El blanqueo iterativo amplía la multiplicidad con el uso de la automatización de tinción para instalaciones centrales

Resumen

Aquí, describimos la aplicación del método de blanqueo iterativo que extiende la multiplicidad (IBEX) utilizando tinciones de tejidos automatizadas disponibles comercialmente y consideraciones de optimización para el uso de reactivos basados en amplificación de señales de tiramida.

Resumen

El blanqueo iterativo extiende la multiplicidad (IBEX) es una técnica de imagen de fluorescencia multironda basada en amplificación de señal de tiramida (TSA) de alta sensibilidad que permite un examen detallado de numerosas biomoléculas de proteínas en una sola muestra de tejido mediante blanqueo repetido, retinción y registro conjunto de imágenes. A pesar de su creciente adopción para generar inmunotinción altamente multiplexada, la implementación de IBEX de manera automatizada a través de la implementación en las instalaciones centrales ofrece numerosos beneficios, incluido un mayor rendimiento, reproducibilidad y eficiencia general del personal de laboratorio. Aquí, demostramos la aplicación exitosa de IBEX en dos plataformas de autotinción ampliamente utilizadas y discutimos importantes consideraciones de optimización para el diseño de paneles utilizando reacciones basadas en TSA para muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Esto incluye la metodología para probar la sensibilidad de recuperación de antígenos anticuerpos, una consideración importante para el diseño del panel IBEX al determinar la secuencia de desarrollo de anticuerpos. Además, mostramos enfoques de imágenes posteriores utilizando escáneres de portaobjetos completos disponibles comercialmente e ilustramos la alineación y el análisis de calidad utilizando software de fenotipado celular disponible comercialmente. A través de descripciones detalladas de estas metodologías y videos que las acompañan, nuestro objetivo es resaltar la versatilidad y facilidad de IBEX, ofreciendo orientación práctica para que las instalaciones de patología central integren IBEX en sus plataformas de tinción automatizadas existentes.

Introducción

El blanqueo iterativo extiende la multiplicidad (IBEX) es un avance significativo en la inmunohistoquímica fluorescente multironda basada en TSA de alta sensibilidad, que permite la visualización y cuantificación detalladas de numerosas biomoléculas dentro de una sola muestra de tejido. Al emplear ciclos repetidos de blanqueo y retinción, IBEX permite el examen de entornos celulares complejos con una profundidad y claridad incomparables, lo que lo convierte en una herramienta poderosa en el campo de la inmunotinción y la obtención de imágenes multiplexadas ^1,2.

Muchas entidades académicas, gubernamentales e industriales albergan instalaciones de patología centrales dedicadas a apoyar una amplia gama de metodologías de investigación basadas en tejidos destinadas a generar conjuntos de datos morfomoleculares cualitativos y cuantitativos. Estos núcleos son recursos críticos, que brindan servicios especializados basados en tejidos que permiten a los laboratorios de investigación subcontratar procesos de patología molecular complejos y laboriosos y consultar directamente con los patólogos en el diseño del estudio, el desarrollo de ensayos y la interpretación de datos. Para garantizar la consistencia y reducir la variabilidad entre los experimentos, estas instalaciones centrales dependen rutinariamente de instrumentos automatizados de autotinción disponibles en el mercado diseñados para realizar protocolos de tinción estandarizados con alta reproducibilidad y eficiencia³.

Si bien los autostainers se han convertido en la columna vertebral de la inmunotinción en las instalaciones centrales, lo que permite resultados consistentes y de alto rendimiento, aún no se han adaptado para adaptarse a avances más recientes como IBEX. Además, la necesidad de conocimientos especializados en el diseño de paneles, particularmente cuando se utilizan reactivos basados en amplificación de señal de tiramida (TSA)⁴, agrega una capa adicional de complejidad, lo que limita la adopción más amplia de IBEX en los flujos de trabajo de investigación de rutina. Como resultado, los investigadores que desean aprovechar las capacidades de imágenes multiplexadas de alta resolución de IBEX a menudo pueden verse limitados por el equipo existente de sus instalaciones principales. Esta brecha entre las técnicas innovadoras de imágenes y las realidades prácticas de las operaciones centrales de las instalaciones destaca una barrera para la adopción más amplia de IBEX en la investigación académica. Este trabajo tiene como objetivo abordar esta barrera demostrando la aplicación exitosa de IBEX en plataformas comunes de autotinción, centrándose en el uso de reactivos basados en TSA que utilizan tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE). Primero discutimos los pasos necesarios para construir un panel IBEX utilizando tintes a base de TSA y la aplicación de la cubierta de estos paneles a dos diferentes autostainers disponibles comercialmente. En conjunto, esto ofrece una guía práctica sobre las pruebas de sensibilidad de recuperación de antígenos anticuerpos, discute las consideraciones clave para optimizar el diseño del panel y proporciona un método alternativo para la alineación del panel utilizando software comercial que puede estar disponible y a través de laboratorios de patología centrales.

