Artículo de método

Preparación de Mycobacterium abscessus incrustado en perlas de agar para inocular ratones inmunocompetentes por vía intratraqueal

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DOI:

10.3791/67602

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25 de abril de 2025

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los ratones son generalmente resistentes a las infecciones por Mycobacterium abscessus, lo que complica el descubrimiento y desarrollo de antibióticos muy necesarios contra las infecciones pulmonares. Aquí, describimos un método de preparación de inóculo e infección intratraqueal que demostró producir una infección sostenida en ratones inmunocompetentes.

Resumen

Se necesitan urgentemente modelos robustos de ratón de infección crónica por Mycobacterium abscessus, un patógeno ambiental que infecta preferentemente los pulmones. Las terapias multifarmacológicas de un año de duración ofrecen tasas de curación inaceptablemente bajas en los pacientes, alrededor del 50%, de ahí la necesidad de herramientas preclínicas predictivas para desarrollar mejores antibióticos. Sin embargo, los ratones inmunocompetentes son generalmente resistentes a la infección pulmonar por M. abscessus. En la literatura se han reportado numerosos intentos de establecer una infección sostenida por M. abscessus en ratones inmunocompetentes. Entre estos, los métodos que se basan en bacterias incrustadas en perlas de agar inoculadas en ratones C57BL/6 por vía intratraqueal han demostrado ser los más prometedores. La principal limitación de este enfoque es el desafío técnico asociado con la preparación de perlas de agar de tamaño y números bacterianos reproducibles, seguido de la inoculación intratraqueal. Aquí, primero proporcionamos una descripción detallada de un protocolo optimizado que proporciona perlas de agar cargadas con M. abscessus de diámetro óptimo y carga bacteriana reproducible. A continuación, proporcionamos un protocolo detallado de inoculación intratraqueal, optimizado para evitar pérdidas de perlas y bacterias debido a la adherencia a las superficies de los dispositivos de inoculación y para lograr la deposición pulmonar reproducible de M. abscessus incluido en agar. El objetivo es garantizar la facilidad de implementación y una excelente reproducibilidad de laboratorio a laboratorio.

Introducción

Las opciones de tratamiento para la enfermedad pulmonar por Mycobacterium abscessus (Mab) son limitadas e involucran regímenes multifarmacológicos de un año de duración con antibióticos orales, parenterales y ocasionalmente inhalados, la mayoría de los cuales carecen de actividad bactericida óptima y se asocian con toxicidad significativa 1,2,3,4,5 . Se necesitan con urgencia terapias más cortas, seguras y eficaces. Los modelos murinos de infecciones por micobacterias han sido fundamentales para el descubrimiento y la optimización de fármacos y regímenes farmacológicos eficaces 6,7. Sin embargo, la evaluación preclínica de antibióticos contra las infecciones por Mab ha demostrado ser un desafío debido a la dificultad de establecer infecciones pulmonares progresivas y sostenidas en ratones 8,9.

La infección de cepas de ratón inmunocompetentes con Mab resulta en gran medida en una colonización transitoria seguida de una rápida eliminación del patógeno10,11. Para lograr la infección crónica observada clínicamente, se han utilizado agentes inmovilizadores como la agarosa o el agar para promover la persistencia y las respuestas inmunopatológicas a patógenos oportunistas como Pseudomonas aeruginosa o Haemophilus influenza en ratones inmunocompetentes 12,13,14. Este modelo fue adaptado recientemente para lograr la infección respiratoria crónica por Mab ATCC 19977 en ratones inmunocompetentes C57BL/6N 15,16,17,18. El método indujo una infección persistente hasta 45 días después de la inoculación intratraqueal con ~1 × 104 a 1 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC), con una incidencia de infección crónica entre los ratones infectados del 90%-100%19 y la formación de granulomas organizados alrededor de la perla de agar en desintegración18. Parece que la inclusión de Mab en perlas protege de la rápida eliminación por parte del sistema inmune innato y que las perlas cargadas con bacterias constituyen focos para el reclutamiento de células inmunes que conducen a la formación de granulomas y al establecimiento de infecciones crónicas18. Las perlas de agar/agarosa constituyen un biomaterial relativamente inerte que induce respuestas inflamatorias mínimas. Además, las perlas se desintegran lentamente, evitando problemas de reacciones alérgicas a cuerpos extraños o fibrosis inducida. La infección intratraqueal con o sin dispositivo de micropulverización garantiza la deposición efectiva del inóculo en los pulmones 8,20,21 y reproduce la exposición clínica y la infección mejor que la inoculación intravenosa o intranasal.

