodos.
      1. Cree un nuevo método introduciendo los siguientes parámetros en el editor de métodos (dejando otros parámetros en sus valores predeterminados):
      2. En 'Premuestreo', establezca el tiempo de agitación del vial en 10 minutos para permitir que los analitos se dividan desde el agua hasta el espacio de cabeza.
      3. En 'Muestreo', ajuste la temperatura de incubación a 65 °C, el tiempo de incubación a 30 min y la velocidad del agitador a 400 rpm.
      4. Asegúrese de que la opción 'wash HiSorb probe' esté habilitada; De lo contrario, la matriz de muestra residual puede contaminar el sistema.
      5. En 'Desorción de sonda', ajuste el tiempo de desorción a 15 min y latemperatura de desorción D a 270 °C.
      6. En la configuración de la trampa, ajuste la temperatura baja de la trampa a 25 °C y el "flujo dividido" a 8 mL/min.
    3. Ejecute el método de muestreador automático junto con el método GC-MS pulsando el botón Inicio en cada uno de los programas respectivos.

3. Análisis de tejidos de peces

  1. Preparación de la muestra
    1. Coloque un vial de 20 ml para cada muestra de pescado que se esté analizando en la bandeja de muestras.
    2. Homogeneice el tejido de pescado utilizando un procesador de alimentos disponible en el mercado.
    3. Usando una báscula calibrada, pese 1,00 g de tejido de pescado homogeneizado en cada vial.
    4. Pipetear 5 mL de solución saturada de NaCl en cada vial.
    5. Pipetear 100 μL de la solución patrón interna I2 en cada muestra, muestra de calibración y cualquier muestra de QA/QC.
    6. Coloque una tapa en la parte superior del vial y séllela con la herramienta de engarzado de viales.
    7. Prepare solo 1-2 muestras a la vez para reducir la pérdida de compuestos semivolátiles y volátiles.
  2. Extracción de analitos (peces)
    1. Coloque la bandeja de muestras en el soporte de la bandeja del muestreador automático.
    2. Prepare un método de instrumento de la siguiente manera (dejando otros parámetros en sus valores predeterminados).
      NOTA: El tiempo de agitación y la temperatura de incubación del vial previo a la toma de muestras difieren de la sección 2.2.2.
      1. En 'Premuestreo', ajuste el tiempo de agitación del vial a 20 min.
      2. En 'Muestreo', ajuste la temperatura de incubación a 80 °C, el tiempo de incubación a 30 min y la velocidad del agitador a 400 rpm.
      3. Asegúrese de que la "sonda de lavado HiSorb" esté habilitada, de lo contrario, la matriz de muestra residual puede contaminar el sistema.
      4. En 'Desorción de sonda', establezca el tiempo de desorción en 15 min y la temperatura de desorción en 270 °C.
      5. En la configuración de la trampa, ajuste la temperatura baja de la trampa a 25 °C y divida el flujo a 8 mL/min.
        NOTA: En este caso, se requiere un paso de premuestreo más largo y caliente debido a la mayor afinidad de MIB y GSM por los tejidos de pescado ricos en lípidos en comparación con el agua.
    3. Ejecute el método de muestreador automático junto con el método GC-MS presionando el botón Inicio en cada uno de los programas respectivos.