Protocolo

1. Construcción de paneles IBEX con tintes a base de TSA

NOTA: Utilice siempre una preparación fresca de anticuerpos y colorantes y guárdela a 4 °C cuando no esté en uso.

1. Prueba de sensibilidad de recuperación de antígenos
   1. Preparación de diapositivas
      1. Use un micrótomo para recolectar tres secciones seriadas para cada anticuerpo para analizar el mismo tejido incluido en FFPE en tres portaobjetos separados cargados positivamente.
      2. Etiquete los portaobjetos con el anticuerpo que se va a probar, junto con el número de ciclos de recuperación de antígenos que se van a probar: 1 ciclo, 3 ciclos y 6 ciclos.
      3. Seque los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente. Si trabaja solo con marcadores de superficie, hornee portaobjetos a 60 ^°C durante al menos 20 minutos para ablandar la cera. Si trabaja con marcadores nucleares, hornee los portaobjetos a 60 ^°C durante la noche.
   2. Prepare el programa en el autostainer para el diferente número de ciclos, asegurándose de que haya tres pasos de lavado entre cada paso. Consulte la Tabla 1 para ver ejemplos de protocolos para pruebas de 1, 3 y 6 ciclos.
      NOTA: Para cada anticuerpo individual, asegúrese de que el paso del anticuerpo y la aplicación del colorante TSA sean constantes.
      Para la aplicación de colorante a base de TSA, una alternativa a dejar reposar el tinte durante 3-10 min a temperatura ambiente es dejar que el tinte se incube durante 20 min a 37 °C.
   3. Cargue las muestras en el autostainer y ejecute el protocolo para el número de ciclos asociado.
   4. Repita este proceso de los pasos 1.1.1 a 1.1.3 para cada anticuerpo individual que se va a validar y probar.
   5. Retire los portaobjetos del autostainer y colóquelos en PBS.
   6. Monte los portaobjetos con medios de montaje acuosos (igual que para un redondo IBEX) y un cubreobjetos #1.5 para obtener imágenes óptimas.
   7. Utilice un microscopio de epifluorescencia para obtener imágenes del portaobjetos de 1 ciclo para el tinte TSA y DAPI, tomando nota del tiempo de exposición necesario para visualizar la señal.
   8. Repita esto para los portaobjetos de 3 y 6 ciclos, anotando el tiempo de exposición necesario para visualizar el tinte TSA.
   9. Compare los tiempos de exposición en los diferentes números de ciclo. Consulte la Figura 1 para ver ejemplos. Asegura tres ciclos de lavado entre todos los pasos.
      1. Si el tiempo de exposición disminuye con el aumento de los ciclos, coloque este anticuerpo y la tinción en un paso posterior.
      2. Si el tiempo de exposición aumenta con el aumento de los ciclos, coloque este anticuerpo en un paso anterior.
      3. Si no hay un gran cambio en el tiempo de exposición, coloque este anticuerpo en cualquier paso.
      4. Agrupe los anticuerpos en función de los requisitos del ciclo para la pasada inicial en los paneles IBEX.
         NOTA: Para obtener los mejores resultados, realice esta validación en todos los marcadores deseados para un panel IBEX determinado. Realice esta validación cada vez que se cambien los tipos de tejido o cuando trabaje con anticuerpos primarios policlonales con números de lote únicos.
2. Aborde el sangrado de la señal del tinte espectralmente cercano mediante la evaluación de la intensidad de la señal.
   1. Agrupe los anticuerpos en posibles paneles de IBEX en función del número óptimo de ciclos de recuperación, según se determinó anteriormente en 1, 3 o 6 grupos de ciclos.
   2. Preparación de diapositivas
      1. Utilice un micrótomo para crear secciones en serie a partir de una muestra FFPE, una para cada anticuerpo para usar en un solo panel IBEX.
      2. Etiquete cada portaobjetos con uno de los anticuerpos que se utilizarán en el panel IBEX.
