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Desarrollo de un modelo de lesión pulmonar aguda de lechones neonatales que recrea el entorno temprano de los pulmones de los lactantes prematuros

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DOI:

10.3791/68058

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31 de octubre de 2025

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1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo de un modelo de lechón neonatal de lesión pulmonar aguda que modela los eventos patogénicos tempranos que ocurren en el pulmón prematuro, incluida la cantidad de surfactante subadecuada, hiperoxia, ventilación a alta presión e inflamación, para facilitar la comprensión de los desencadenantes moleculares de la displasia broncopulmonar y mejorar la traducción terapéutica.

Resumen

El nacimiento prematuro es una causa importante de morbilidad y mortalidad pediátrica. La displasia broncopulmonar (DBP) es una consecuencia grave de la prematuridad extrema, que conduce a alteraciones del crecimiento pulmonar y efectos duraderos en el desarrollo. La patogénesis de la DBP es multifactorial, e incluye la ventilación mecánica, la hiperoxia y la inflamación como los principales impulsores de su desarrollo. Actualmente, no existe tratamiento para la DBP. En este estudio, se presenta un nuevo modelo factible y reproducible de lesión pulmonar aguda (LPA) de lechones neonatales, que imita los estímulos clínicos a los que se enfrenta el pulmón prematuro humano. El modelo de lechón neonatal ALI de múltiples golpes, que combina el agotamiento de surfactante, la hiperoxia, la ventilación a alta presión y la administración intratraqueal de lipopolisacáridos (LPS), da como resultado una oxigenación alterada, una función pulmonar alterada, inflamación con infiltración de neutrófilos y lesión pulmonar histológica. Sus principales ventajas son el uso de los estímulos nocivos conocidos por impulsar la patogénesis del TLP y su bajo mantenimiento. Genera ALI de alta fidelidad, cumpliendo con los criterios ALI de la American Thoracic Society. Los modelos animales grandes, como este modelo de lechón, son fundamentales para comprender los factores patogénicos tempranos, identificar objetivos terapéuticos y facilitar la traducción clínica a los pacientes.

Introducción

La prematuridad extrema es una de las principales causas de muerte en niños antes de los cinco años de edad1. La complicación grave más común de la prematuridad es la displasia broncopulmonar (DBP), una enfermedad pulmonar crónica, con factores contribuyentes multifactoriales que incluyen inflamación, estrés oxidativo por hiperoxia y traumatismos inducidos por ventiladores2. Este microambiente conduce a un deterioro del crecimiento pulmonar, lo que puede tener un impacto duradero en el crecimiento y desarrollo de los recién nacidos prematuros3. Actualmente, no existe tratamiento para la DBP.

Una revisión sistemática reciente sobre el uso de células estromales mesenquimales como tratamiento potencial para la DBP encontró que los datos preclínicos estaban únicamente en roedores4. Este fenómeno es común dada la amplia disponibilidad, facilidad de uso y mantenimiento de los modelos de roedores. Sin embargo, la reproducción de estudios en modelos animales grandes es fundamental para garantizar el éxito en los esfuerzos traslacionales para terapias nuevas y futuras para recién nacidos prematuros. Muchos ensayos clínicos fracasan debido a estudios preclínicos inadecuados5, lo que ralentiza el desarrollo del tratamiento para los pacientes. Si bien el uso de un modelo de primates no humanos es un modelo preclínico preferido para sentar las bases para los ensayos clínicos en humanos, es laborioso, costoso y de difícil acceso. El modelo de lechones neonatales es ventajoso, con el uso de medicamentos y equipos similares a la atención neonatal, imitando el entorno clínico de cuidados intensivos neonatales, lo que lleva a una mayor viabilidad para la traducción clínica. Además, el sistema inmunológico de los pulmones porcinos se parece mucho al de los humanos 6,7,8,9, compartiendo más del 80% de la variación genética del receptor tipo toll 4 10, con macrófagos que reaccionan a los lipopolisacáridos (LPS)11,12 y la producción de óxido nítrico13, posibles contribuyentes de inflamación en el pulmón humano14. Además, el surfactante pulmonar derivado de porcino es un tratamiento clínicamente establecido utilizado para la enfermedad pulmonar aguda en recién nacidos prematuros15.

