La configuración propuesta permite la ventilación mecánica controlada y la resonancia magnética del movimiento del tórax en 3D en ratones y ratas. Hemos utilizado esta configuración para estudiar la fisiopatología subyacente a la disfunción de los músculos respiratorios inducida por la ventilación mecánica.
Artículo de método
Imágenes de resonancia magnética de cine 3D del movimiento respiratorio en ratones y ratas con ventilación mecánica
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Resumen
Resumen
La fisiopatología de la disfunción del diafragma en pacientes con ventilación mecánica aún no se ha entendido completamente, y se requieren modelos animales adecuados para acomodar más investigación. Los ajustes de ventilación mecánica, como el nivel de presión positiva al final de la espiración (PEEP), juegan un papel crucial. El objetivo era desarrollar un método para obtener imágenes del movimiento torácico en 3D durante la ventilación mecánica de ratones y ratas en diferentes configuraciones de presión respiratoria. Las ratas (Wistar) y los ratones (C57BL / 6) fueron anestesiados con una mezcla de ketamina, atropina y dexmedetomidina. La anestesia se mantuvo mediante infusión continua a través de un catéter peritoneal. A continuación, se realizó una traqueotomía para permitir la ventilación mecánica de los animales. Los animales se colocaron en un sistema de RM 7T mientras ventilaban con un ventilador compatible con RM. Las imágenes de cine 3D del tórax se realizaron utilizando una secuencia de eco de gradiente 3D con relleno de espacio k pseudoespiral. Se registró una señal de navegador, generada por el gradiente rebobinador de selección de cortes, cada TR. Se realizó un agrupamiento retrospectivo y la reconstrucción de los datos en 12 marcos de tiempo de cine respiratorio utilizando un software desarrollado internamente. Visualizamos con éxito el movimiento torácico en 3D en ambas especies durante la ventilación mecánica, lo que permitió la investigación de cambios en la geometría del tórax a lo largo del ciclo respiratorio a diferentes niveles de PEEP. Encontramos que el agrupamiento retrospectivo de los marcos respiratorios se vio muy facilitado por la frecuencia respiratoria fija. El protocolo presentado aquí se puede utilizar para estudiar la geometría y el movimiento cardíaco y torácico en ratones y ratas con ventilación mecánica.
Introducción
La ventilación mecánica es la piedra angular del tratamiento de la insuficiencia respiratoria aguda en la unidad de cuidados intensivos. Desafortunadamente, también puede causar lesiones. La lesión pulmonar inducida por el ventilador, la lesión cerebral asociada al ventilador y la disfunción del diafragma inducida por el ventilador son ejemplos de complicaciones iatrogénicas asociadas con la ventilación mecánica aguda 1,2,3. La fisiopatología subyacente a estos mecanismos de lesión sigue siendo poco conocida. El trabajo experimental en animales ha identificado mecanismos importantes que subyacen a las complicaciones de la ventilación mecánica, lo que permite su traducción a la práctica clínica mediante la aplicación de nuevas estrategias de ventilación4. Un ejemplo reciente es la investigación sobre el impacto de las disincronías del ventilador en la función del diafragma en modelos de SDRA porcino5. Tal investigación en modelos animales con ventilación mecánica es vital para dilucidar los mecanismos de lesión, incluso con la tendencia actual a alejarse de las pruebas con animales. Los estudios sobre los efectos de la ventilación mecánica requieren un sistema cardiopulmonar intacto y la capacidad de simular la fisiopatología comúnmente observada en la UCI4. Los modelos animales grandes se utilizan a menudo porque imitan la fisiología humana más de cerca que los roedores y pueden ventilarse con máquinas que se utilizan en la UCI4. Los principales inconvenientes son el gran costo asociado con el uso de animales grandes y la falta de modelos animales grandes genéticamente modificados para investigar los mecanismos moleculares de la enfermedad 6,7. Por lo tanto, los experimentos en roedores con ventilación mecánica son inevitables mientras no se disponga de alternativas, como cultivos de tejidos sofisticados o modelos de órgano en un chip.
Varias intervenciones que mejoraron los resultados en animales no se tradujeron en humanos 4,6, lo que subraya la importancia de comprender cómo los modelos animales de ventilación mecánica comúnmente utilizados difieren de los humanos. Los efectos de la configuración del ventilador en el sistema respiratorio están determinados por una gran cantidad de factores que pueden ser específicos de la especie, como la elastancia tisular, el tono muscular y la variación en la respuesta a los anestésicos de uso común 8,9,10,11. Estas diferencias pueden conducir a efectos contrastantes sobre el movimiento y la geometría del tórax y los pulmones que pueden explicar la disparidad entre humanos y animales. La investigación del efecto de los ajustes de ventilación en la geometría y el movimiento del sistema cardiopulmonar puede dilucidar las diferencias entre especies y puede ayudar en la traducción de conceptos fisiopatológicos derivados de estudios en animales al entorno clínico. El avance técnico de la resonancia magnética cardiovascular resuelta por movimiento ha permitido obtener imágenes del corazón latiendo en modelos de roedores, proporcionando información sobre la forma, la función y la fisiopatología en modelos de roedores de enfermedades cardiovasculares12,13. Estos métodos están infrautilizados para obtener imágenes del tórax y el movimiento durante el ciclo respiratorio en animales con ventilación mecánica.