      3. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Si trabaja solo con marcadores de superficie, deje que las diapositivas se horneen a 60 ^°C durante al menos 20 minutos para ablandar la cera. Si trabaja con marcadores nucleares, deje que los portaobjetos se horneen a 60 ^°C durante la noche.
   3. Para el grupo de 1, 3 y 6 ciclos, use la configuración de un ciclo de la Tabla 1. Asegurar tres lavados entre todos los pasos
      1. Modifique el protocolo para cada anticuerpo que se utilizará con el tiempo de tinción óptimo.
      2. Use el mismo tiempo TSA para todos los anticuerpos.
   4. Tiñe las muestras en el autoteñidor.
   5. Retire las muestras y coloque los portaobjetos en PBS.
   6. Monte los portaobjetos con medios de montaje acuosos (igual que para un redondo IBEX) y un cubreobjetos #1.5 para obtener imágenes óptimas.
   7. Obtener imágenes de los portaobjetos en un microscopio de epifluorescencia utilizando el tiempo de exposición óptimo para cada imagen.
   8. Determine la intensidad de la señal. Las diapositivas con tiempos de exposición cortos tienen una intensidad de señal muy alta, mientras que las diapositivas con un tiempo de exposición largo tienen una intensidad de señal baja.
   9. Utilice la intensidad de la señal junto con el número de ciclo para desarrollar paneles IBEX.
      1. Agrupe los anticuerpos según el número de ciclo.
      2. Para un grupo determinado de anticuerpos con un número de ciclo específico, asegúrese de que una señal fuerte no esté ópticamente cerca de una señal débil para minimizar el derrame de la señal.
3. Valide los paneles IBEX individuales para asegurarse de que cada panel pueda generar el resultado deseado.
   1. Prepara las diapositivas.
      1. Utilice un micrótomo para crear secciones seriadas, una para cada panel IBEX multiplex, y etiquete con el orden del panel IBEX que se utilizará.
      2. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Si trabaja solo con marcadores de superficie, deje que las diapositivas se horneen a 60 ^°C durante al menos 20 minutos para ablandar la cera. Si trabaja con marcadores nucleares, deje que los portaobjetos se horneen a 60 ^°C durante la noche.
   2. Configure el autostainer.
      1. Para el primer panel, configure el programa de autostainer sin pasos adicionales de recuperación de antígenos.
      2. Para el segundo panel, introduzca pasos de desnaturalización adicionales antes del primer anticuerpo igual al número de pasos de desnaturalización en el primer panel. Consulte la Tabla 2 para ver un panel de ejemplo 1 con cinco anticuerpos y la Tabla 3 para un panel de ejemplo 2 con cuatro anticuerpos. Asegúrese de tres pasos de lavado entre todos los pasos.
      3. Repita según sea necesario para paneles IBEX adicionales, agregando más pasos de desnaturalización.
   3. Retire los portaobjetos del autostainer y colóquelos en PBS hasta que estén listos para montar.
   4. Monte los portaobjetos con medios de montaje acuosos (igual que para un redondo IBEX) y un cubreobjetos #1.5 para obtener imágenes óptimas.
   5. Obtener imágenes de los portaobjetos en un microscopio de epifluorescencia utilizando el tiempo de exposición óptimo para cada imagen y cada tinte TSA.
   6. Evalúe si todos los paneles se muestran correctamente. Si es así, pase a las imágenes IBEX. Si no es así, vuelva a direccionar los ciclos de recuperación y equilibrio de señales.
      NOTA: Se pueden realizar algunos ajustes dentro de un solo panel para optimizar la señal y evitar el "efecto paraguas". Algunas señales muy abundantes pueden bloquear la tinción de las señales posteriores. Mire dentro de un panel determinado para usar primero tintes más escasamente presentes (consulte la Figura 2).