Este protocolo presenta la generación de un nuevo modelo de lesión pulmonar aguda (ALI) de múltiples golpes en animales grandes de un día en lechones recién nacidos con resultados consistentes, estandarizados y traducibles de acuerdo con los criterios ALI de la American Thoracic Society 16,17,18. Los lavados pulmonares salinos repetidos para el agotamiento del surfactante con ventilación de alta presión y la posterior LPS u otra exposición tóxica se han utilizado en cerdos adultos para inducir lesiones pulmonares18. Sin embargo, los modelos similares disponibles en lechones neonatales son escasos19,20. Este protocolo describe cómo inducir la lesión pulmonar con un protocolo adaptado de lavados pulmonares por agotamiento de surfactante 21,22,23 bajo ventilación hiperóxica y de alta presión, seguido de un desencadenante inflamatorio utilizando LPS instilado directamente en el pulmón. Este modelo está preparado para la administración de un tratamiento de elección ya sea localmente (intratraqueal - IT) o sistémicamente (intravenoso - IV) después de la lesión pulmonar inducida, con monitoreo de su efecto durante 5 h. El marco general imita de cerca la condición de los pulmones de los bebés prematuros. El agotamiento del surfactante recrea el síndrome de dificultad respiratoria, marcado por la falta de surfactante al nacer. Esta dolencia puede asociarse con problemas de barotrauma, atelectotrauma y oxigenación que requieren altos niveles de oxígeno y ventilación mecánica. Por último, la mayoría de los bebés prematuros nacen en un ambiente inflamatorio debido a corioamnionitis o infección, características que se intentaron replicar mediante la administración de LPS en este modelo de lechón. Este modelo de ALI de múltiples golpes crea estímulos clínicos similares a los que se enfrenta el pulmón humano prematuro que ofrecerán información inestimable sobre los procesos patogénicos tempranos del TLP y la posible optimización de la administración de la terapia para una traducción clínica eficaz24.

Protocolo

Todos los experimentos son realizados por personal certificado de acuerdo con la normativa nacional e institucional (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) previa aprobación por el Comité Regional de Cuidado de Animales y el Servicio de Cuidado de Animales y Veterinaria (protocolo OHRIe-3731). Para este modelo se utilizaron lechones recién nacidos de ambos sexos, de 0 a 3 días de edad, con una raza mixta Yorkshire, Landrace y Duroc. Se proporciona una descripción detallada de los pasos (número de paso identificado entre paréntesis) para la preparación, la anestesia, el manejo de líquidos y medicamentos y el monitoreo utilizados durante toda la duración del experimento (1-3), los procedimientos quirúrgicos (4) incluido un período de estabilización (5) antes de inducir la lesión pulmonar de múltiples golpes (7), con observación posterior a la lesión y ventilación de mantenimiento (6, 8) que termina con la eutanasia y la finalización del experimento (10). También se presenta un procedimiento estandarizado opcional para el tratamiento intratraqueal (9). El tiempo total desde la granja hasta el final del experimento y la recolección de muestras es de aproximadamente 12-15 h. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