Aquí, presentamos un método para estudiar la geometría y los movimientos del tórax en roedores con ventilación mecánica utilizando resonancia magnética de cine 3D. Esto permite estudiar los efectos agudos de numerosos ajustes de ventilación u otras intervenciones sobre la geometría y el movimiento del tórax en roedores con ventilación mecánica. Aplicamos una nueva adquisición de resonancia magnética de cine 3D pseudoespiral, con compuerta respiratoria para animales pequeños ventilados13,14. En este estudio inicial, investigamos los efectos de la presión positiva al final de la espiración (PEEP), pero este método también se puede utilizar para estudiar el efecto de otras intervenciones o entornos respiratorios, como la relación I: E, el volumen corriente y la frecuencia respiratoria. Este método abrirá un abanico de posibilidades para la obtención de imágenes preclínicas de modelos de roedores que requieren ventilación mecánica en el campo de la investigación en cuidados intensivos y más allá.
Protocolo
Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con la directiva 86/609 de la Unión Europea CE. Los experimentos fueron aprobados por el Consejo de Ética Animal de Amsterdam UMC, ubicación VUmc y AMC. Se obtuvieron ratones C57BL/N y ratas Wistar de los laboratorios Charles River. Para todos los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras de 3 a 6 meses con un peso de 25 a 32 g y ratas macho y hembra de 3 a 6 meses con un peso entre 200 y 400 g. Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Todos los animales se aclimataron durante al menos 1 semana antes del inicio de los experimentos.
1. Preparación de la configuración
- Prepare los medicamentos anestésicos siguiendo las dosis mencionadas en el paso 2.
- Calibre el ventilador mecánico desplazándose por el menú del ventilador y haciendo clic en Configurar > más ventilador > Calib&Tests. Realice las cuatro pruebas y calibraciones enumeradas allí: Prueba de fugas, Purgar tubería, Medir espacio muerto y Purgar tubería.
- Coloque el ventilador mecánico compatible con RM en la sala de RM y tire de los cables conectados al ventilador compatible con RM a través del orificio de la máquina de RM. Se puede usar un pulmón de prueba (por ejemplo, un globo pequeño) para verificar la ventilación proveniente del ventilador compatible con RM.
- Conecte el ventilador mecánico compatible con MR al compresor y a una fuente de flujo de oxígeno.
- Prepare una columna de PEEP llenando una columna de medición de 10 ml con agua y marcando la profundidad del agua en centímetros. Coloque el tubo espiratorio del ventilador compatible con RM en la columna PEEP. En la Figura 1 se muestra una descripción general de la configuración.
- Pegue con cinta adhesiva un cojín respiratorio sin apretar a la cuna de RM en el lugar donde estará el tórax del animal.
2. Anestesia e inicio de la ventilación mecánica
- Comience la sedación del animal (ratón o rata) colocándolo en una cámara de gas llena de isoflurano al 4% en O2 al 100%.
- Pesar al animal para determinar la dosis de anestesia. Inyecte el sitio quirúrgico (área laríngea) con 3 mg / kg de bupivacaína y aplique ungüento para los ojos en ambos ojos.
- Coloque al animal en una almohadilla térmica mientras respira espontáneamente entre el 2% y el 4% de isoflurano en oxígeno al 100% a través de un cono nasal. Asegure el control de la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno y la temperatura colocando un oxímetro de pulso en una de las patas del animal e insertando la sonda del termómetro rectal.
- Pruebe la ausencia de reflejos antes de la incisión. Levante la piel que cubre la laringe y la tráquea con fórceps quirúrgicos y haga una incisión con unas tijeras dobladas.
- Diseccionar sin rodeos las glándulas salivales y la musculatura subyacente hasta que la tráquea sea visible.
- Con unas pinzas dobladas y afiladas, diseccione el lado dorsal de la tráquea y coloque las pinzas debajo de la tráquea para tirar de una sutura de seda trenzada no absorbible (tamaño 6/0) alrededor de la tráquea.
- Agarre la tráquea por un anillo de cartílago y abra la tráquea inmediatamente debajo del anillo con unas tijeras de resorte.