2. Adaptación de IBEX con autostainers utilizando reactivos TSA y plataformas de imágenes de portaobjetos completos (Figura 3)

NOTA: Para comparar los dos autostainers validados utilizados y discutidos en este protocolo, consulte la Tabla 4.

1. Prepare todas las diapositivas para la ejecución de IBEX.
   1. Use un micrótomo para crear secciones FFPE en un portaobjetos cargado positivamente. Asegúrese de incluir un portaobjetos para cada muestra experimental, portaobjetos de control positivo de secciones de tejido que se sabe que contienen los antígenos que se van a fotografiar y un portaobjetos de control negativo en el que se usa PBS en lugar de todos los anticuerpos primarios.
      NOTA: Si trabaja en lotes, incluya una muestra de control de lotes. Una muestra de control de lote es un solo bloque de tejido FFPE que se secciona y se incluye en cada lote de muestras experimentales para su uso en la normalización y el control de la variación experimental entre lotes de muestras de tinción. Esto solo es necesario si no todas las muestras se procesarán juntas.
   2. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Si trabaja solo con marcadores de superficie, deje que las diapositivas se horneen a 60 ^°C durante al menos 20 minutos para ablandar la cera. Si trabaja con marcadores nucleares, deje que los portaobjetos se horneen a 60 ^°C durante la noche.
2. Prepare anticuerpos y colorantes para el primer panel de IBEX que se va a fotografiar.
3. Configure el programa de tinción automática. Consulte la Tabla 2 para ver un ejemplo de un panel de 5 marcadores. Asegúrese de tres lavados entre cada paso.
4. Cargue muestras y anticuerpos en el autostainer y ejecute el programa para teñir las muestras.
5. Retire los portaobjetos del autostainer y aplique un cubreobjetos con medios de montaje acuosos apropiados para imágenes multiespectrales y un cubreobjetos #1.5.
6. Imagen de los portaobjetos dentro de los 2 días posteriores a la tinción
7. Imágenes de fluorescencia en epifluorescencia o escáner de portaobjetos de fluorescencia
   1. Comenzando con la muestra de control positivo bien controlada, cargue la muestra de control positivo en el microscopio.
      1. Localice una señal positiva en la muestra para cada uno de los diferentes antígenos a fotografiar.
      2. Establezca el tiempo de exposición para garantizar la captura del rango dinámico de la mancha mientras minimiza el fondo comenzando con una exposición baja y aumentando gradualmente el tiempo de exposición hasta que la señal esté presente. Haga esto para cada tinte individualmente.
         NOTA: Pruebe la presencia de expresión alta y baja de los marcadores para garantizar la captura del rango dinámico completo.
   2. Guarde los ajustes utilizados para la muestra de control positivo y utilícelos para todos los pasos posteriores de la imagen.
   3. Cargue y obtenga imágenes de la muestra de control negativo y de todas las muestras experimentales utilizando la configuración determinada por la muestra de control positivo.
   4. Verifique que las imágenes tengan una calidad óptima antes de continuar con los pasos siguientes.
8. Eliminación del cubreobjetos
   1. Sumerja los portaobjetos en un frasco Coplin con agua desizada. Coloque el frasco Coplin en un baño de agua a 65 ° C durante 15-20 minutos para facilitar la extracción natural del cubreobjetos. Alternativamente, si se usa un medio de montaje de base acuosa o si el medio de montaje se ha endurecido por completo, retire los cubreobjetos sumergiéndolos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o agua desionizada durante la noche para permitir que los cubreobjetos se caigan naturalmente.
9. Decoloración con LiBH₄
   1. En una campana extractora, preparar una solución fresca de LiBH₄ a una concentración de 1 mg/ml en agua desionizada. Haga lo suficiente para cubrir cada muestra 3 veces.
      NOTA: No prepare más de 10 ml a la vez debido a la reacción de LiBH₄ con agua. Utilice agua desionizada y no Millipore/agua nanopura para una actividad de blanqueo óptima.
   2. Deje reposar la solución durante 20 min. Se formarán burbujas.
   3. Pipetear 1 ml de solución de LiBH₄ en cada portaobjetos en una cámara de tinción en una campana extractora. Deje reposar la solución en el portaobjetos durante 10-15 min.
   4. Retire el LiBH₄ pipeteando el portaobjetos y reemplácelo con 1 ml nuevo de LiBH_4. Deje reposar la solución durante 10-15 min.
   5. Retire el LiBH₄ pipeteando el portaobjetos y reemplácelo con 1 ml nuevo de LiBH_4. Deje reposar la solución durante 10-15 min.
   6. Retire el LiBH₄ de los portaobjetos mediante pipeteo y sumérjalos en agua desionizada o PBS para su almacenamiento a corto plazo (no más de 1 día).
   7. En un día, pase a la siguiente ronda de tinción de IBEX.
   8. Opcional: monte portaobjetos en húmedo y realice una visualización rápida en un endoscopio de epifluorescencia para verificar el éxito del blanqueamiento.
10. Montaje húmedo de la corredera en el autostainer y segunda serie de tinción de IBEX
    1. Prepare todos los anticuerpos y soluciones de colorante TSA para el autostainer.
    2. Para el autostainer de Ventana:
       1. Cuando esté listo para comenzar la tinción automática, pipetee aproximadamente 1 ml de tampón de lavado con tinción automática en el portaobjetos para evitar que se seque el soporte húmedo.
       2. Cargue las correderas montadas en húmedo en el autostainer.
    3. Para el Bond Rx:
       1. Coloque los mosaicos de cubierta en las diapositivas.
       2. En la parte superior de la cubeta, pipetee 300 μl de tampón de lavado para permitir que la solución fluya hacia el espacio entre la muestra y la cubrición.
       3. Cargue muestras en el autostainer.
    4. Configure el programa de tinción automática siguiendo el ejemplo de la Tabla 2 con N establecido en el número de anticuerpos en el panel.
    5. Retire los portaobjetos del autostainer y aplique un cubreobjetos con medios de montaje acuosos apropiados para imágenes multiespectrales y un cubreobjetos #1.5.
    6. Tome imágenes de los portaobjetos dentro de los 2 días posteriores a la tinción siguiendo el procedimiento de muestra descrito en el paso 2.7 para configurar la sesión de imágenes y recopilar imágenes.
    7. Después de la obtención de imágenes, lea las muestras como se describe en los pasos 2.8-2.9.
11. Repita para todos los paneles IBEX deseados.

