Aquí, proporcionamos detalles sobre la realización de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) a través de la perfusión a través de la vasculatura de los ratones con un páncreas intacto como una técnica adicional para evaluar la función pancreática endocrina con reducción de posibles factores de confusión.
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Artículo de método
Secreción de insulina estimulada por glucosa a través de la perfusión a través de la vasculatura de ratones con un páncreas intacto
En este artículo
Resumen
Resumen
Los métodos actuales para la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) en roedores implican perifusión ex vivo o incubación estática de islotes pancreáticos y cortes pancreáticos. La perfusión ex vivo y la incubación estática permiten tomar múltiples muestras rápidamente con eficiencia. Sin embargo, estos procedimientos someten a los islotes a traumatismos, hipoxia intermitente y reducción de la señalización de insulina paracrina, todo lo cual puede afectar el GSIS. Estos efectos negativos se pueden minimizar mediante la perfusión a través de la vasculatura de los ratones con un páncreas intacto, lo que proporciona otro método de comparación para los diferentes modelos de GSIS. La columna vertebral de este procedimiento de perfusión involucró i) ligadura de vasos para aislar el páncreas y ii) canulación de la vasculatura pancreática. Este modelo involucró siete puntos de ligadura y dos canulaciones. La vasculatura perfundida resultante incluyó la aorta abdominal inferior, la arteria celíaca y mesentérica superior, los afluentes ramificados y la vena porta.
El perfundido se introdujo en la vasculatura a ~ 2 ml / min a través de una bomba peristáltica a un tubo PE-50 que canula la aorta abdominal inferior. Los perfundidos corrían a través de la vasculatura aislada y se recolectaron a través de la vena porta a través de una canulación con tubo PE-30. El perfundido se recogió a intervalos de 3 min en rondas de 30 min para cada solución de perfusión de 2,6 mM de glucosa, 16,8 mM de glucosa y 2,6 mM de glucosa con 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) en tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES y 0,1% BSA, pH 7,4). La solución IBMX fue precedida por una solución normal de glucosa de 2,6 mM como ciclo de lavado. El tiempo total fue de ~1 h para el procedimiento quirúrgico y 2 h para la recolección de perfusión. Los perfundidos se congelaron hasta que se realizó un ELISA para medir la secreción de insulina.
Esta lista de métodos espera proporcionar una base de procedimiento detallada para la medición de la secreción de insulina a través de la perfusión del páncreas a través de la vasculatura, lo que permitirá a los investigadores realizar con éxito la perfusión del páncreas intacto en sus laboratorios.
Introducción
La cuantificación y comprensión de la función de las células beta se ha logrado principalmente a través de la perifusión ex vivo, la incubación estática y, más recientemente, a través de cortes pancreáticos. Si bien estos procedimientos permiten la evaluación de islotes aislados, los dos primeros pueden someter a los islotes a factores estresantes que afectan su capacidad para funcionar. En un estudio de Rosenberg et al., los islotes caninos aislados utilizando métodos estándar mostraron un aumento de la apoptosis de las células beta, lo que se evidenció por la pérdida de la membrana basal, la aparición de núcleos picnóticos y cuerpos apoptóticos1. Este estudio coincide con otro informe sobre el aislamiento de islotes pancreáticos humanos donde se demostraron cambios morfológicos que representan apoptosis poco después del aislamiento de islotes 2,3. El aumento de la apoptosis de las células beta condujo a una reducción de la liberación de insulina de estos islotes, lo que respalda el concepto de que el aislamiento de los islotes los predispone al daño y al deterioro funcional.
Además de la apoptosis, la vasculatura se pierde con el aislamiento de los islotes, lo que lleva a un transporte deficiente de nutrientes, metabolitos y hormonas 4,5. Esta limitación ha llevado a alternativas como el trasplante de las células de los islotes en el ojo para mantener alguna forma de vasculatura e inervación6. El cambio en la arquitectura de la vasculatura durante el aislamiento de los islotes también crea un islote más compacto, diferente de lo que se espera in vivo 7,8.