  1. Encienda y calibre los monitores y el ventilador antes de la llegada del lechón. Asegúrese de que las tarjetas de memoria estén insertadas en el monitor para el registro continuo de datos durante el experimento.
  2. Ajuste el ventilador con una presión inspiratoria máxima (PIP) de 15 cmH2O, presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 6 cmH2O, flujo inspiratorio de 8 L/min, frecuencia respiratoria (RR) de 30/min, tiempo inspiratorio (Tinsp) de 0,4 s, fracción de oxígeno inspirado (FiO2) de 1,0 y, conecte un nuevo circuito de ventilación y humidificador.
  3. Prepare paquetes quirúrgicos estériles, paños, consumibles (incluidos medicamentos, consulte la Tabla de materiales), catéteres y el CRF impreso. Aumente la temperatura de la sala quirúrgica a 25 °C o más según lo considere necesario el equipo de investigación. Encienda la manta térmica / colchón de agua a 39 ° C. Prepare un sistema de calentamiento de aire forzado que esté listo para usar si se requiere una regulación adicional de la temperatura.
  4. Coloque una bolsa de 1 L de solución salina normal en un baño de agua tibia (39 °C) para preparar los lavados pulmonares.
  5. Instale bombas de infusión de medicamentos (ketamina y propofol) y agregue nuevas bolsas de Lactat Ringers y dextrosa a temperatura ambiente a las bombas de fluidos.
  6. Piglet se queda con la cerda en la granja local y tiene libre acceso a ella hasta que un miembro del equipo de investigación lo recoja. Tenga en cuenta el sexo, la edad, el tamaño de la camada y la hora de nacimiento.
    NOTA: En un vehículo de transporte universitario aprobado con un conductor calificado, un miembro del equipo experimentado está presente durante todo el transporte. El lechón se coloca en un gran transportín blando cerrado, que le permite moverse de manera segura, libre y acostarse sin restricciones (con una almohadilla térmica de goma de agua caliente envuelta en mantas si es necesario). Esto asegura que el lechón permanezca tranquilo (a menudo se duerme) en este ambiente relajante. El transportador que contiene el lechón se asegura en su lugar con el cinturón de seguridad. El miembro del equipo tiene la función de calmar suavemente al lechón y evitar ruidos fuertes para mantener el nivel de estrés del lechón al mínimo.
  7. Al llegar a la institución de investigación, mantenga el ruido al mínimo y sostenga suavemente al lechón mientras coloca el cono nasal de anestesia en su cara.

2. Preparación de animales

NOTA: Esta sección incluye la inducción y el mantenimiento de la anestesia (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).

  1. Inicie el flujo de O2 sin isoflurano al colocar el cono de la nariz en su lugar. Cuando el lechón esté tranquilo, iniciar isoflurano y aumentar hasta administrar isoflurano al 3% (aproximadamente 60 s). Controle la respiración cuidadosamente y ajuste el isoflurano en consecuencia.
  2. Verifique la falta de respuesta del lechón mediante un pellizco duro en el dedo del pie.
  3. Una vez que el lechón no responda, péselo y mídalo para la dosis adecuada de medicamentos.
  4. Inyecte buprenorfina HCL (0,04 mg / kg) por vía intramuscular (IM) con una aguja de 25 G en la pata trasera para analgesia.
  5. Conecte el oxímetro de pulso a la parte superior derecha del casco (pre-ductal), el manguito de presión arterial no invasivo (hasta que se canule la arteria femoral) y los cables de ECG.
  6. Inserte 24 G de angiocatetos en ambos oídos. Conecte juegos de extensión de 6" con solución salina con llaves de paso de 4 vías. Apoye el oído con un depresor de lengua para evitar la obstrucción posicional.
  7. Obtenga sangre del catéter auditivo insertado para medir la glucosa en sangre (GS) con un glucómetro calibrado según las instrucciones del fabricante.
  8. Inicie la infusión de D5W por vía intravenosa (IV) a 5 ml / kg / h y ajuste de acuerdo con los niveles de glucosa en sangre para apuntar a un nivel de glucosa en sangre de 4-5 mmol / L.
  9. Administrar inyecciones en bolo de analgesia / anestesia en la vena del segundo oído.
    NOTA: Se requiere una comprensión crítica de las propiedades y los efectos secundarios de estos medicamentos para su uso óptimo y seguro.
    1. Administre un bolo de 2 mg/kg IV de ketamina diluida (10 mg/mL) y un bolo de 5 mg/kg IV de propofol (10 mg/mL, 1%) administrado en múltiples bolos de menor volumen. Tenga cuidado con la posibilidad de que ocurra apnea después de un bolo de propofol. Continuar la administración cuidadosa de bolos de propofol (hasta un total de 5 mg/kg) hasta que el lechón no responda a la prueba de pellizco del dedo duro y se establezca la infusión continua de propofol.
    2. Suspenda el isoflurano (una vez iniciada la infusión intravenosa de propofol) y continúe con anestesia intravenosa continua durante el resto del experimento.
  10. Comience la infusión continua del siguiente régimen anestésico con una titulación cuidadosa basada en la frecuencia cardíaca y la presión arterial, incluido el reflejo de abstinencia para alcanzar la profundidad quirúrgica estable de la anestesia:
    1. Propofol (10 mg/ml) a razón de 10-30 mg/kg/h (equivalente a 1-3 ml/kg/h) IV.
    2. Ketamina (100 mg/ml) a razón de 5-10 mg/kg/h (equivalente a 0,05-0,1 ml/kg/h) IV.
      NOTA: Las líneas de infusión de analgesia / anestesia están conectadas al catéter de oído contralateral de la infusión D5W. Es posible que se requiera un ajuste a la ingesta total de líquidos y la temperatura ambiente para garantizar un soporte y una homeostasis adecuados.