3. Análisis de muestras con software disponible en el mercado

1. Complete escaneos completos de los portaobjetos teñidos antes de proceder a la alineación.
2. Si el software lo permite, realice la desmezcla espectral a través de la función de desmezcla automatizada integrada en las funciones de escaneo, incluida la eliminación de los espectros de autofluorescencia. Si se trata de una función del software que se está utilizando, seleccione la opción de desmezcla y ejecute con la configuración estándar y los tintes preestablecidos
   NOTA: Se puede generar una desmezcla personalizada en la mayoría de los programas que permiten la desmezcla. Para crear una biblioteca, se agregan secciones individuales de tejido teñidas con un solo fluoróforo a las mediciones del software. También se escanea una región de tejido no teñido o autofluorescente para caracterizar el espectro de autofluorescencia, y esto se selecciona con la herramienta de autofluorescencia. Estos espectros se compilan dentro del programa presionando "preparar imagen" y luego se exportan a una biblioteca de desmezcla específica del proyecto. Esta biblioteca se selecciona como biblioteca de desmezcla en la opción de desmezcla.
3. Importe las diapositivas escaneadas en un software de análisis de imágenes disponible en el mercado para su alineación.
4. Registro de portaobjetos de múltiples rondas de IBEX
   1. Seleccione dos iteraciones de rondas de IBEX para registrarse.
   2. Haga clic derecho en los dos y seleccione la opción Registrarse .
   3. Seleccione el registro predeterminado con registro de alta resolución para un intento inicial de registro.
   4. Alternativamente, seleccione Registro de un solo canal de las opciones y seleccione un solo canal que sea consistente en todas las ejecuciones de IBEX.
      NOTA: Esta opción es útil para tintes resistentes al blanqueo (consulte materiales para los que los tintes no blanquean).
5. Alineación de imágenes
   1. Abra una de las imágenes registradas.
   2. En la pestaña Herramientas , en Registro de imágenes, seleccione Herramientas de registro para abrir todas las imágenes registradas.
   3. En la pestaña Herramientas de registro , seleccione la función de punto de referencia.
   4. Utilice la función de punto de referencia para ajustar la alineación de diapositivas completas.
      1. Marque los puntos de referencia en una imagen de diapositiva manualmente.
      2. En las otras imágenes de IBEX, marque el mismo punto de referencia. El programa refinará la alineación utilizando el punto de referencia identificado. Repita para ajustar la alineación.
   5. Una vez satisfecho con la alineación, fusione las guías con el fusible | Función de tinción en serie.
   6. Repita este proceso con cualquier ronda adicional de imágenes IBEX hasta que se complete una composición final de todas las imágenes.
6. Análisis de imágenes
   1. Segmentación de células
      1. En la pestaña Análisis , seleccione y abra el módulo HighPlex, luego seleccione el módulo de fenotipado para la identificación celular.
         1. Cargue todos los marcadores y comience por encontrar todos los núcleos usando la pestaña Detección nuclear en el módulo Highplex . Cargue marcadores en la pestaña Selección de tinte . Identifique las células mediante la tinción DAPI.
         2. En la pestaña Analizar , active la herramienta Ajuste en tiempo real utilizando los siguientes parámetros clave: Intensidad nuclear mínima establecida para filtrar la señal de fondo; Brillo máximo de la imagen configurado para controlar la visibilidad general de la señal; Segmentación nuclear Agresividad establecida para refinar los límites de los núcleos detectados.
         3. Ajuste cada parámetro cuidadosamente para garantizar una segmentación precisa.
   2. Detectar los marcadores de citoplasma y membrana.
      1. Vaya a la pestaña Detección de membrana y citoplasma .
      2. Establezca el Radio mínimo del citoplasma en un valor apropiado para la muestra para el tamaño esperado de las células.
      3. En la opción Colorantes de membrana , especifique qué canales son marcadores de membrana.
         NOTA: Esto debería dar lugar a una mejor segmentación de las células individuales para su posterior análisis.
   3. Umbral de marcadores y asignación de fenotipos
      1. Para cada marcador, establezca los umbrales para las señales positivas frente a las negativas. Haga esto en las pestañas generadas para cada marcador.
      2. Realice el umbral manual para cada marcador para identificar poblaciones.
      3. Alternativamente, utilice un enfoque automatizado basado en bioinformática para el umbral. En el avanzado | Almacenar datos de objetos (celdas), cambie la opción a Verdadero. En Exportación | Datos de objeto, exporte el conjunto de datos para obtener información de expresión de marcador para cada celda identificada.
      4. Importe estos datos en un software adicional para un análisis más detallado y personalizado. Las opciones de software para un análisis más detallado se encuentran en la Tabla 5.

Resultados

Proporcionamos un ejemplo de un panel IBEX que utiliza reactivos basados en TSA en Autostainer 2 (Figura 4). Cada marcador se puede delinear claramente y hay un sangrado mínimo entre los marcadores. La imagen se recopiló a través de dos rondas de tinción. La muestra es tejido pulmonar después de la infección por Mycobacterium tuberculosis. Los dos paneles de tinción de IBEX se alinearon utilizando un software de ejemplo disponible en el mercado. Utilizando el enfoque IBEX con reactivos TSA optimizados (como se describe aquí), se puede ver y apreciar la organización espacial de las células inmunitarias, los marcadores inflamatorios y las células pulmonares especializadas. La optimización adecuada permite que los marcadores aparezcan fácilmente con un fondo mínimo.