Para agregar a las diferencias anatómicas, el comportamiento de los islotes incubados estáticamente difiere del páncreas perfundido aislado. Para los islotes incubados estáticamente con glucosa baja, el 77% de la insulina total liberada (3,31 ng de 4,34 ng totales) pareció estar presente dentro de los primeros 30 min y poco en el período de tiempo siguiente. Esto contrasta con el páncreas perfundido aislado a bajas concentraciones de glucosa, donde hubo prácticamente cero liberación de insulina en todos los puntos de tiempo (<1,8 ng en total)9. Si bien se deben realizar más investigaciones para dilucidar completamente esta diferencia a bajas concentraciones de glucosa, esta diferencia en los datos puede representar una fuga de células moribundas hipóxicas, que se examinó más a fondo a través de la incubación estática de monocapas de células de islotes. Sin embargo, estas diferencias entre los métodos actuales y los entornos in vivo pueden causar una validez externa deteriorada (Tabla 1).
Además de causar hipoxia, tanto la perifusión ex vivo como la incubación estática implican cultivar y separar los islotes del páncreas en placas de cultivo de tejidos para mantenerlos en un estado suspendido. Durante este proceso, la colagenasa generalmente se perfunde a través del conducto pancreático para permitir la disociación del tejido pancreático. La colagenasa se une a las fibrillas de colágeno y las desenreda con la ayuda de proteasas neutras, gelatinasas y proteasas pancreáticas endógenas. Juntas, estas proteasas continúan digiriéndose hasta que los islotes se liberan de su matriz extracelular y de las uniones de las células acinares. El equilibrio de esta mezcla de proteasas produce resultados variables tanto en la pureza como en la funcionalidad de los islotes aislados10. La eficacia de la colagenasa también depende de las características de los animales como la cepa, la edad, el peso y el estado de la diabetes. El uso de estas proteasas junto con rasgos específicos de animales puede dañar los islotes pancreáticos durante el proceso de aislamiento. Al administrar colagenasa, estas proteasas también activan enzimas proteolíticas pancreáticas endógenas que ayudan a la digestión de la membrana basal. Sin embargo, aún no es posible controlar la activación de las enzimas pancreáticas endógenas; por lo tanto, esto puede desempeñar un papel en el daño de los islotes durante el proceso de cultivo 11,12,13. Un informe de Edmonton mostró actividad endógena de proteasa que afecta el rendimiento del aislamiento de islotes una vez que alcanza un nivel de actividad enzimática suficiente para el aislamiento14,15.
Se ha demostrado que las técnicas actuales de infusión de colagenasa (intraductal) también penetran en el interior de los islotes, lo que conduce a una posible fragmentación de los islotes y, por lo tanto, a bajos rendimientos de los islotes16. En un estudio de Balamurugan et al., se observó que la colagenasa se localizaba en islotes y tejido acinar dentro del páncreas de ratón infundido, lo que provocaba una inflamación intensa y la activación de las vías apoptóticas17. Los islotes que sobrevivieron a la fase de aislamiento también mostraron una capacidad reducida para liberar insulina.
Además, otros factores como el estrés mecánico durante la preparación de los islotes y la necrosis inducida por hipoxia durante el cultivo juegan un papel en el funcionamiento de los islotes18. Estos rasgos pueden influir en la viabilidad del islote al aislar el páncreas y, por lo tanto, en la función resultante.
Además del aislamiento y la evaluación de los islotes mediante perifusión ex vivo e incubación estática, los islotes en cortes pancreáticos vivos son otro método ex vivo utilizado para medir las respuestas de las células endocrinas19. En este sistema, se evita el estrés químico de los procedimientos de aislamiento de islotes. Además, el microambiente de los islotes permanece intacto, lo que permite el estudio de la fisiología de los islotes más cerca de su estado in vivo 20. Similar a la perifusión ex vivo y la incubación estática, este es un método que seguirá desempeñando un papel importante en la adquisición de conocimientos sobre el páncreas. Sin embargo, algunas limitaciones incluyen el estrés mecánico durante la generación de cortes, así como la falta de una visión holística general de un páncreas intacto para la patología y la fisiología. La rebanada representa una región particular dentro del páncreas, lo que disminuye su generalización debido a la disminución del tamaño de la muestra y la visión limitada21.