El modelo, por lo tanto, ofrece muchas ventajas. Sin embargo, también conlleva algunos desafíos de naturaleza técnica, a saber: (i) lograr un tamaño de perla reproducible, (ii) obtener una carga bacteriana de perlas reproducible y (iii) garantizar una administración intratraqueal constante del inóculo. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para lograr estos objetivos de manera confiable y garantizar la reproducibilidad de laboratorio a laboratorio.

Protocolo

Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Todos los estudios con M. abscessus se realizaron en un laboratorio con nivel de contención de bioseguridad 2.

1. Preparación del inóculo de M. abscessus incrustado en perlas de agar

  1. Preparar un precultivo de M. abscessus ATCC 19977 inoculando 1,5 mL de cultivo de densidad óptica (OD600) 1 (utilizando un espectrofotómetro) en 200 mL de medio Middlebrook 7H9 suplementado con 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) de glicerol y 10% (v/v) de enriquecimiento de albúmina-dextrosa-catalasa (ADC) de Middlebrook.
  2. Incubar los cultivos en un frasco con rodillo a 37 °C durante 24 h hasta alcanzar la fase de registro medio (DO600 = 0,4-0,6).
  3. Suspender 1,2 g de Caldo de Soja Tríptico (TSB) en 40 mL de agua ultrapura y añadir 0,6 g de Agar Difco hasta una concentración final del 1,5%.
  4. Transfiera 60 mL de aceite mineral pesado a un matraz Erlenmeyer de 500 mL y esterilice tanto el aceite mineral como el agar de soja tríptico (TSA) a 121 °C durante 15 min, luego equilibre a 50 °C en un horno.
  5. Tome una muestra de 1 mL del cultivo y mida el OD600.
  6. Recolección de células por centrifugación a 3700 g durante 15 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en 4 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco para lograr un OD600 de aproximadamente 30.
  7. Mezclar 3 mL de suspensión bacteriana con 27 mL de TSA fundido preequilibrado a 50 °C en un tubo de centrífuga de 50 mL. Mezclar rápidamente por vórtice o pipeteo.
  8. Vierta con cuidado la mezcla de bacterias y agar (30 mL) en 60 mL de aceite mineral y coloque el matraz en un recipiente secundario. Ajuste rápidamente la mezcla para que gire a velocidad media (420 rpm) en un agitador magnético ajustado a 50 °C, utilizando una barra de agitación magnética. Asegúrese de que se forme un vórtice visible en la mezcla de aceite y agar. Revuelva durante 6 minutos a temperatura ambiente (RT).
  9. Enfríe la mezcla colocando hielo en el recipiente secundario y continúe revolviendo durante 35 minutos.
  10. Detenga la agitación y deje reposar la suspensión de cuentas de agar durante 20 minutos (reponga el hielo según sea necesario).
  11. Transfiera la mezcla de suspensión a dos tubos de centrífuga de 50 ml y lave 10 veces con un volumen de DPBS para eliminar el aceite y las bacterias libres (3700 g, 6 min, 4 °C, durante los primeros 5 ciclos).
    1. Combine las suspensiones de cuentas de agar en un tubo en el tercer lavado. Durante los primeros 5 ciclos de lavado, utilice una pipeta serológica para resuspender suavemente las perlas.
    2. Para los 5 ciclos de lavado siguientes, utilice los siguientes parámetros de centrifugación: 2000 g durante 5 minutos, seguido de 1000 g durante 4, 3, 2 y 2 minutos, respectivamente.
  12. Vuelva a suspender las perlas de agar en DPBS hasta un volumen final de 40 mL, transfiéralas a un frasco estéril de 125 mL y diluya 4 veces agregando 120 mL de DPBS.
  13. Pase la suspensión a través de un filtro de celdas de 200 μm.
    1. Conecte el filtro a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Luego, agregue material de muestra en el colador y filtre la suspensión de cuentas.
    2. Para facilitar el proceso de filtración, combine un filtro de celdas, un embudo, un anillo conector y un tubo de 50 ml en una unidad. Ensamble las piezas en el orden del embudo, el filtro de celdas, el anillo conector y el tubo de 50 ml, y tire lentamente del pistón de una jeringa de 30 ml conectada al anillo conector.
  14. Si es necesario, enjuague el colador desde el lado opuesto con DPBS para lavar las cuentas más grandes retenidas. Concentre la suspensión diluida girando a 1000 g durante 2 min o dejando que las perlas se asienten por gravedad. Después de la cosecha, almacene las perlas de agar a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Se recomienda una preparación fresca para cada lote de experimentos.
  15. Pipetee 5 μL de la suspensión de perlas en un portaobjetos de vidrio, cúbralo con un cubreobjetos y tome imágenes en algunas posiciones aleatorias utilizando un microscopio de luz o fluorescencia con una lente de objetivo de 10×. Guarde las imágenes y mida el diámetro del cordón con ImageJ (rango de tamaño deseado: 200 ± 50 μm).