Figura 1: Prueba de recuperación de antígenos con un fluoróforo con una emisión de 520 nm de dos antígenos diferentes. RAGE y CD3e se visualizaron utilizando tiempos de exposición conservados. El epítopo de este anticuerpo RAGE es altamente sensible y susceptible a la recuperación repetitiva de antígenos con una rápida caída de la sensibilidad del ensayo con recuperaciones de antígenos posteriores. Por el contrario, la sensibilidad del ensayo CD3e mejora con múltiples rondas de recuperación de antígenos. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: RAGE = Receptor para productos finales de glicación avanzada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de la importancia del desarrollo de secuencias con respecto al efecto paraguas. RAGE es un marcador altamente expresado en las células AT1 y, en combinación con CD31, bloquea eficazmente la inmunorreactividad del SARS-CoV-2. Sin embargo, cuando se realiza primero la IHC del SARS-CoV-2, se pueden visualizar todas las señales. Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: RAGE = receptor de productos finales de glicación avanzada; AT1 = Tipo alveolar 1; SARS-CoV-2 = Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2; IHQ = inmunohistoquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Descripción general del proceso utilizando equipos de tinción automatizados para el protocolo IBEX. Montaje en húmedo para la ronda 2 o superior del proceso de tinción para evitar que el tejido se seque. Abreviatura: IBEX = El blanqueamiento iterativo extiende la multiplicidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de IBEX con colorantes basados en TSA de autostainer 2 en un pulmón infectado con Mycobacterium tuberculosis. El panel 1 contiene todos los tintes y el panel 2 contiene tintes que eran aptos para blanquear. Se presenta una imagen combinada de todos los canales a través de la imagen IBEX completa del pulmón. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: IBEX = blanqueamiento iterativo extiende la multiplicidad; TSA = Amplificación de señal de tiramida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Un protocolo de ejemplo para validar los efectos del número de ciclo en los anticuerpos para las pruebas de ciclo 1, 3 y 6. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Un ejemplo de panel 1 con cinco anticuerpos para el autostainer IBEX para la validación del panel. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Un panel de ejemplo 2 con cuatro anticuerpos para el autostainer IBEX para la validación del panel. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Comparación de dos autostainers. Tabla que resume los pros y los contras del Ventana Autostainer y el Bond Rx. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Resumen del software para el análisis de imágenes. Tabla que resume algunos de los enfoques de análisis y herramientas de software disponibles para el análisis de imágenes después de la segmentación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Aquí, proporcionamos consideraciones para adaptar el protocolo IBEX a las instalaciones de patología central con la aplicación de equipos de tinción automatizados y la optimización de reactivos basados en TSA en el protocolo IBEX. Demostramos cómo optimizar mejor las rondas repetidas de recuperación de antígenos y la carga adecuada en la ronda 2 o superior en el equipo automatizado. Además, demostramos un método adicional para realizar la alineación utilizando el software Halo que puede estar disponible en las instalaciones principales. Se ha demostrado que estos enfoques son útiles para determinar las diferencias en los entornos pulmonares en el tejido de primates no humanos después de las infecciones por SARS-CoV-2⁵.

Un componente clave de este trabajo es resaltar la necesidad de una amplia optimización del diseño del panel IBEX antes de la tinción de los tejidos experimentales. En particular, con el uso de reactivos basados en TSA, se deben tener en cuenta algunas consideraciones que no se ven en los métodos IBEX básicos. El primero es el impacto de múltiples rondas de recuperación de antígenos en la sensibilidad de los anticuerpos. Con los reactivos basados en TSA, cada nuevo desarrollo de anticuerpos está precedido por la desnaturalización de anticuerpos. Algunos pares de anticuerpos/antígenos serán susceptibles a rondas adicionales de recuperación de antígenos y disminuirán la sensibilidad del ensayo, mientras que otros obtendrán una mayor sensibilidad con la desnaturalización/recuperación de antígenos repetitiva. Es importante realizar pruebas cuidadosas de cada anticuerpo en el tejido diana antes de diseñar los paneles para garantizar las mejores prácticas de tinción e informar el orden de secuencia tanto de los anticuerpos como de los colorantes fluorescentes. Los tampones, incluidos los basados en citrato (pH 6,0) y Tris-EDTA (pH 9,0), se analizan para detectar todos los anticuerpos para determinar las condiciones óptimas de recuperación de antígenos. Esto implica evaluar sistemáticamente cada tampón para identificar cuál maximiza la exposición al antígeno para un anticuerpo determinado. Además, la temperatura (p. ej., 20-37 °C), el tiempo de incubación (normalmente 30-60 min) y las condiciones de bloqueo se optimizan para reducir la tinción de fondo inespecífica y garantizar la unión específica de los anticuerpos primarios y secundarios, si es necesario. El bloqueo antes de los anticuerpos primarios y secundarios puede incluir el uso de reactivos de bloqueo disponibles comercialmente para tener en cuenta la autofluorescencia específica del tejido o las interacciones no específicas. Otras consideraciones importantes que deben optimizarse antes de finalizar los paneles IBEX incluyen el efecto paraguas, donde puede ocurrir el blindaje de los epítopos si el orden no se atiende a la pregunta de investigación específica que se hace⁶. Para evitar el sangrado fluorescente, es típico colocar objetivos de antígenos de mayor expresión en canales rojos lejanos que tienen el menor sangrado y marcadores más débiles en el rango de 480-520 nm, que tendrán la mejor relación señal-ruido dado que estos tintes fluorescentes son los más brillantes⁷. Sin embargo, se debe tener cuidado con las muestras de tejido altamente autofluorescentes que pueden ser más brillantes en este rango; Recomendamos abordar este problema mediante imágenes de tejido sin colorantes para abordar los niveles potenciales de autofluorescencia. Juntos, estos pasos de optimización, tomados con toda la optimización y los controles normales que normalmente se realizan con IBEX, pueden informar el diseño adecuado del panel para IBEX con reactivos TSA.