- Canular la tráquea con un Abbocath de 20G (ratón) o 14G (rata), cortado a aproximadamente 1-1,5 cm de longitud. Ate la sutura alrededor de la tráquea canulada para asegurar un sello hermético.
- Iniciar la ventilación del animal con un volumen corriente de 7 mL/kg, frecuencia de 150 BPM para ratones y 80 BPM para ratas, 2 cmH2O PEEP con 3% de isoflurano en oxígeno al 100%.
- Realizar una inyección intraperitoneal de la dosis de inducción de anestesia inyectable (ratón: ketamina 126 mg/kg, dexmedetomidina 0,1 mg/kg, atropina 0,5 mg/kg; rata: ketamina 90 mg/kg, dexmedetomidina 0,25 mg/kg, atropina 0,05 mg/kg) y después de 5 min, disminuir gradualmente el flujo de isoflurano (3% a 0% en 10 min) para permitir una transición suave de la anestesia gaseosa a la anestesia inyectable.
- Coloque 24G Abbocath por vía intraperitoneal y conéctelo al perfusor con las siguientes dosis de ratón: ketamina 36 mg / kg / h, dexmedetomidina 0,02 mg / kg / h, atropina 0,075 mg / kg / h; rata: ketamina 30 mg/kg/h, dexmedetomidina 0,015 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h. Iniciar la perfusión.
NOTA: Realizamos una traqueotomía para ventilar a los animales en lugar de intubación oral porque esto nos permitió colocar una sutura alrededor de la tráquea. Esto fue necesario para evitar fugas de aire, lo cual es crucial para mantener suficiente PEEP.
3. Resonancia magnética bajo ventilación mecánica
- Coloque al animal en la cuna de RM dedicada en posición supina y coloque la bobina de RM adecuada para ratones o ratas sobre ella mientras vigila el tubo de traqueotomía.
- Detenga y desconecte el ventilador mecánico utilizado en 1.2 y la bomba de anestesia y transporte al animal a la sala de resonancia magnética. Vuelva a conectar al animal al ventilador compatible con RM y comience a ventilar con un volumen corriente de 10 ml / kg y una frecuencia de 150 BPM para ratones y 80 BPM para ratas. El volumen corriente es mayor que con el ventilador utilizado en 1.2 para reclutar tejido pulmonar que podría haberse colapsado durante el transporte.
- Vuelva a conectar la bomba de anestesia a las velocidades mencionadas anteriormente para mantener la profundidad de la anestesia. Dependiendo del sistema de RM, coloque las líneas de anestesia dentro o fuera del orificio de RM.
- Coloque el sensor del monitor de saturación y frecuencia cardíaca en la extremidad trasera del animal e inserte la sonda del termómetro rectal. Conecte el sistema de monitorización respiratoria al cojín respiratorio. Verifique todas las señales y asegúrese de que la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno y la temperatura estén en el rango fisiológico.
NOTA: La monitorización respiratoria debe indicar la frecuencia respiratoria establecida en el ventilador compatible con RM y solo se utiliza para detectar el esfuerzo respiratorio del animal. En caso de esfuerzo respiratorio del animal, la curva respiratoria muestra picos adicionales. Esto requiere la administración de una dosis adicional de anestesia (1/3 de la dosis inicial de inducción). - Coloque al animal en el escáner de resonancia magnética con la bobina centrada sobre el tórax y conecte los cables de radiofrecuencia a la bobina. Hay una bobina y una cuna separadas para adaptarse a la diferencia de tamaño entre ratones y ratas (la bobina para ratas y la cuna tienen un diámetro mayor en comparación con la bobina del ratón). Sumerja el tubo espiratorio 6 cm en la columna de agua, administrando 6 cmH2O PEEP.
- Valore el volumen corriente a 7-9 ml / kg dependiendo de la saturación de oxígeno (elija el volumen corriente más bajo posible con una saturación del 100%).
4. Adquisición de escaneo
NOTA: La Tabla 1 proporciona una descripción general de la configuración de escaneo.
- Utilice métodos especificados por el proveedor para realizar la calibración y el ajuste de compatibilidad de RF.
- Adquiera un SCOUT con cinco imágenes en orientación coronal y axial y asegúrese de que todo el tórax esté en el campo de visión (FOV). Un SCOUT es una exploración rápida que se utiliza para planificar los otros planos de imágenes y generalmente cubre un campo de visión más grande que las otras imágenes. Si es necesario, reajuste la posición del animal en la cuna y vuelva a hacer el SCOUT.
- Planifique las exploraciones 2D (consulte la Tabla 1 y la Figura 2) en las imágenes de SCOUT. Asegúrese de que el plano coronal y sagital cubran todo el tórax.