4. Separación y detección mediante GC-MS

  1. Utilice los mismos parámetros de GC-MS para los métodos de agua y tejido de peces.
  2. Asegúrese de que el GC esté equipado con una columna de 5MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm y que esté alimentado con gas portador de helio ultrapuro. Ajuste el caudal del portador a 2 mL/min.
  3. Prepare un programa de horno GC de la siguiente manera: una temperatura inicial de 60 °C, mantenida durante 3 minutos, luego una rampa de temperatura de 10 °C/min a 100 °C, luego de 20 °C/min a 190 °C, luego de 30 °C/min a 280 °C, con un tiempo de espera final de 2 min. El tiempo total de ejecución se establece en 16,5 min.
  4. Ajuste la línea de transferencia entre GC y MS a 280 °C y la fuente de iones y el cuádruple a 250 °C y 200 °C, respectivamente.
  5. Para la detección de MS en el modo de escaneo, utilice un rango de escaneo de m/z 50-350.
  6. Para el funcionamiento seleccionado de la monitorización de iones (SIM), utilice iones de cuantificación y confirmación, respectivamente, de m/z 95 y 107 para MIB, m/z 137 y 152 para IPMP, y m/z 112 y 55 para GSM.
    NOTA: Muchos paquetes de software de cromatografía cuentan con selección automática de picos, pero se recomienda encarecidamente revisar manualmente la selección de picos en busca de errores.

Resultados

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Optimización de métodos

Se han llevado a cabo varios experimentos para garantizar que el método esté optimizado, incluida una evaluación de arrastre, la optimización del tiempo de desorción de la sonda, una evaluación del estándar interno, una evaluación de la fase de la sonda, una evaluación de la linealidad y la repetibilidad, y el cálculo del límite de detección del método.

Evaluación de arrastre

Comenzamos nuestro experimento con una temperatura de desorción de la sonda de 250 °C. Se prepararon patrones de calibración, como se muestra en la Tabla 1. Para evaluar el arrastre, analizamos los estándares GSM y MIB a 20 ng/L y luego procedimos, en orden, a una ejecución de los parámetros GC-MS sin inyectar nada en la columna (columna en blanco), una desorción de la trampa de enfoque sin transferir nada del inyector (trampa en blanco), un calentamiento del inyector sin insertar una sonda (inyector en blanco), y una desorción de la sonda sin muestreo previo (sonda en blanco). Se observó menos del 1% de arrastre en la columna en blanco, el blanco de trampa y el blanco de inyector, pero en el blanco de sonda, el arrastre fue de 9.35% y 3.77% para GSM y MIB, respectivamente (Tabla 2). Por lo tanto, determinamos que hubo un arrastre significativo de GSM en la sonda PDMS en las condiciones utilizadas.

Optimización del tiempo de desorción

Una vez identificado el arrastre en la sonda PDMS, tratamos de resolverlo ajustando la temperatura de desorción de la sonda. Se esperaría que una temperatura de desorción de la sonda más alta aumentara la tasa de desorción del analito de la sonda, de modo que la desorción sería más completa al final del tiempo de desorción de la sonda de 15 minutos. Sin embargo, una temperatura más alta también podría promover la descomposición del analito y, por lo tanto, afectar negativamente la sensibilidad. Las temperaturas más altas también pueden dañar los materiales de adsorción, por lo que deben evitarse temperaturas superiores a 280 °C. El arrastre de GSM fue significativo a la temperatura de desorción de la sonda de 250 °C, pero esto se redujo sustancialmente a muy por debajo del umbral de aceptabilidad del 5% cuando se utilizó 270 °C en su lugar (Figura 1). Esta mejora se logró sin pérdida de sensibilidad, ya que las áreas de pico producidas para el análisis inicial no fueron más pequeñas a 270 °C que para temperaturas de desorción de sonda más bajas (Figura 1). Esto indica que cualquier aumento en la descomposición del analito es insignificante.

Uso de la norma interna

El compuesto 2-isopropil-3-metoxipirozina se ha empleado ampliamente como patrón interno durante la detección de GSM y MIB13. Comparamos las concentraciones calculadas de GSM y MIB con las concentraciones de picos conocidas, con y sin corrección estándar interna. La recuperación sin corrección estándar interna fue pobre, con concentraciones calculadas en el 60% de las concentraciones pico conocidas (Figura 2). Por el contrario, con la corrección estándar interna aplicada, la recuperación fue muy buena, en la región del 100%. Por lo tanto, aplicamos la corrección del estándar interno en todos los análisis futuros.