En este método, hemos demostrado el uso de dos autotinciones comunes. Sin embargo, estos enfoques también podrían aplicarse a otros métodos de autotinción. La parte clave aquí es la eliminación óptima de cubreobjetos y la carga húmeda para rondas de tinción adicionales. Además, no especificamos ninguna configuración específica del microscopio. Aunque los kits pueden recomendar el uso con ciertos sistemas de imágenes para un escaneo óptimo de portaobjetos, cualquier configuración de microscopio, particularmente un microscopio de epifluorescencia con cubos de filtro compatibles y una fuente de luz LED de amplio espectro, debería funcionar. Algunos tintes requieren detectores multiespectrales o cubos de filtro especializados, que pueden no estar disponibles en todos los laboratorios y pueden presentar desafíos cuando se usan con cubos de filtro estándar debido a su superposición espectral. Estos colorantes se separan mejor utilizando sistemas de imágenes multiespectrales o filtros altamente específicos. Algunos fluoróforos quedan fuera del rango de los filtros rojos lejanos convencionales (generalmente ~ 700 nm) y requieren un cubo de filtro especializado o un detector capaz de capturar señales de infrarrojo cercano. Los microscopios especializados se construyen con estos filtros, pero hay alternativas disponibles. Estos requerirán una optimización adicional para determinar cómo funcionan los tintes en una configuración de microscopio determinada.

La desmezcla multiespectral es muy recomendable para IHC fluorescente multiplex, particularmente cuando se trabaja con tejidos propensos a la autofluorescencia, ya que separa eficazmente la señal real del ruido de fondo. La autofluorescencia, que a menudo se superpone con los espectros de emisión de fluoróforos de uso común (particularmente en canales de longitud de onda de mayor energía), puede oscurecer o interferir con señales específicas, reduciendo la precisión. La desmezcla espectral desenreda matemáticamente los espectros de emisión superpuestos, aislando las señales fluorescentes reales mientras "limpia" la autofluorescencia no deseada. La desmezcla espectral es particularmente valiosa en los flujos de trabajo de IBEX, donde lograr las señales más limpias posibles es fundamental debido a la naturaleza iterativa del proceso de tinción e imágenes. En IBEX, las señales de múltiples rondas de tinción se visualizan, blanquean y apilan una encima de la otra para crear una imagen compuesta. Cualquier autofluorescencia o sangrado que permanezca sin resolver en una ronda puede propagarse a través de las imágenes apiladas, lo que complica el análisis posterior y reduce la confianza en la localización de los marcadores. La desmezcla espectral aísla eficazmente las señales de fluorescencia verdaderas de la autofluorescencia de fondo, lo que garantiza una detección de señales más limpia y precisa en cada ronda individual. Esta claridad de señal es esencial para generar imágenes compuestas confiables donde se analizan múltiples marcadores juntos en rondas, lo que permite un fenotipado y un análisis espacial confiables. La plataforma de imágenes utilizada para este protocolo tiene capacidades de desmezcla integradas, pero se necesitan más opciones de desmezcla para la compatibilidad con otras plataformas de imágenes fluorescentes de portaobjetos completos.

Además, una limitación de este trabajo es la naturaleza patentada de los autostainers, ya que sus reactivos asociados y tampones de lavado están optimizados para estos sistemas, pero las formulaciones específicas siguen sin revelarse. Además, nos hemos centrado exclusivamente en un software de análisis de imágenes disponible comercialmente para el análisis de imágenes de portaobjetos completos y reconocemos que el costo de las licencias de software puede presentar una barrera financiera para algunos laboratorios. El software de análisis adicional ^8,9 y las opciones en R parecen prometedores; en particular, el Grupo Bodenmiller¹⁰, que ha creado un conjunto de paquetes que parece óptimo para núcleos, en el sentido de que IMCDataAnalysis¹¹ está destinado a un flujo de trabajo reproducible en el análisis descendente de imágenes multiplexadas en R. Sin embargo, se necesitan esfuerzos futuros para desarrollar y caracterizar alternativas accesibles y rentables para el análisis de IBEX de portaobjetos completos para garantizar una adopción más amplia en entornos de recursos limitados. Además, este enfoque con el uso de las autotinciones para IBEX se puede adaptar para una tinción más tradicional en IBEX, incluso con anticuerpos primarios conjugados fluorescentes, o con anticuerpos secundarios estándar sin los colorantes basados en TSA si el tejido es de calidad lo suficientemente alta y un tiempo de fijación óptimo para permitir una buena señal.