NOTA: El plano sagital se coloca en la parte superior del hemidiafragma derecho para limitar la porción del corazón dentro del campo de visión. Al adquirir el SCOUT a 6 cmH2O PEEP, nos aseguramos de que el diafragma se visualice en la posición más caudal. - Adquiera los escaneos 2D a 6 cmH2O PEEP y reconstruya inmediatamente las imágenes para verificar el posicionamiento del animal y garantizar la calidad de la imagen (siga el paso 6). Si es necesario, reajuste la posición del campo de visión o del animal y vuelva a hacer las exploraciones.
- Planifique el escaneo 3D (Figura 2) colocando el campo de visión alrededor de todo el tórax y cubra los escaneos 2D. Asegúrese de que aproximadamente el 20% del campo de visión en la dirección del corte esté fuera del animal para evitar artefactos de plegado.
NOTA: Los escaneos 2D se agregan al protocolo porque el tiempo de adquisición es más corto que para los escaneos 3D, lo que los hace adecuados para probar rápidamente el efecto de las intervenciones. - Adquiera el escaneo 3D con el esquema de muestreo de espacio k pseudoespiral requerido (Figura 3), lo que permite un agrupamiento retrospectivo robusto de datos y visualización del movimiento respiratorio14.
- Repita los escaneos 2D y 3D a 3 y 0 cmH2O PEEP. El tiempo total de escaneo fue de 2,5 minutos por escaneo 2D y 15 minutos por escaneo 3D.
NOTA: En este caso, adaptamos PEEP durante los experimentos. Seleccionamos PEEP de 0, 3 y 6 cmH2O porque sabemos por experimentos (investigaciones previas y estudios en curso) con animales ventilados a largo plazo que estos niveles de PEEP dan como resultado cambios relevantes en la geometría del diafragma y el tórax15. Además, optamos por usar cero, un nivel medio y uno alto de PEEP en este trabajo para mostrar el efecto de PEEP. Dependiendo de la pregunta de investigación, son posibles otras intervenciones. Por ejemplo, se pueden estudiar los efectos de los relajantes musculares u otros medicamentos sobre la geometría del tórax. El protocolo nos permite estudiar los efectos dentro del sujeto de la intervención.
Figura 1: Descripción general de la configuración. (A) Una descripción general esquemática de la configuración, (B) la configuración de la bobina para un ratón, (C) la configuración de la bobina para una rata, con un diámetro más grande que la bobina del mouse, (D) la configuración de la bobina con respecto al escáner de RM, (E) la columna PEEP con tubo espiratorio colocado a 3 cmH2O PEEP y (F) un primer plano de la válvula que regula la ventilación, indicando qué tubos deben colocarse en la columna PEEP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Planificación de las imágenes de RM para los cines 2D y 3D. Figura que muestra cómo se configuró el campo de visión para los escaneos 2D en orientación sagital y coronal (fila superior y central) y los escaneos 3D en orientación sagital (fila inferior). La columna izquierda representa una de las rodajas del SCOUT en orientación axial a nivel del corazón, la columna central muestra una rebanada del SCOUT en orientación coronal y la columna derecha muestra una rebanada en orientación axial a nivel del hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Patrón de muestreo pseudoespiral de RM. El patrón de muestreo está en la dirección de codificación de fase ky/kz con un tamaño de matriz de 80 x 80 optimizado para el agrupamiento retrospectivo del movimiento respiratorio. Las espirales se crean comenzando en el centro del espacio k y luego girando hacia afuera y hacia adentro nuevamente, repitiendo así cada espiral. El patrón de muestreo completo se realiza con 25 repeticiones para generar datos suficientes dentro de cada marco respiratorio. Cada espiral tiene un color diferente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Fin del experimento
- Después de terminar todas las exploraciones, retire al animal del escáner. Los animales no pueden sobrevivir al experimento debido a la traqueotomía. Eutanasia a ratones con luxación cervical y ratas por exanguinación.
- Guarde todos los archivos MR sin procesar y reconstruidos.