2. Titulación del inóculo de M. abscessus incrustado en perlas de agar

  1. Agregue 1 mL de la suspensión de perlas en un tubo M y homogeneice asépticamente para liberar las bacterias incrustadas en las perlas utilizando un disociador configurado en el programa predefinido RNA.02.01.
  2. Tome 100 μL del homogeneizado y diluya en serie de 1:10 a 1 × dilución 10-5 . Diluciones esparcidas en agar 7H10 suplementado con un 10% de ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC) y un 2% de glicerol. Enumere las UFC después de 3 a 5 días de incubación.
  3. Ajuste el título de inóculo según sea necesario. Por ejemplo, si cada ratón recibe 100 μL de suspensión de perlas que contiene 1 × 105 UFC por 10 ratones, se prepara un total de 2 ml de suspensión que contiene 1 × 106 UFC/ml más ~25% para tener en cuenta las pérdidas en jeringas.

3. Prueba de dispensación de perlas a través de la jeringa y la aguja

NOTA: Se incluyeron los siguientes pasos para garantizar que las cuentas no se adhieran a las superficies de la jeringa o aguja. Se descubrió que es importante utilizar una jeringa de vidrio y una aguja de alimentación metálica de 24 G para evitar la pérdida de cuentas debido a la adherencia a las superficies de plástico.

  1. Prepare el PBST añadiendo 1,25 mL de Tween estéril de 80 a 500 mL de PBS estéril.
  2. Agregue 900 μL de PBST en cinco tubos M para probar las perlas de agar que pasan a través de la aguja de alimentación, así como 900 μL de PBST en tubos estériles de 2 mL para preparar diluciones de -2 a -6 de cada muestra de empuje.
  3. Mezcle las perlas de agar incrustadas en M . abscessus preparadas anteriormente con una pipeta P1000 para asegurarse de que todas las perlas se dispersen uniformemente.
  4. Coloque una aguja de alimentación metálica de 24 g en la jeringa de vidrio y aspire la suspensión de perlas de agar, asegurándose de evitar la formación de burbujas de aire.
  5. Una vez que la jeringa esté llena sin burbujas de aire, coloque clips o tapones de nailon en el émbolo de la jeringa, sin espacio entre los clips. Los tapones permiten una dispensación precisa de 50-100 μL. Es posible colocar hasta 6 clips a lo largo del émbolo.
  6. Dispense 100 μL de perlas ("push-through") en los tubos M en su orden respectivo.
  7. Una vez que se han recogido 5 empujones, homogeneizar las perlas utilizando el disociador de tejidos ajustado a la configuración RNA.02.01, adecuado para la preparación de ARN a partir de órganos congelados y que se encontró que libera eficazmente M . abscessus de las perlas sin afectar la viabilidad celular.
  8. Realice la dilución en serie para los homogeneizados en el rango de -1 a -6. Coloque las diluciones en placas de agar 7H11 suplementadas con OADC. Cuente las UFC después de 5 días.