Selección de fase

En los análisis SPME, a menudo se agregan carbono de amplio rango (CWR) y/o divinilbenceno (DVB) al PDMS para mejorar la sensibilidad, pero esto aumenta el costo. Se buscó comparar las sondas de PDMS solo con las sondas de triple fase (DVB/CWR/PDMS), considerando que el aumento del volumen de fase de la sonda probablemente mejore la sensibilidad en comparación con las fibras SPME. Los datos de recuperación para PDMS y sondas trifásicas (Figura 3) ilustran un rendimiento muy similar entre los dos tipos de sondas, con recuperaciones ligeramente más cercanas al 100% con las sondas PDMS. Por lo tanto, dado el rendimiento ligeramente superior y los costos reducidos, realizamos todos los análisis futuros con sondas PDMS. Debe tenerse en cuenta que, dado que la sonda recolecta analitos del espacio de cabeza y no a través del contacto directo con la matriz de la muestra, la cinética de la partición GSM / MIB al material de fase no debe diferir entre las muestras de agua y de peces.

Validación de métodos

Se analizó una serie de calibración que abarcó seis concentraciones de analitos en agua de 1 a 100 ng/L (Figura 4). Se logró una excelente linealidad, con r2 de 0,9999 para GSM y 0,9999 para MIB. El error estándar de regresión fue de 0,43 y 0,37 para GSM y MIB, respectivamente. Esto indica que el método es adecuado para análisis cuantitativos en el rango evaluado. Determinamos la repetibilidad a partir de ocho réplicas de patrones de laboratorio que contenían GSM y MIB a 40 ng/L en agua. Los valores de RSD fueron del 6,3% para GSM y del 4,8% para MIB, lo que demuestra una notable reproducibilidad de los resultados. Estas réplicas se analizaron en tres lotes separados en diferentes días, lo que demuestra aún más la precisión del método. Por lo tanto, el análisis HCSE con GC-MS es un método cuantitativo y confiable.

Límites mínimos de detección (MDL)

El MDL se calculó según el protocolo14 de la EPA de EE. UU. utilizando agua enriquecida (n = 10) o muestras de peces con picos (n = 11). El método de extracción y detección de GSM y MIB en el agua produjo límites de detección de 1,2 ng/L para GSM y 1,1 ng/L para MIB. Estos MDL estaban muy por debajo de los valores umbral de olor humano de aproximadamente 10 y 20 ng/L, respectivamente. Por lo tanto, el método propuesto puede detectar con confianza y cuantitativamente la acumulación de estas moléculas olorosas antes de que alcancen los umbrales sensoriales humanos. Límites de detección para la extracción y detección de GSM y MIB de peces producidos: límites de 18,1 ng/kg para GSM y 13,6 ng/kg para MIB.

Análisis de muestras de agua procedentes de la acuicultura

Analizamos muestras de agua tomadas de siete sistemas acuícolas de recirculación, con cinco réplicas (sistema 3) o tres réplicas (todos los demás sistemas) evaluadas para cada uno. Todos menos uno de los sistemas de acuicultura de recirculación analizados contenían geosmina y MIB en concentraciones superiores a nuestro MDL (Figura 5), lo que indica un problema potencial con la calidad del agua. Sin embargo, observamos que en todos los casos, el MIB estaba muy por debajo del umbral de olor humano de 20 ng/L, mientras que solo un sistema superó el umbral de olor GSM de 10 ng/L (sistema 1, concentración GSM = 12,69 ng/L). Si bien detectamos GSM y MIB en el sistema 3, observamos que la concentración de MIB cae por debajo de nuestros MDL calculados y, por lo tanto, la concentración no se puede cuantificar con seguridad. El método demostró una precisión impresionante en todos los sistemas a pesar del uso de muestras de agua del mundo real con muy poca variación en la concentración calculada entre las muestras replicadas en cada sistema (Figura 5).