| Tipo de análisis | Eco degradado SCOUT | Eco degradado 2D | Eco degradado 3D |
| Orientación | Coronal y Sagital | Coronal y Sagital | Sagital |
| esquema de muestreo k-Space | Cartesiano | Cartesiano | Pseudo-espiral |
| Número de cortes | 10 | 1 | 80 |
| Grosor de la rebanada (mm) | 1 (Ratón) | 1 (Ratón) | 0.38 (Ratón) |
| 1 (Rata) | 1 (Rata) | 0.81 (Rata) | |
| Separación de rebanadas (mm) | 2 (Ratón) | 0 (Ratón) | 0 (Ratón) |
| 5 (Rata) | 0 (Rata) | 0 (Rata) | |
| Muestreo de rebanadas* | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| Campo de visión (lectura x fase x corte; mm) | 35 x 35 (ratón) | 30 x 23 (ratón) | 30 x 23 x 30 (ratón) |
| 80 x 80 (Rata) | 65 x 49 (Rata) | 65 x 49 x 65 (Rata) | |
| Tamaño de la matriz (frecuencia x fase) | 256 x 192 | 256 x 192 | 211 x 80 x 80 |
| TR / TE (ms) | 45328 | 45330 | 45328 |
| Ángulo de giro (°) | 15 | 15 | 10 |
| Número de repeticiones | 80 | 70 | 25 |
| Desencadenamiento respiratorio | No | Sí, retrospectivamente | Sí, retrospectivamente |
| Tiempo de imagen (min:s) | 2:02 | 2:23 | 16:00 |
| Niveles de PEEP (cmH2O) | 6 | 6, 3, 0 | 6, 3, 0 |
Tabla 1: Parámetros de adquisición para todos los escaneos. * El muestreo de cortes indica qué porcentaje del pulso de selección de cortes se utiliza para obtener imágenes
6. Reconstrucción de imágenes
- Para realizar la reconstrucción de imágenes, utilice el software desarrollado internamente disponible en GitHub16. Realice estos pasos para todas las exploraciones con un navegador que requiera una activación respiratoria retrospectiva.
NOTA: Fue descrito previamente por Daal et al., pero ese trabajo se centró en la imagen cardíaca13. Aquí, describimos un método para reconstruir imágenes respiratorias de todo el tórax. - Cargue el archivo de datos sin procesar haciendo clic en Cargar MRD. Esto visualiza la señal del navegador sin procesar y su espectro en el panel superior izquierdo. Si la señal respiratoria no es claramente visible, adapte el navegador principal en la pestaña Configuración.
- En los filtros de corazón/respiración, complete la frecuencia respiratoria configurada en el ventilador mecánico compatible con MR y establezca el ancho en 15. La configuración de los otros cuadros no es relevante para este tipo de reconstrucción. Presione Filtro para aplicar la configuración, lo que da como resultado una señal de navegador cerrada, como se muestra en la Figura 4. Asegúrese de que la señal roja en la caja Navegador de respiración y Frecuencia respiratoria siga la señal azul del navegador sin procesar.
- En Cine, seleccione Película respiratoria y establezca el número de fotogramas en 12 y el número de dinámicas en 1. En la pestaña Geometría, active el PCA (nivel 8) y el filtro de timbre. Presione Ordenar espacio k para aplicar la configuración.
- En los parámetros de reco de CS, aplique los siguientes ajustes: WVxyz 0,0010, TVxyz 0,0000, LLRxyz 0,0050, TVcine 0,015, TVdyn 0,000. Presione Reco Movies para comenzar la reconstrucción.
- Inspeccione la reconstrucción en el panel inferior derecho desplazándose por los marcos y (si corresponde) las rebanadas. Exporte las imágenes reconstruidas presionando Exportar DCM y/o Exportar GIF.
7. Análisis de imágenes
NOTA: Dependiendo de la pregunta de investigación, se pueden calcular varios parámetros de resultado a partir de las imágenes de cine. Aquí, nos enfocamos en parámetros que cuantifican la geometría del tórax, el volumen pulmonar y la excursión.
- Abra un visor DICOM apropiado, por ejemplo, el software mencionado en la Tabla de materiales y cargue un cine 2D haciendo clic en Archivo > Abrir y seleccionando los archivos de cine 2D. Identifique el marco con la posición más alta del diafragma (marco espirativo final). Seleccione el marco y ábralo en el visor DICOM.
- Mida las dimensiones pulmonares anteroposteriores y craneocaudales (Figura 5) en el cine 2D sagital y la dimensión izquierda-derecha en el cine 2D orientado hacia la corona manualmente usando el botón de medición en microdicom. Repita estas mediciones para todos los niveles de PEEP u otras intervenciones. Estas mediciones también se pueden realizar en un cuadro del cine 3D, dependiendo de la elección de los escaneos.
- Cargue el cine 3D en el programa de análisis de imágenes 3D y coloque la imagen en la orientación correcta haciendo clic en Herramientas > Reorientar imagen. Complete SPL como código RAI. Seleccione el fotograma de espiración final desplazándose por la dinámica en Herramientas > Inspector de capas y, a continuación, aumente el número de componente.
- Inicialice la segmentación contorneando manualmente la parte media de los pulmones en dos cortes para cada orientación (Figura 6). Usa el modo de pincel y ajusta el tamaño del pincel si es necesario.
- Inicie la segmentación 3D pulsando Contorno activo en la barra de herramientas principal. Asegúrese de que el cuadro rojo (ROI) cubra todo el tórax. Active Inicializar con segmentación actual y presione Segmento 3D.