4. Inoculación intratraqueal de ratones

  1. Prepare ratones CD-1 de 6 a 8 semanas de edad.
  2. Sedar a los ratones utilizando un sistema de exposición a aerosoles de isoflurano, a un caudal del 1-5%, como se ha descrito anteriormente1.
  3. Sujete a los ratones utilizando un soporte inclinado impreso en tres dimensiones (3D) (diseñado y producido a medida). La varilla en el centro del soporte tiene una cuerda de sutura que sujeta al ratón verticalmente por sus incisivos, colocando al ratón en posición reclinada ventral con la cabeza levantada.
  4. Conecte una aguja metálica de alimentación animal de 24 g a una jeringa de vidrio llena de perlas de agar incrustadas en M. abscessus. Coloque clips o tapones de nailon en el émbolo de la jeringa para infectar a cada ratón con 50 μL de inóculo.
  5. Una vez que el ratón sedado esté sujeto en la picadura de sutura, mueva la lengua hacia un lado de la boca con un aplicador de hisopo de algodón.
  6. Visualice la parte posterior de la boca del ratón para identificar claramente la sección blanca en la parte posterior de la boca y dirigirse a la tráquea del ratón.
  7. Inclina la aguja de sonda de metal verticalmente sobre el ratón e insértala en la parte superior de la tráquea. Puede haber una ligera resistencia al pasar a través de la epiglotis.
  8. Deslice la aguja de sonda nasogástrica hacia abajo en la tráquea, retire el clip o tapón de nailon y dispense 50 μL de M . abscessus incrustado en perlas de agar.
  9. Deje que el mouse descanse durante 5 minutos y repita los pasos 4.2 a 4.8 por segunda vez. El propósito de un procedimiento de inoculación de dos pasos es asegurar la deposición reproducible y profunda del inóculo completo en el pulmón.
  10. Deje que la infección progrese durante 24 horas, después de lo cual el ratón es sacrificado para enumerar la deposición bacteriana en los pulmones.

Resultados

Tamaño y carga del cordón
Para visualizar las perlas de agar y su carga bacteriana, la proteína fluorescente mCherry red se expresó bajo el promotor constitutivo Hsp60 en la cepa tipo Mab ATCC 19977 e incrustó esta cepa en perlas de agar como se describió anteriormente. La figura 1A muestra el rango de tamaño del cordón (barra de escala = 200 μm). La Figura 1B muestra la carga de 6 preparaciones de cuentas independientes, lo que demuestra la reproducibilidad del procedimiento descrito.

Siembra de la jeringa, empuje e implantación bacteriana después de la inoculación intratraqueal
La inoculación intratraqueal se optimizó en dos etapas. Las UFC/ml se enumeraron en el inóculo antes y después de pasar a través de la jeringa de vidrio para garantizar que no se produjeran pérdidas de perlas o bacterias a medida que las perlas pasaban a través de la jeringa y el tubo conectado. La Tabla 1 muestra el título bacteriano inicial de dos preparaciones de perlas independientes (ensayos 1 y 2) y el número de UFC recuperadas por cada 100 mL de muestras "empujadas" a partir de una sola carga de jeringa. Para evitar pérdidas de cordones y bacterias, se requiere una jeringa de vidrio conectada a un tubo de metal. Las perlas de agar tienden a adherirse a las superficies de plástico.

La enumeración de las UFC a lo largo del tiempo en la preparación de las perlas mostró que la carga bacteriana de las perlas se mantuvo estable a 4 °C durante 1 semana, con una pérdida de ~2 veces la carga bacteriana por 2 semanas y una deposición pulmonar intacta. A continuación, se infectaron grupos de 5 a 8 ratones con tres preparaciones de perlas independientes para probar la reproducibilidad del procedimiento de inoculación intratraqueal. En la Tabla 2 se muestra el número de UFC pulmonares por ratón, enumeradas 24 h después de la infección como se describe.