Este aislamiento de islotes y otros métodos van acompañados de varios puntos de estrés que pueden imponerse a los islotes. El estrés mecánico, la hipoxia, la hiperactividad de la proteasa y la visión limitada juegan un papel en el rendimiento de los islotes resultante y la validez externa general. Estos factores pueden reducirse a través de la perfusión del páncreas a través de la vasculatura de los ratones, lo que minimiza todos los factores estresantes anteriores y al mismo tiempo permite examinar los efectos de otros secretagogos y agentes farmacológicos presentes en el cuerpo debido al mantenimiento de la integridad celular22. Estudios previos han demostrado el impacto del flujo sanguíneo de los islotes en los niveles plasmáticos de insulina23; A su vez, las moléculas vasoactivas como los péptidos de angiotensina y los agonistas simpáticos, que cambian el flujo sanguíneo de los islotes, alterarían la función de los islotes y la liberación de insulina24,25. La perfusión del páncreas permitiría una mayor evaluación de cómo estas y otras moléculas diferentes pueden afectar la respuesta de las células endocrinas. Este sistema espera permitir un mayor avance conceptual de nuestra comprensión de la biología del páncreas endocrino en presencia de diafonía en su microambiente natural con una vasculatura e inervación intactas. Además, la perfusión del páncreas intacto en este protocolo permite el aislamiento del órgano, reduciendo los posibles factores de confusión de otros órganos como el hígado, que elimina la insulina de la circulación, en comparación con la perfusión de todo el ratón. La perfusión de todo el ratón permitiría reducir la técnica quirúrgica; Sin embargo, aún requeriría la recolección de la perfusión a través de un vaso después del páncreas y antes de llegar al hígado, probablemente la vena porta. La recolección de venas porta continuaría requiriendo canulación. Si bien la perfusión de todo el ratón proporcionaría el beneficio de pasos quirúrgicos reducidos, habría limitaciones debido a los factores de confusión creados por órganos como los riñones y los pulmones que producen péptidos de angiotensina. Sin embargo, este sería un enfoque novedoso que podría resultar útil al examinar los efectos de las moléculas vasoactivas producidas por otros órganos en los islotes pancreáticos, que es la prioridad principal.
La perfusión de todo el páncreas ha sido realizada con éxito en el pasado por otros 7,22,26. En este protocolo actualizado, el uso de ratones plantea un mayor desafío técnico debido a su anatomía más pequeña en comparación con las ratas. Sin embargo, este procedimiento demuestra con éxito la viabilidad de este protocolo al demostrar un perfil secretor de insulina bien caracterizado del páncreas intacto de 3 ratones independientes.
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Protocolo
Toda la investigación realizada en roedores cumple con las pautas del Centro de Investigación de la Diabetes Joslin (número de aprobación 22-01).
1. Comienzo
- Administre anestesia.
- Inyecte ratones normoglucémicos en ayunas (Flox/Cre 53-74 semanas de edad M/F utilizado en experimentos) con una mezcla de ketamina/xilacina (~75 mg/kg de mezcla de ketamina HCl) administrada por vía intramuscular a través de uno de los muslos traseros a través de una aguja de 28 G para la eutanasia.
NOTA: El uso de ratones normoglucémicos en ayunas es importante para reducir los efectos de la ketamina; sin embargo, se puede sustituir por un anestésico. - Asegúrese de que el ratón esté correctamente anestesiado pellizcando la parte posterior del pie con fórceps para comprobar si hay reflejos.
NOTA: La falta de reflejo se denota por la falta de movimiento de la pierna pellizcada. - Administre ungüento oftálmico estéril en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia y prevenir úlceras corneales.
- Inyecte ratones normoglucémicos en ayunas (Flox/Cre 53-74 semanas de edad M/F utilizado en experimentos) con una mezcla de ketamina/xilacina (~75 mg/kg de mezcla de ketamina HCl) administrada por vía intramuscular a través de uno de los muslos traseros a través de una aguja de 28 G para la eutanasia.
- Asegura el sujeto.
- Asegúrese de que el mouse esté seguro y permanezca en su lugar durante el procedimiento, que este experimento completa a través de imanes unidos a bandas elásticas que se conectan a las extremidades con los imanes conectados a una pizarra magnética.
- Limpie el sitio de la incisión.
- Asegúrese de que el ratón se rocíe con etanol al 70% para evitar la contaminación del pelo del ratón,
NOTA: Afeitar al ratón permitiría menos posibilidades de contaminación por el pelaje.
- Asegúrese de que el ratón se rocíe con etanol al 70% para evitar la contaminación del pelo del ratón,
- Realizar incisión.
- Con fórceps/pinzas, pellizque 2-3 cm del ano y corte hacia arriba mientras perfora el peritoneo con unas tijeras curvas.
- Cree una incisión diagonal desde la línea media hasta las costillas y la parte lateral del mouse.
- Crea una incisión idéntica en el lado opuesto.
NOTA: El objetivo es crear una visión adecuada de la cavidad abdominal desde cerca del recto hasta el diafragma
2. Ligadura
- Ligue la arteria gástrica.