En general, esperamos que este trabajo ayude con la aplicación de IHC fluorescente multiplex basado en TSA utilizando equipos de instalaciones centrales de patología utilizados de forma rutinaria para adaptar IBEX a estos entornos. Este tipo de aplicación realmente destaca la versatilidad del protocolo IBEX y demuestra su utilidad incluso en muestras de tejido difíciles o en enfoques de lotes grandes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kits de reactivo de manchas Alexa TSA	ThermoFisher		Tintes alternativos TSA si no hay filtros de microscopía de ópalo disponibles. Estos incluyen Alexa Fluor 488 (canal azul/verde), Alexa Fluor 555 o 568 (canal rojo), Alexa Fluor 647 (canal rojo lejano), Alexa Fluor 750 (infrarrojo cercano, si está equipada con filtros adecuados).
Anticuerpo Arg1	Señalización celular	93668	Usado en la Figura 4 en 1:100
Material Blades	Leica Biosystems		O similar, el perfil alto o bajo dependerá del tipo de tejido
Anticuerpo CD11b	Abcam	ab133357	Usado en la Figura 4 en 1:2000
Anticuerpo CD163	Abcam	ab182422	Usado en la Figura 4 en 1:500
Anticuerpo CD31	Señalización celular	77699S	Usado en la Figura 2 en el minuto 1:100
Anticuerpo CD3e	Dako	A045201-2	Usado en la Figura 1 en el minuto 1:100
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	O algo similar
Material Abrigos	VWR	v48393-026	O algo similar
Anticuerpo CX3CR1	Abcam	ab308613	Usado en la Figura 4 en 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Utilizado para medir la intensidad de la señal
Slide Fisher Superfront Slides	Fisher Scientific	22-037-246	O algo similar
Software HALO	Indica Labs		Ejemplo de software de análisis de imágenes comercialmente disponible. Se usan para alinear y analizar imágenes.
Anticuerpo Iba1	Señalización celular	17191	Usado en la Figura 4 en 1:800
Software inForm	Akoya		Utilizado para medir la intensidad de la señal
Anticuerpo iNOS	Abcam	ab283655	Usado en la Figura 4 en 1:400
Instrument Leica Bond Rx (o RXm)	Leica Biosystems	21.2201	En el texto se le denomina "Autostainer 1". Asegúrate de que todos los reactivos asociados estén también disponibles, incluyendo cajas de tinción y soluciones a granel.
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Manténganse en un entorno anhidro
Instrument Mantra Snap	Akoya		Se necesita un microscopio multiespectral de harina para proteger los tintes. Ejemplo de microscopio que puede usarse para detectar tintes de ópalo.
Microtomo Tool	Leica Biosystems		O similar con accesorios preferidos como pinceles
Kit de reactivo de tinción Opal IHC 480	Akoya	FP1500001KT	Usado en la Figura 4
Reactivo de tinción Kit Plex Opal IHC 6-plex	Akoya	NEL821001KT	520 y 620 no decoloran, como se usan en las Figuras 1, 2 y 4
Kit de reactivo de tinción Opal IHC 780	Akoya	FP1501001KT	Usado en la Figura 4
Horno Tool	Millipore Sigma	Z683329	O algo similar, también se puede hacer en autostainer
Anticuerpo Pancitoqueratina	Abcam	ab9377	Usado en la Figura 4 en el minuto 1:50
Reagent PBS (opcional)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument FenoImagen	Akoya		Imagen multiespectral de diapositivas completas con desmezclado espectral integrado incluido en el software
Reactiv ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	O medios de montaje acuosos similares
Anticuerpo ProSP-C n-terminal (ProSPC)	Biorreactivos de las Siete Colinas	WRAB-9337	Usado en la Figura 4 en el minuto 1:250
Anticuerpo RABIA	R& D	MAB1179	Usado en las Figuras 1 y 2 en el minuto 1:50
Reactivo Buffer de reacción	Roche	NC1895692	Para su uso con el autotinzador Ventana
Anticuerpo SARS-CoV-2-N	Señalización celular	68344	Usado en la Figura 2 en 1:1000
Portaportaobjetos TOMO Adhesion CC Portaobjetos de microscopio CC-WH	Avantik	SKUSL6519-1	Si la adherencia del tejido es motivo de preocupación
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		En el texto se le denomina "Autostainer 2". Asegúrate de que todos los reactivos asociados estén también disponibles, incluyendo cajas de tinción y soluciones a granel.
Reactivo Buffer de lavado	Leica Biosystems	AR9590	Para uso con Leica Bond autostainer
Reactivo Agua	Fisher Scientific	15-230-147	La mejor DI es la mejor, no la milipore
Baño María Tool	Leica Biosystems	140607020C1	O algo similar