Análisis de tejidos de peces

El tejido de pescado, rico en lípidos, imparte un fuerte efecto de matriz que impide la extracción de GSM y MIB durante este método. Por esa razón, se realizan cambios sutiles en el método para aumentar la eficiencia de la extracción, incluida una temperatura de incubación más alta (80 ° C) y un tiempo de incubación más largo (20 min) en comparación con el método de extracción con agua. Los tejidos de los peces se analizaron previamente para determinar las concentraciones de fondo GSM y MIB. Esas mismas muestras se enriquecieron con una cantidad conocida de GSM y MIB y se analizaron por triplicado para determinar el porcentaje de recuperación y la precisión (Figura 6).

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Figura 1: Efecto de la temperatura de desorción de la sonda en el arrastre. (A) Se analizó un estándar de laboratorio que contenía GSM y MIB a 20 ng/L a una de las tres temperaturas de desorción de la sonda por triplicado, con áreas de pico medias. Posteriormente, cada sonda se desorbió dos veces más a la temperatura inicial para evaluar el arrastre con resultados en (B) (GSM) y (C) (MIB). El arrastre se expresa como el área de pico como un porcentaje del área de pico inicial. Las barras de error representan la desviación estándar en tres réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Uso estándar interno. Comparación de datos de recuperación de datos corregidos frente a datos no corregidos para estándares analíticos a 15 o 40 ng/L, con extracción solo por sondas PDMS. Las concentraciones de las muestras se corrigieron con el uso de IPMP como patrón interno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Figura 3: Recuperación del analito. Datos de recuperación para patrones analíticos de GSM (izquierda) y MIB (derecha) a 15 ng/L, con extracción por sondas de solo PDMS o trifásicas (PDMS, DVB, CWR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Curvas de calibración analítica. Regresiones lineales de las curvas de calibración para GSM (línea continua, r2 de 0,9999; S=0,37) y MIB (línea discontinua, r2 de 0,9999; S=0,37). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Aplicación de agua para acuicultura. Concentraciones de (A) GSM y (B) MIB en muestras de agua tomadas de siete sistemas de acuicultura (n ≥ 3 para cada sistema). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

figure-results-6
Figura 6:  Aplicación de tejido de pescado. Concentraciones de GSM y MIB de dos muestras de peces enriquecidas con GSM y MIB (F1 y F2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la soluciónVolumen de stock C1 añadidoVolumen totalConcentración resultante
Culata C110ul100 ml10 ug/ml
Cal 110 ul100 ml1 ng/L
Cal 220 ul100 ml2ng/L
Cal 550 ul100 ml5 ng/L
Cal 10100 ul100 ml10 ng/L
Cal 20200 ul100 ml20 ng/L
Cal 50500 UL100 ml50 ng/L
Cal 1001000 ul100 ml100 ng/L
Cal 2002000 UL100 ml200 ng/L

Tabla 1: Patrones de calibración. Los patrones de geosmina y 2-MIB se elaboraron a partir de una solución de CRM47525 geosmina y 2-metilisoborneol (100 μg/mL) en metanol que se diluyó en una solución madre C1 (10 μg/ml) en metanol.

AnálisisTraspaso (%)
GSM (en inglés)MIB
Ejecución de GC0.040.08
Desorción de trampas0.090
Desorción de entrada00
Redesorción de sondas9.353.77

Tabla 2: Evaluación de arrastre de sondeo. Arrastre después de la extracción, desorción y análisis GC-MS de un patrón de laboratorio que contiene GSM y MIB a 20 ng/L, con IPMP estándar interno a 30 ng/L. Las descripciones de los análisis se dan en 2.2.1.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GSM y MIB son compuestos de sabor desagradable que se encuentran en una amplia gama de entornos de monitoreo de agua, y la demanda de capacidad de prueba es alta. Además, GSM y MIB son perceptibles para los humanos a niveles de trazas. Por lo tanto, un sistema analítico ideal debe combinar una alta sensibilidad con un alto rendimiento para producir grandes volúmenes de datos de calidad. Hemos demostrado en secciones anteriores que la extracción con sondas HCSE proporciona una sensibilidad que supera lo que se requiere.