Por último, se evaluó la reproducibilidad de la infección entre operadores mediante la infección de tres grupos de 10 ratones CD-1, cada uno realizado por un operador diferente. Las UFC pulmonares enumeradas 24 h después de la infección se muestran en la Figura 2.

figure-results-1
Figura 1: Experimento piloto para evaluar el tamaño de las cuentas, visualizar y cuantificar la carga bacteriana de M. abscessus . (A) Perlas de agar que contienen la cepa M . abscessus ATCC 19977, diseñadas para expresar la proteína fluorescente mCherry red bajo el promotor constitutivo hsp60. Se extendieron cinco μl de suspensión de perlas en un portaobjetos de vidrio y se obtuvieron imágenes con un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara (objetivo 10x). Cada punto rojo es una célula bacteriana fluorescente, encerrada dentro de perlas de agar de diámetros que oscilan entre ~70-250 μm. (B) Carga bacteriana, en UFC/mL, de 6 preparaciones de perlas individuales que muestran la reproducibilidad del método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Reproducibilidad de la infección entre operadores. Grupos de 10 ratones hembra CD-1 fueron infectados intratraquealmente por tres operadores independientes como se describe, utilizando la misma preparación de perlas. Se muestran las UFC pulmonares enumeradas 24 h después de la infección. O1, O2, O3: operadores 1, 2 y 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

UFC/100 μL
Preparación de cuentasPrueba 1Prueba 2
1.13E+052.40E+05
Muestra de empuje de jeringa
11.14E+055.10E+05
21.36E+054.10E+05
39.30E+043.90E+05
49.80E+043.60E+05
51.14E+05
Promedio1.11E+054.18E+05
SD1.69E+04 (15%)6.50E+04 (16%)

Tabla 1: Unidades formadoras de colonias (UFC) por muestra de 100 μL después de pasar a través de la jeringa de vidrio y la aguja de alimentación de metal.

Prueba 1Prueba 2Prueba 3
ID del ratónUFC pulmonares/ratónID del ratónUFC pulmonares/ratónID del ratónUFC pulmonares/ratón
M-16.50E+03M-62.20E+05M-116.80E+04
M-21.10E+04M-72.70E+05M-121.70E+05
M-31.40E+04M-88.10E+04M-132.10E+05
M-43.20E+03M-91.40E+05M-144.40E+04
M-54.50E+03M-101.30E+05M-157.50E+04
M-161.01E+05
M-177.00E+04
M-185.80E+03
Promedio7.84E+03Promedio1.68E+05Promedio9.30E+04
SD4.54E+03 (58%)SD7.57E+04 (45%)SD6.67E+04 (72%)

Tabla 2: Implantación de M . abscessus en perlas de agar en pulmones de ratón 24 h después de la inoculación

Discusión

Para garantizar la distribución uniforme de las bacterias en las perlas de agar, es importante suspender uniformemente la mezcla de agar fundido y bacterias antes de añadirla a la fase oleosa. La relación entre el volumen de aceite y bacterias de agar es fundamental para controlar el tamaño de las perlas. Una mayor proporción de aceite a agar conduce a la formación de perlas de agar más pequeñas. Al mezclar la suspensión de bacterias de agar con la fase oleosa, el control de la temperatura es fundamental. La mezcla de aceite y agar debe estar lo suficientemente caliente para permitir la emulsificación y la formación de gotas, pero lo suficientemente fría como para no dañar las bacterias. La agitación continua mientras se enfría la mezcla a temperatura ambiente o por debajo permite que se formen y solidifiquen gotas de agar.