- Seleccione Umbral como modo de presegmentación y use solo un umbral superior seleccionando el modo de umbral más a la derecha. Presiona Siguiente. Luego, omita el paso de agregar burbujas presionando nuevamente Siguiente. Debido a que la segmentación ya se inicializó en el paso 7.5, no es necesario agregar burbujas.
- Inicie el contorno activo presionando el botón Reproducir y paújelo tan pronto como la segmentación llegue a los bordes del pulmón. Desplácese por las imágenes para verificar la segmentación. Presione Finalizar para finalizar la segmentación.
- Presione Actualizar para visualizar la segmentación 3D en el panel inferior izquierdo e inspeccionarla y girarla.
- Guarde la segmentación como NiFTI haciendo clic en Segmentación > Guardar imagen de segmentación y archivo de malla STL haciendo clic en Segmentación > Exportar malla de segmentación.
- Anote el volumen pulmonar que se puede encontrar en Segmentación, volumen y estadísticas.
- Registre las imágenes de los otros estados respiratorios en la dinámica de espiración final utilizando el script proporcionado en el Archivo de codificación complementario 1. Aplique las transformaciones calculadas a la segmentación, lo que da como resultado una segmentación para cada dinámica. Utilice estas segmentaciones para calcular parámetros de resultados, como excursiones en todas las direcciones.
Resultados
Usando el protocolo descrito en este estudio, escaneamos un grupo de 8 ratones sanos C57BL / 6 WT y 8 ratas Wistar WT con éxito utilizando un escáner de resonancia magnética de 7 Tesla. Pudimos ventilar mecánicamente a los animales a diferentes niveles de PEEP y monitorear parámetros fisiológicos básicos durante el escaneo (Figura 7).
En la Figura 5, se muestra un ejemplo de tres escaneos 2D en el marco espiratorio final de un ratón y una rata en orientación sagital. Como se puede ver, la PEEP introduce un desplazamiento caudal del diafragma en ambos animales, pero en ratones, esto también se acompaña de un ensanchamiento del tórax, indicado por un aumento en el diámetro anteroposterior.
Estas exploraciones de alta calidad muestran que con esta técnica, podemos medir el tamaño de las diferentes partes del tórax y mostrar los efectos de varios ajustes ventilatorios en el movimiento del tórax y el diafragma. El corto tiempo de escaneo permite la comparación dentro de los sujetos de los parámetros de resultado que le interesan, lo que reduce el número requerido de animales. La Tabla 2 muestra los parámetros de resultado de todos los animales.
La Figura 8 muestra las segmentaciones pulmonares de la dinámica espiratoria final en tres niveles de PEEP con el volumen pulmonar correspondiente. Como se esperaba, el aumento de la PEEP resultó en un aumento del volumen pulmonar. Los cines 3D también se muestran como una película en el vídeo complementario 1 y el vídeo complementario 2.
Figura 4: Captura de pantalla del software utilizado para reconstruir las imágenes con una puerta retrospectiva de los datos. La compuerta de los datos se basa en la señal del navegador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de imágenes 2D en una rata y un ratón en tres niveles de PEEP, con las dimensiones pulmonar anteroposterior y craneocaudal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Captura de pantalla del software utilizado para segmentar los pulmones en los cines 3D. En el panel superior izquierdo, se muestra una vista axial del cine 3D con el pulmón segmentado en rojo. En el panel superior derecho se muestra una vista sagital con el pulmón segmentado en rojo. En el panel inferior izquierdo se muestra un render 3D del pulmón segmentado. En el panel izquierdo-derecho, se muestra una vista coronal con el pulmón segmentado en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Parámetros vitales de los animales durante los experimentos. N = 8 ratones (azul), N = 8 ratas (naranja). Los datos se muestran como media con SD. Tenga en cuenta la caída de la frecuencia cardíaca cuando los animales entran en un plano quirúrgico de anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Segmentación 3D de los pulmones en tres niveles de PEEP con los volúmenes pulmonares correspondientes. Segmentación de un pulmón de rata en PEEP 0 (columna izquierda), PEEP 3 (columna central) y PEEP 6 (columna derecha). En la fila superior, se muestra el lado posterior de los pulmones. En la fila central se muestra el lado anterior de los pulmones. Los volúmenes que se muestran en la fila inferior se miden dentro de los pulmones renderizados en 3D que son visibles en esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo complementario 1: Cine 3D de un ratón. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo complementario 2: Cine 3D de una rata. Haga clic aquí para descargar este video.
Archivo de codificación complementario 1: Script para registrar las segmentaciones en otras adquisiciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio muestra que las imágenes de RM 3D con compuerta retrospectiva permiten medir el movimiento del tórax en dos modelos animales durante la ventilación mecánica. Estas técnicas tienen el potencial de ser utilizadas en futuras investigaciones que involucren imágenes cardíacas y torácicas en ratones y ratas con ventilación mecánica. Encontramos que debido a la frecuencia de respiración fija, el binning retrospectivo fue muy robusto.