El diseño robusto de las sondas HCSE evita cualquier rotura, un problema que puede interrumpir los flujos de trabajo de SPME. Después de la optimización del método, no experimentamos dificultades con la contaminación del sistema o el arrastre, que son problemas comunes con las metodologías P y T. Sin embargo, la mayor contribución al alto rendimiento de este método provino, sin duda, de la plataforma de muestreador automático utilizada. Con este sistema, el análisis continuaba durante todo el día, y se requería intervención manual para suministrar muestras solo a la bandeja de muestras. Esto contrasta con otros métodos de extracción por sorción de alta capacidad, como el SBSE, que requieren operación manual. Si bien SPME suele estar completamente automatizado, el rendimiento es limitado en el sentido de que la incubación de la siguiente muestra solo puede, por lo general, comenzar una vez que la muestra anterior se ha inyectado en la columna de GC. Suponiendo que el tiempo de ciclo del GC es corto, el GC puede, por lo tanto, permanecer inactivo mientras la siguiente muestra completa la extracción. Con nuestro método, varias muestras pueden someterse a un premuestreo y extracción simultáneamente, de modo que se minimiza el tiempo de inactividad del GC. Por lo tanto, pudimos procesar 1,8 muestras por hora por sistema.

Hemos demostrado MDLs de 1,2 y 1,1 ng/L para GSM y MIB, respectivamente, superando hasta ahora la sensibilidad requerida. Mientras que otras técnicas como P y T, LLE, SBSE y SPME pueden ser capaces de alcanzar MDLs más bajos bajo ciertas circunstancias11, estos aumentos en la sensibilidad son de valor práctico limitado y no justifican la pérdida de las ventajas de las sondas HCSE descritas anteriormente. Además, algunas de estas técnicas requieren grandes volúmenes de muestra, con el consiguiente aumento de los costes de generación y transporte de residuos. Para LLE, los volúmenes de muestra suelen estar en el rango de 200 a 500 mL 15,16,17, mientras que para SPME, SBSE y P y T, los valores típicos son 10 a 100 mL 18,19,20,21,22. Se observó una excelente reproducibilidad con valores de RSD de 6,34% y 4,82% para GSM y MIB, respectivamente. Estos valores son ampliamente similares a los encontrados en otros métodos11 y, en particular, superan a los RSD de los métodos SPME publicados23,24. Una vez más, nuestros bajos valores de RSD se lograron con volúmenes de muestra de solo 5 mL, inferiores a la gran mayoría de las técnicas de extracción publicadas. Por lo tanto, estamos seguros de que las sondas HCSE proporcionan suficiente sensibilidad y reproducibilidad, junto con un amplio conjunto de beneficios que combinan los mejores aspectos de todas las alternativas destacadas en un solo método simple, totalmente automatizado y sostenible.

La geosmina y el 2-metilisoborneol son compuestos lipofílicos, lo que presenta un desafío para los científicos que intentan extraer esos compuestos del tejido rico en lípidos para su análisis. Por lo tanto, ajustamos nuestras condiciones de premuestreo, utilizando un procedimiento de premuestreo más largo y caliente, para conducir más analitos desde la matriz de muestra hasta el espacio de cabeza. Una vez realizados estos ajustes, determinamos que el método funcionaba bien para analizar GSM y MIB en tejidos de peces. Hay que tener en cuenta que en el caso de muestras con un contenido muy alto de lípidos, puede ser necesario reducir la masa de la muestra utilizada, por ejemplo, a 0,50 g. Esto es para evitar que los lípidos formen un sello completo en la parte superior del agua que impida que los analitos lleguen al espacio de cabeza.