La calibración adecuada de la placa de agitación, el tamaño de la barra de agitación y la forma y el tamaño del matraz son determinantes importantes de un vórtice uniforme. Una barra de agitación colocada en el centro del matraz crea un vórtice simétrico, lo que garantiza una mezcla uniforme. Una barra de agitación descentrada puede provocar un vórtice inestable, lo que da como resultado cuentas de forma irregular y la introducción de burbujas de aire en las cuentas. Se recomienda la supervisión y el ajuste en tiempo real de la posición de la barra de agitación. El volumen del matraz debe ser proporcional al volumen de la mezcla de aceite y agar. Un matraz de 500 mL es ideal para hacer girar una mezcla de aceite y agar de 90 mL, produciendo un vórtice visible. Cuando se utilizan matraces más grandes, es importante ajustar el volumen de la mezcla de aceite y agar, el tamaño del agitador y la velocidad de vórtice para lograr un equilibrio entre una mezcla efectiva y un vórtice estable. Mantener una velocidad de vórtice constante durante el proceso y en todas las preparaciones de cordones es fundamental para la reproducibilidad de un lote a otro.

El proceso de preparación de perlas de agar, específicamente la velocidad de vórtice y la relación aceite-agar, se adaptan de16,22, con pequeñas modificaciones. Las fuerzas de cizallamiento dentro del vórtice giratorio producen inherentemente cordones de diferentes tamaños. Para minimizar esta variabilidad de tamaño, se modificó la etapa de recolección de perlas introduciendo varias etapas de lavado, empleando un gradiente de velocidad y tiempo de centrifugación decrecientes para garantizar la eliminación de perlas de pequeño tamaño (y bacterias libres). Se empleó un filtro de micromalla para enriquecer las cuentas del tamaño deseado, filtrando eficazmente las cuentas más grandes y las que pueden haberse formado a través de la coalescencia aleatoria. Para evitar pérdidas de perlas o bacterias a medida que la suspensión de perlas pasa a través de la jeringa y el tubo conectado para la inoculación intratraqueal del ratón, es fundamental utilizar una jeringa de vidrio, agujas de alimentación metálicas de 24 G y un tubo conectado por metal.

La principal limitación del método es la complejidad técnica de la preparación de las perlas y la inoculación intratraqueal para lograr una carga de perlas reproducible y la implantación pulmonar. Se requiere atención al detalle y la capacidad de solucionar problemas. Además, el modelo no ha sido completamente validado mediante pruebas de la eficacia de los antibióticos estándar de atención y las combinaciones de antibióticos más frecuentes administradas a los pacientes con Mab.

En la actualidad, no se ha validado ningún modelo murino de infección crónica por Mab hasta el punto de que el modelo9 pueda predecir razonablemente la eficacia de los agentes individuales y las combinaciones de fármacos en los pacientes. El sistema de ratón C57BL/6 incrustado en perlas de agar se ha explotado para probar la eficacia de los tratamientos antimicrobianos 15,19,23. La alternativa más cercana al sistema de ratón C57BL/6 incrustado en perlas de agar es el modelo de ratón C3HeB/FeJ, que se basa en la inmunosupresión con dexametasona para lograr una infección crónica duradera24,25. Las ventajas del protocolo aquí descrito son que (i) se pueden utilizar ratones C57BL/6 totalmente inmunocompetentes y más asequibles, (ii) se puede obtener una infección productiva y crónica con la cepa tipo bien caracterizada ATCC 19977, y (iii) no hay necesidad de inmunosupresión inducida químicamente, evitando la necesidad de inyecciones diarias de dexametasona, evitando así posibles interacciones farmacológicas e impactos en la inmunopatología pulmonar.