- Mueva los intestinos hacia la derecha del animal con fórceps/dedos romos. Levante el estómago para localizar la arteria y la vena gástrica.
NOTA: Arteria y vena gástrica identificadas a través de la visualización de vasos que van desde la parte inferior del esófago hasta la parte superior del estómago. - Tome una sutura 7-0 (sin aguja) y colóquela debajo de la arteria gástrica con fórceps romos en preparación para la ligadura.
- Cree un nudo de cirujano y asegure una ligadura adecuada a través de un nudo firme.
NOTA: El tipo de nudo no es importante; La prevención del flujo sanguíneo se puede determinar mediante un cambio de color del órgano ligado a una apariencia más pálida o la extirpación del órgano y el monitoreo de la expulsión de sangre del punto de ligadura. La ligadura de la arteria gástrica asegura que no haya influencia del contenido gástrico. Esto también reduce la fuga a los vasos gástricos y dirige la perfusión a través de la arteria celíaca.
- Mueva los intestinos hacia la derecha del animal con fórceps/dedos romos. Levante el estómago para localizar la arteria y la vena gástrica.
- Ligar los vasos renales izquierdos.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 para los vasos renales izquierdos.
- Identifique los vasos renales izquierdos visualizando vasos de color rojo brillante y púrpura oscuro que se conectan al riñón izquierdo. Este paso evita la fuga a los vasos renales y redirige la perfusión a la arteria celíaca.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 para los vasos renales izquierdos.
- Lite la aorta abdominal superior.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3.
- Identifique la aorta abdominal superior visualizando el vaso rojo brillante de la línea media con vasos ramificados de la arteria celíaca, la arteria mesentérica superior y los vasos renales izquierdos. Realice una ligadura superior a la arteria celíaca para reducir la fuga a través de la aorta abdominal superior y asegurar el flujo a la arteria celíaca y, finalmente, al páncreas.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3.
- Ligar los vasos renales derechos.
- Mueva los intestinos hacia la izquierda del animal. Pellizque el tejido / grasa que rodea el riñón derecho como palanca para identificar los vasos renales correctos.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3.
- Identificar los vasos renales derechos visualizando vasos de color púrpura / rojo oscuro (ambas venas renales derechas con una arteria debajo que no es visible) conectados al riñón derecho con conexión a la vena cava inferior y la aorta abdominal. Este paso es paralelo al paso 2.2 con los vasos renales izquierdos, lo que permite un mayor aislamiento del páncreas; Sin embargo, tenga cuidado con la proximidad de este vaso a la vena cava inferior.
- Ligar la porción abdominal de la vena cava inferior.
- Identificar la porción abdominal de la vena cava inferior a través de la visualización de un vaso púrpura más grande con una conexión ramificada a la vena renal derecha.
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3.
NOTA: Este paso reduce los posibles factores de confusión de la sangre que pasa a la vena porta, donde se recolectará el perfusado.
- Ligar la aorta abdominal inferior, antes de la bifurcación (Figura 1)
- Repita los pasos 2.1.1-2.1.3.
- Después de ligar justo antes de la bifurcación, coloque un hilo de sutura debajo de la aorta aproximadamente 0,5 cm por encima del primer nudo. Use este hilo de sutura para atar la canulación en su lugar.
- Use el espacio entre el hilo de sutura y la sutura ligada para insertar el tubo para la canulación. Esta ligadura asegura que la perfusión suba a través de la aorta abdominal inferior hacia la arteria celíaca.
- Ligar la vena porta (Figura 2)
- Mueva los intestinos hacia la izquierda del animal para permitir una visualización adecuada de la vena porta.
- Cree una incisión en el diafragma y las costillas para crear más espacio, según sea necesario, para ver la vena porta y para la tracción adecuada para la ligadura y la canulación.
- Ligue el vaso lo más superior posible (más cerca del hígado) para asegurar espacio para la canulación posterior.
- Coloque una segunda sutura inferior a la primera pero por encima del páncreas. El paso 2.7.2 hará que el sujeto fallezca. Además, este paso es importante para permitir que se recolecte la perfusión y evitar un posible reflujo superior al punto de canulación.
3. Canulación
- Canular la aorta abdominal inferior.
- Cree una incisión de 0,5-1,5 mm con unas tijeras en la aorta abdominal inferior entre el nudo inferior y la sutura superior.
- Usando el nudo más bajo como palanca, inserte el tubo en la aorta a través de la muesca hasta que llegue a la sutura más superior; Tenga cuidado de no rasgarse.