Un paso crítico del protocolo es establecer el posicionamiento correcto de los animales dentro de las bobinas de RM. Durante el escaneo, no es posible reposicionar a los animales. Además, mantener la normotermia es muy importante para garantizar que las mediciones se realicen en condiciones fisiológicas, ya que los anestésicos pueden causar hipotermia a través de la vasodilatación periférica, y los pulsos de radiofrecuencia de este protocolo de resonancia magnética pueden causar hipertermia17,18. En la Figura 7, se pueden ver fluctuaciones de temperatura corporal durante el corto período alrededor de la transferencia de los animales al escáner (alrededor de la marca de 1 h) en el que no se aplica calor de una fuente externa. Otro paso crítico es la titulación de la anestesia, especialmente en ratones. El plano de anestesia donde los ratones no exhiben esfuerzo respiratorio pero mantienen parámetros vitales estables es estrecho y requiere un monitoreo cuidadoso de la señal respiratoria y el ajuste de las velocidades de infusión de anestesia. En ratas, no enfrentamos tales problemas dentro del rango de sedación utilizado. La calidad de la imagen se verá afectada negativamente si hay esfuerzos respiratorios del animal debido a la reconstrucción retrospectiva de las imágenes en función de la frecuencia respiratoria establecida. Es posible utilizar un régimen anestésico diferente, como anestesia inhalatoria con isoflurano o anestésicos inyectables alternativos que causan una mayor supresión del esfuerzo respiratorio. El ventilador para pequeños animales CWE-MRI-1 utilizado en este protocolo es compatible con anestésicos inhalatorios19.
Hay tres pasos críticos para reproducir el método de resonancia magnética propuesto en este estudio. Primero, se debe usar la misma secuencia básica de resonancia magnética (es decir, 3D FLASH). Tal secuencia está disponible básicamente en todos los sistemas de resonancia magnética. En segundo lugar, la trayectoria del espacio k mencionada en este trabajo (pseudo-espiral) puede requerir un parche de software que pueda ejecutar trayectorias del espacio k definidas por el usuario. Invitamos a los lectores a comunicarse con el autor correspondiente si desean replicar la adquisición. Existe experiencia en la implementación de este tipo de adquisición en sistemas de otros proveedores. Por último, la línea de reconstrucción que compartimos como software de código abierto es neutral para el proveedor y, por lo tanto, aplicable a todos los sistemas preclínicos.
Elegimos la activación retrospectiva y el binning en lugar de la activación prospectiva por varias razones. Principalmente, el disparo retrospectivo y el agrupamiento de datos en el espacio k ofrecen una flexibilidad total en el número de fotogramas CINE respiratorios reconstruidos, lo que nos permite optimizar la resolución temporal, la resolución espacial y la relación señal-ruido. Además, la activación prospectiva introduce un tiempo muerto al final de cada ciclo respiratorio mientras el escáner espera el siguiente disparo, lo que puede interrumpir el estado estacionario y dar lugar a un ciclo incompleto. Con ventilación mecánica, este tiempo muerto es mínimo pero aún está presente.
La principal limitación de este protocolo es la incapacidad de medir las presiones de las vías respiratorias o esofágicas. Hasta donde sabemos, no existen en el mercado sensores de presión pulmonar o esofágica compatibles con RM para animales pequeños. Otra limitación es la falta de mediciones continuas de la presión arterial dentro de la resonancia magnética. El protocolo anestésico se basó en investigaciones institucionales previas. Se agregó atropina debido a la alta prevalencia de bradicardia e hipotensión observada anteriormente. Aunque no fue posible la monitorización continua de la presión arterial debido a las limitaciones del entorno de RM, la hipertensión es poco probable, ya que no se observó taquicardia (Figura 7). El monitoreo empleado en este protocolo consistió en frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno, temperatura y una señal respiratoria basada en el movimiento de la pared torácica. Usando estas mediciones, una descripción general de los parámetros vitales de los animales puede guiar la administración de anestesia, pero tener una lectura de la presión arterial podría evitar una sobredosis de animales que muestren esfuerzo respiratorio. No se han publicado otros estudios de resonancia magnética sobre la fisiología respiratoria de roedores con ventilación mecánica, pero este método se puede emplear para una amplia gama de preguntas de investigación fuera de la investigación respiratoria. El programa de reconstrucción mencionado en el manuscrito (Retrospectiva) también se puede utilizar para reconstruir imágenes a lo largo del ciclo cardíaco, lo que permite al investigador adquirir imágenes de alta resolución del corazón y los vasos sin artefactos de movimiento. Este protocolo se puede aplicar en todos los proyectos que requieran ventilación mecánica de ratas o ratones durante la exploración. Se puede, por ejemplo, considerar estudiar la relación entre los ajustes de ventilación mecánica y la función cardíaca. Otras opciones incluyen imágenes de animales con el tórax abierto o después de cirugías que requieren ventilación mecánica.