Dada la falta de modelos murinos validados de infección crónica por Mab para evaluar nuevos candidatos a fármacos y regímenes farmacológicos 8,9, la técnica aquí descrita tiene el potencial de hacer avanzar el campo, mejorar el valor predictivo de los datos preclínicos de eficacia, ayudar a priorizar los regímenes farmacológicos con mayor potencial para proporcionar una cura duradera y, en general, acelerar el descubrimiento y desarrollo de fármacos para la enfermedad pulmonar Mab. El método se puede aplicar a otros patógenos pulmonares y tiene un historial establecido para P. aeruginosa o Haemophilus influenza. El objetivo principal del protocolo descrito aquí es proporcionar suficientes detalles y recomendaciones para garantizar la facilidad de implementación y una excelente reproducibilidad de laboratorio a laboratorio.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación de Fibrosis Quística, premio DICK24XX0, a TD y VD, y R01-AI132374 de NIH-NIAID a TD y VD.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Botella de 125 mLCorning8388Estante de
Retención de Tubos Estéril 3 x 3Fisher5972-0030PKDesinfectado antes de su uso
Soporte de Ratón Impreso en 3DTransworld Marketing diseñado y producido a medidaDesinfectado antes de su uso
Placa de dilución de 48 pocillos Celltreat 229192Tubos
centrífuga estériles de 50 mlestéril Greiner Bio-One227261
EZ-AF9000 SISTEMAn/a
Avanti J-15R Beckman Coulter  B99517
Puntas de pipeta de barrera centrífuga en rejilla de tapa extraíble 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ABolsa de
riesgo biológicoFisherbrand22-044561
Anillo de conectorpluriSelect41-50000-03
Aplicadores con punta de algodónPuritan 22-029-571Asas de
inoculación desechables estériles amarillas estériles 100 en bolsa ziplockCole-Parmer Essentials 03-391-562
Toalla desechable estéril forrada de polietilenoDynarex19-310-671Solución
salina tamponada con fosfatode Dulbecco Thomas Scientific21-031-CMestéril
pluriSelect42-50000
Espectrofotómetroestéril GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630
Gentlemacs Disociador de tejidosMiltenyi Biotec130-096-427Jeringa Hamilton no activada por calor
Hamilton80801Desinfectado antes de usar
Aceite mineral pesadoSigma-Aldrich330760-1LSolución estéril
isoflurano botella de 250 mlCovetrus29405Corrosión/irritación de la piel: Categoría 2, Daño ocular grave/irritación ocular: Categoría 2A, Toxicidad sistémica específica en órganos diana (exposición única): Categoría 3
Puede causar somnolencia y mareos, Causa irritación ocular grave, Causa irritación cutánea. No inhale, use en un área bien ventilada.
M Tubes (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Agitador magnético estéril
MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
Barra de agitación magnéticaThomas Scientific  1181L08Pipeta
Mecánica Estéril 100– 1000 µ L Gilson PIPETMAN L FA10006MDesinfectado antes de su uso
Pipeta mecánica 20– 200 µ L Gilson PIPETMAN L FA10003MGDesinfectado antes de su uso
Aguja de alimentación animal de metal 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SDebe ser esterilizado (esterilizado en autoclave)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GEsterilizado (esterilizado en autoclave)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Esterilizado (esterilizado en autoclave)
Middlebrook 7H9 medioBeckton Dickinson271310esterilizadas (esterilizadas en autoclave
) Soluciones TriMech SRV-AMS-FDMDesinfectado antes de usar
Sutura de seda no absorbibleFisher Scientific18020-50n/a
OADC Enriquecimiento líquido para uso con medios Middlebrook 500 mlThermo Scientific Remel R450605PBS estéril
(10x), pH 7.4 Filtrado estéril 500 mLGibco70-011-044
Toallitas estériles PeroxiguardPeroxigard29221n/a
Placas de Petri con tapa transparente redonda 100mmx 15mmFisherbrand FB0875712PluriStrainer estéril
de 200 mmpluriSelect43-50200-03Esterilizable; colador celular
Frascos de rodilloCorning430165
Pipeta serológicaCorning4489Cubetas
estériles de espectrofotómetro 1,5 mlFisher Scientific14955127esterilizados (esterilizados en autoclave)
o clips (nylon)Trimech SRV-AMS-MJFDesinfectado antes de usar
Caldo de soja trípticoSigma-AldrichT8907-500GEstéril
Tween 80 Fisher170793Filtro esterilizado 
Puntas de pipeta filtradas de ancho Rejilla de tapa extraíble 200G Thermo Scientific ART21-236-1Aestéril
de Máquina de anestetia Sistemas estéril estéril Embudo de Piezas de soporte de ratón estéril Tapones de jeringa

Referencias

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