Este método utiliza principios de equilibrio para extraer analitos del espacio de cabeza de una muestra. Aunque aquí utilizamos muestras de agua y peces de la acuicultura, creemos que el método es aplicable a la extracción de odorantes de cualquier matriz sólida o líquida que pueda homogeneizarse y acomodarse dentro de un vial de muestreo de 20 mL. Algunos ejemplos de aplicaciones son el control de aguas y suelos ambientales, el análisis del agua potable y el análisis de alimentos como frutas y verduras, o de la vida acuática no cultivada en granjas. En la agricultura, GSM y MIB se encuentran a menudo en suelos húmedos y pueden impartir sabores desagradables a los cultivos que se cultivan en ellos2, por lo tanto, tanto los suelos como los cultivos podrían probarse a través de nuestro método para monitorear los niveles de odorantes como una forma de control de calidad y / o para diagnosticar la fuente de las quejas malolientes. Muchas aguas ambientales, como ríos y lagos, experimentan picos estacionales en la concentración de odorantes debido a las floraciones de algas25, y este método ofrece un medio de alto rendimiento y alta sensibilidad para monitorear el alcance de estos picos. Este método también es adecuado para la investigación académica, por ejemplo, para medir la tasa de producción de odorantes por microorganismos26 o para examinar la relación entre las concentraciones de odorantes en el agua y en los tejidos animales27. Otros grupos de investigación han utilizado el proceso HCSE para extraer de una variedad de tipos de muestras, como bebidas alcohólicas28, carne de cordero29, aceite de oliva30, medios de cultivo de células humanas31 y pistachos32. Estos estudios se dirigieron a otros analitos o son estudios de perfil no dirigidos y, por lo tanto, no se optimizaron para el análisis de GSM y MIB, pero se presentan aquí ya que ofrecen información general sobre la preparación de varios tipos de muestras para la extracción de sondas HCSE.

Si bien es probable que el método de agua descrito sea aplicable a todas las muestras de agua o a base de agua con una modificación mínima, la aplicación a otras muestras sólidas o semisólidas puede requerir alguna alteración específica de la matriz en la preparación de la muestra (sección 3.1) y la extracción del analito (sección 3.2). Si bien no sería posible cubrir todos los escenarios de muestreo aquí, ofrecemos las siguientes consideraciones. (1) Las muestras sólidas deben homogeneizarse hasta convertirse en un polvo fino mediante rallado, molienda o mezcla para garantizar la representatividad y proporcionar la máxima superficie posible para la salida de los analitos. (2) Las muestras sólidas con un bajo contenido de lípidos pueden no requerir la adición de agua o sal, es decir, puede ser suficiente con pesar 1,00 g en un vial y un tapón. Esto permitirá una transferencia más directa de analitos de la muestra al espacio de cabeza, sin una transferencia intermedia de la matriz de la muestra al agua añadida. Sin embargo, esto reducirá la eficacia de la agitación. Los analistas deben realizar experimentos para determinar la técnica óptima de preparación de muestras para su matriz de muestras. (3) Las diferentes matrices tendrán diferentes afinidades para GSM y MIB. Por lo tanto, se requerirán diferentes temperaturas de incubación para alcanzar el equilibrio del analito de manera oportuna. Sin embargo, algunas matrices pueden ser alteradas químicamente por el calor, de modo que se producen interferencias por reacciones químicas a altas temperaturas. Una vez más, se requieren experimentos para determinar la temperatura óptima de incubación para un tipo de muestra en particular (nota: las muestras con un alto contenido de humedad nunca deben incubarse por encima de 90 °C para evitar que los viales se rompan por la presión de vapor del agua hirviendo).