Divulgaciones
Ruslan Garipov es empleado de MR Solutions Ltd., Guildford, Reino Unido.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención ZonMW 09120011910004 (GS, CO, LH) y la subvención NIH 5R01HL121500 (CO).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| Bomba de jeringa dual digital 11 Plus | Aparato de Harvard (EE. UU.) | 229193-2 | Bomba de jeringa doble con funciones programables para laboratorios |
| Acondicionador de señal monocanal y multicanal AccuSens | Opsens solutions inc. (Canadá) | ACS-P4-N-62SC | Se utiliza con sensor de temperatura de fibra óptica para controlar la temperatura corporal |
| Sensor de temperatura de fibra óptica | Opsens solutions inc. (Canadá) | OTP-M | |
| Soporte para ratones | É equipo Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Mousestat Jr. | Kent-scientific (Estados Unidos) | MSTAT-JR | El MouseSTAT Jr. proporciona oximetría de pulso precisa tanto en ratones como en ratas. |
| Escáner de RM | MR Solutions Lt. (Reino Unido) | MRS-7024 | |
| Monitorización compatible con RM y Sistema de compuerta para animales pequeños | SA Instruments, Inc. (Estados Unidos) | 1030 | Módulo RT (módulo de interfaz respiratoria), módulo de control / compuerta ERT, paquete de baterías |
| Ventilador compatible con MRI-1 | CWE (EE. UU.) | 12-07000 | Ventilador mecánico adecuado para ventilar pequeños animales en entornos de resonancia magnética. Ventila con un principio basado en el flujo x tiempo controlado por volumen mediante válvulas neumáticas. |
| Unidad de control de temperatura multiestación y PCA de alto flujo | É equipo Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Columna PEEP | Columna de medición de fluidos reutilizada | ||
| Ventilador mecánico Physiosuite | Kent-scientific (Estados Unidos) | Ventilador mecánico adecuado para ventilar animales pequeños. Ventila con un principio de control de volumen y regulación de presión. | |
| Oxímetro de pulso Sensores de pata, compatibles con resonancia magnética | Kent-scientific (Estados Unidos) | SPO2-MSE-MRI | Sensor de patas compatible con resonancia magnética para Mousestat Jr. |
| Cuna para ratas | É equipo Vé té rinaire Minerve (Francia) | ||
| Bobina de RF, Ratón | MR Solutions Lt. (Reino Unido) | Bobina de RF de volumen de ratón de 38 mm para estudios corporales de ratón | |
| Bobina de RF, Rata | MR Solutions Lt. (Reino Unido) | 65mm bobina de RF de volumen de rata para estudios de cuerpos de rata | |
| Herramientas quirúrgicas | |||
| Abbocath 14G, 20G, 22G, 24G | Abbocath | 14G, 20G, 22G para uso como tubo endotraqueal, 24G para infusión intraperitoneal de anestesia | |
| Ethilon 3-0 FD-1 sutura con aguja | Ethicon (Estados Unidos) | 663H | |
| Fórceps #55 | Dumont (Suiza) | 55 | |
| Tijeras Metzenbaum | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 14017-14 | |
| Portaagujas | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 12005-15 | |
| Sutura de seda trenzada no absorbible 6/0 | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 18020-60 | |
| Tijeras de resorte | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 15033-09 | |
| Tijeras de tenotomía Stevens | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 14064-11 | |
| Pinzas para atar suturas | Herramientas de la ciencia fina (Alemania) | 18025-10 | |
| Cinta medipore | 3M (ESTADOS UNIDOS) | ||
| Medicación | |||
| Atropina 0,25 mg/ml | |||
| Dexmedetomidina 0.5 mg/mL Dexdormitor | Orion pharma (Finlandia) | ||
| Duratears ungüento para los ojos | Alcon Nederland BV (Países Bajos) | ||
| Isoflurano | AST pharma (Francia) | ||
| Ketamina 100 mg/ml Ketexx | Alfasan (Países Bajos) | ||
| Vaselina vaselina | Unilever (Países Bajos) | ||
| Software | |||
| Elastix | Instituto de Ciencias de la Imagen, UMC Utrecht (Países Bajos) | ||
| Es un chasquido | Universidad de Pensilvania (EE. UU.) | ||
| Matlab 2019a | Wolfram Research Inc (Estados Unidos) | ||
| Microdicom | Microdicom (Bulgaria) | ||
| Retrospectiva | Ámsterdam UMC (Países Bajos) |
Referencias
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