- Ate la sutura más superior en un nudo para bloquear el tubo en su lugar.
NOTA: Este paso permite que el perfundido ingrese al sistema cerrado. Con las ligaduras en su lugar, la perfusión debe viajar desde el punto de entrada en la aorta abdominal inferior hasta la arteria celíaca, luego los vasos pancreáticos, terminando con la vena porta hepática donde se puede recolectar la perfusión.
- Canular la vena porta.
- Cree una incisión de 0,5-1 mm en la vena porta justo después de que la vena porta salga del páncreas.
- Sosteniendo el nudo superior como palanca con pinzas romas en una mano, inserte el tubo en la vena porta usando fórceps para agarrar el tubo con la otra mano.
- Use la segunda sutura para atar el tubo en su lugar, si es posible.
NOTA: Este paso es el punto final del sistema cerrado por donde debe salir el perfusato con el impacto del páncreas sobre el líquido presente.
4. Colección
- Realizar perfusión.
- Antes de colocar el tubo de la aorta abdominal inferior, asegúrese de que el sistema de perfusión haya comenzado con el flujo de perfusión a la velocidad deseada (~ 2 ml / min).
NOTA: El perfusado debe drenar desde la canulación de la vena porta y entrar en un tubo de recolección. Se puede usar un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para facilitar el almacenamiento. Las soluciones de perfusión utilizadas aquí son 2,6 mM de glucosa con 1,2 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 16,8 mM de glucosa y 2,6 mM de glucosa con 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) en tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES y 0,1% BSA, pH 7,4). La solución de perfusión comenzó con una solución baja en glucosa a glucosa alta, volvió a glucosa baja y terminó con una solución IBX para control.
- Antes de colocar el tubo de la aorta abdominal inferior, asegúrese de que el sistema de perfusión haya comenzado con el flujo de perfusión a la velocidad deseada (~ 2 ml / min).
- Recoge el perfundido.
- Recoja el perfundido durante intervalos de 30 minutos en tubos de PCR (tubos reemplazados cada 3 minutos).
- Después de cada intervalo de 30 minutos, cambie la solución.
- Realice un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) con las muestras. Esto se puede hacer en un momento posterior si se almacena adecuadamente.
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Resultados
Los resultados después de ELISA deberían demostrar la secreción de insulina del páncreas del ratón en una medida dependiente de los niveles de glucosa perfusada. Debido a la novedad de este procedimiento en ratones, el análisis del resultado y su éxito depende de la comparación con muchos otros ensayos de un páncreas de ratones perfundidos. Una respuesta bifásica de insulina a una alta concentración de glucosa se considera fisiológica, según se evalúa en sujetos humanos y con métodos de p...
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Discusión
El protocolo descrito anteriormente tiene como objetivo crear un sistema cerrado compuesto por el páncreas intacto, dos entradas (arteria celíaca y mesentérica superior) y una salida (vena porta hepática). Todos los demás vasos están ligados para evitar fugas cuando se pasa por la perfusión, así como para garantizar el aislamiento del páncreas con su microambiente. Los pasos de ligadura en este protocolo también permiten el flujo de la perfusión a través del páncreas sin viajar a otros ó...
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Divulgaciones
Los autores informan que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, las Dras. Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela y Priscila Carapeto por sus útiles consultas, asistencia técnica y tutoría a lo largo de este proyecto. Esta investigación fue apoyada por la subvención NIDDK R01 DK132535.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Oxigenador de membrana de fibra | Aparato de Harvard | 73-3757 | Permite que el oxígeno entre en perfusión |
| Almohadilla térmica | Braintree científico | 39OM | |
| Ketamina/xilacina | Veterinario Patterson | 78908598 | |
| Pizarra magnética | Braintree científico | 39OM | |
| Imanes con gomas elásticas | Braintree científico | 39OM | |
| Microscopia | N/A | N/A | Sin empresa específica |
| Tanque de oxígeno | N/A | N/A | Sin empresa específica |
| Tubos de PCR | ThermoFisher/Invitrogen | AM12225 | Se utiliza para la recolección de perfusión |
| Tubo PE-30 | Braintree científico | PE30 | |
| Tubo PE-50 | Braintree científico | PE50 | |
| Bomba peristáltica | N/A | N/A | Sin empresa específica |
| Herramientas quirúrgicas | N/A | N/A | Sin empresa específica |
| Sutura | N/A | N/A | Sin empresa específica |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