Hemos desarrollado métodos para la detección de geosmina y 2-metilisoborneol en agua y tejido de peces. Las pruebas realizadas con estándares de laboratorio confirman que los métodos son cuantitativos y reproducibles, mientras que la aplicación a muestras del mundo real (agua de sistemas de acuicultura de recirculación, tejidos de peces derivados de dichos sistemas) demuestra el rendimiento incluso en el contexto de muestras complejas y sucias. Aunque hemos aplicado nuestros métodos a muestras de acuicultura, sugerimos que son adecuados para el monitoreo GSM y MIB en una amplia gama de tipos de muestras, incluyendo agua y materiales sólidos o semisólidos.

Divulgaciones

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Los autores de esta publicación trabajan en Markes International Ltd o Markes International GmbH Asistimos con la capacitación del sistema, los protocolos del sistema, los diseños experimentales y la redacción. Para evitar sesgos o sesgos percibidos en nuestra investigación, toda la investigación de laboratorio y el análisis de datos se llevaron a cabo en la Universidad de Maine bajo la supervisión directa del Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-ARS) y el Instituto de Investigación Acuícola de la Universidad de Maine.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-ARS) por los fondos para adquirir el equipo utilizado y el financiamiento continuo para completar toda esta investigación. También nos gustaría agradecer a la Dra. Heather Hamlin, la Dra. Amalia Harrington, la Dra. Deborah Bouchard, la Dra. Sarah Turner, Gareth Dobson, Cameron Coulombe y Abriah James por su asistencia y apoyo a lo largo de esta investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta de 0,5-10 uLNichipet AirA21405581
puntas de pipeta de 1000 uLVWR76322-154
pipeta de 100-1000 uLeppendorf285612
matraz de vidrio de 100 mlVWR76008-704
pipeta de 10-100 uLNichipet AirA20814031
puntas de pipeta de 10-100 uLmega24502-18
10xL Puntas de pipetaVWR76322-132
20mL Vasos de precipitados de vidrioVWR10754-698
2-isopropil-3-metoxipirazinaTCII0577Patrón interno
40 ml Ámbar tipo-1 (borosilicato) Vial de vidrioEmpresa de muestreo ambiental0040-0400-QCVial de muestreo de agua
5mL Punta de pipetaVistaLab tecnologías4058-5102
BalanzaVWRVWR-124B2
Centri 360MarkesU-CENTRI-1691Muestreador automático
Chromeleon versión 7.3Software Thermo ScientificGC-MS
Trampa de enfoqueMarkesU-T12ME-2S
Cromatógrafo de gases, traza 1310Thermo Scientific14800403
Columna de GCThermo Scientific26098-1420TG-5MS
Solución de geosmina y 2-metilisoborneolSIGMA-ALDRICH o MilliporeSigmaCRM47525
vial de espacio de cabeza, 20 mlMango deC-VCC20
HiSorbMarkesC-HH-6
HiSorbMarcasC-HSPCCS
HiSorb Liner del inyectorMarkesU-LINER-HISORB
Sonda HiSorb, PDMS, versión cortaMarkesH1-XXABC
Tapones de viales HiSorbMarkesC-HSPCCS
metálica de laboratorio
Espectrómetro de masas, ISQ 7000Thermo ScientificISQ7K-NOVPI
MetanolProductos químicos VWRBDH1135-4LP
Metanol, grado Optima LC-MSFisher-scientificA456-4
Juntas tóricas tamaño 201MarcasU-COV201Para tapa de inyector HiSorb y almacenamiento HiSorb
Pipettor automático Ovation (100-5000uL)VistaLab technologies213626
Guantes de examen sin polvo de nitrilo púrpura-Xtra Kimtech50602-54
Cloruro de sodio ( sal)Productos químicos VWRBDH9286-2.5K
Adaptador de conmutación (pipeta automática)CUI INCSMI10-5
Herramienta de engarzadoviales MarkesU-HSVCR
Destapadora deviales MarkesU-HSVDC
Pesajes Grainger8AG69
HiSorb Markes Tapa del inyector Pala de

Referencias

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