3. Líquidos, medicamentos y monitoreo

NOTA: Esta sección proporciona información sobre cómo mantener la hidratación, el suministro de glucosa, la analgesia / anestesia y garantizar una revisión adecuada de los datos, inquietudes o problemas experimentales.

  1. Asegúrese de que la velocidad total de infusión intravenosa de líquido combinado (LRS y D5W) para la homeostasis sea generalmente de 5-8 ml / kg / h.
    1. Administre D5W en el catéter venoso del oído a 5-10 ml / h (ajustado cada hora según los valores de glucosa en sangre arterial (GS) - objetivo 4-5 mmol / L).
    2. Administrar LRS a través del catéter venoso femoral a una velocidad de 1-6 ml/kg/h para mantener la homeostasis del líquido. Para evitar la coagulación del acceso arterial y venoso, conecte una bolsa de infusión NS heparinizada a presión al transductor y mantenga la presión entre 250 y 300 psi.
    3. Asegure la profundidad anestésica general y la analgesia adecuadas durante toda la cirugía y antes de comenzar el período de estabilización (paso 5.1) e inducir la relajación muscular.
  2. Seguimiento de los diferentes parámetros (trabajo a tiempo completo para una persona durante todo el experimento).
    NOTA: Monitoreo y documentación de signos vitales, configuraciones de ventiladores, intervenciones, muestras tomadas, medicamentos, con dosis y tiempos, en una CFR impresa prefabricada (ver Expediente complementario 1) durante todo el experimento. Los datos continuos registrados del monitor de presión y el ventilador se guardan al final del experimento para su posterior análisis.
    1. Controle la saturación de oxígeno (SpO2): asegúrese de que la señal del oxímetro de pulso preductal (casco superior derecho).
    2. Controle la frecuencia cardíaca (FC): conecte los cables de ECG al lechón.
    3. Para controlar la temperatura, inserte el termómetro rectal lubricado a 3-4 cm de profundidad y asegúrelo a la cola con cinta adhesiva. Mantenga la temperatura rectal del lechón a 38-39 °C ajustando la almohadilla térmica y la temperatura ambiente (25 °C). Si usa una fuente de calor eléctrica, asegúrese de colocar una manta adicional entre el lechón y la estera calefactora para evitar quemaduras.
      NOTA: Utilice una fuente de calentamiento adicional, como un sistema de calentamiento de aire forzado (como una manta superpuesta sobre el lechón) si la homeostasis de la temperatura no se logra adecuadamente.
    4. Para la presión arterial, realice un monitoreo no invasivo con un manguito del tamaño adecuado hasta después de la cirugía, luego determine la presión arterial invasiva, incluida la presión arterial media (PAM) y la presión venosa central (PVC), y documente el IRC.
      NOTA: Asegúrese de que las cúpulas de los transductores arteriales y venosos estén colocadas a cero a nivel del corazón para obtener lecturas precisas.
    5. Realice muestras de sangre en puntos de tiempo preespecificados a través de un catéter arterial o venoso central. Realice un análisis de gases en sangre de 0,1 ml de sangre arterial heparinizada utilizando un analizador de sangre portátil (un dispositivo que puede evaluar el pH mínimo, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, lactato, creatinina, Na, K, Cl, que se anotará en CRF) para administrar la ventilación y el control metabólico durante todo el experimento.
    6. Realizar muestreos biológicos para futuros experimentos y análisis: recolectar sangre entera, plasma y orina en curso en puntos de tiempo relevantes durante el protocolo experimental, según los objetivos del estudio. También recolectar muestras de punto final, incluido el líquido de lavado broncoalveolar (BALF), tejido pulmonar y otros tejidos16,17, según sea relevante para los objetivos del estudio.
      1. Limite la anemia iatrogénica y la hipovolemia:
        1. Extraiga lentamente (equivalente a tres veces el volumen del espacio muerto) sangre en una jeringa, déjela a un lado y extraiga suficiente volumen para futuros análisis experimentales (0,4-1,5 ml)25 , como marcadores de estrés inflamatorio y oxidativo. Adapte los volúmenes de muestra al peso corporal, el nivel de hemoglobina y la estabilidad del lechón.
          NOTA: La sangre del espacio muerto se devuelve al animal y la línea se enjuaga con solución salina con al menos el volumen equivalente que se tomó para la toma de muestras de sangre (gases en sangre ± sangre para futuros experimentos) para limpiar la línea de sangre, limitando la posible oclusión debido a un coágulo de sangre.
    7. Registre todos los signos vitales y parámetros ventilatorios en CRF a intervalos regulares cada 15-30 min, con mayor frecuencia durante la inducción de la anestesia y la cirugía, o si el lechón está inestable.
    8. Anote los cambios en los medicamentos desde el comienzo de la anestesia a lo largo del experimento anotando la hora de inicio y finalización, así como las modificaciones de la dosis.
    9. Evalúe la profundidad de la anestesia evaluando el pellizco del dedo del pie / banda coronaria para detectar el reflejo de abstinencia inicialmente con una frecuencia regular. Una vez que se logre la relajación muscular completa, controle la frecuencia cardíaca y la presión arterial para una evaluación continua de la profundidad de la anestesia.
    10. Apunte a lo siguiente, si nada más se indica, a lo largo del experimento: FC: 120-180 lpm, PAM: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH2O, Temperatura corporal: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol / L, PaCO2: 35-45 mmHg, ajuste el RR (máx. 60 respiraciones / min), Volumen corriente (VT): 7 ml / kg, ajuste el PIP.

4. Procedimiento quirúrgico (Tiempo: ~ 30-40 min)

  1. Mantenga la ventilación durante la cirugía.
    1. Mantenga un RR de 30 respiraciones/min, diríjase a la VT espiratoria a 10 ml/kg ajustada por PIP, PEEP constante de 6 cmH2O, Tinsp de 0,4 s y FiO2 a 1,0.
  2. Establezca un campo estéril realizando un exfoliante aséptico preferido de la piel en el cuello para la traqueotomía y en la ingle para el acceso a los vasos femorales utilizando técnicas de depuración estándar.
    1. Realice la incisión en el cuello.
      1. Realice una incisión en la piel en el cuello con un bisturí entre el cartílago cricoides y la muesca esternal. Use disección roma para aislar la tráquea.
      2. Enhebre dos lazos umbilicales de 12 pulgadas debajo de la tráquea.
      3. Hacer una incisión de 5 mm entre los anillos traqueales y la porción más anterior de la tráquea, justo debajo del cartílago cricoides. Inserte el tubo endotraqueal (TET). Haga el primer nudo en la parte superior de la tráquea más cercana a la incisión.
      4. Infle el manguito ETT, retraiga suavemente el ETT hasta que el brazalete se detenga por la corbata. Apriete la primera atadura y asegure una segunda corbata al ETT. Este método asegura que la punta esté por encima de la carina, confirmada por la auscultación de sonidos respiratorios simétricos y bilaterales.
        NOTA: El bronquio del lóbulo craneal derecho surge proximal a la bifurcación de la tráquea. Tenga cuidado con la obstrucción de este bronquio si el TET se coloca demasiado profundo. Si se producen problemas con la ventilación o cambios repentinos, considere ajustar el tubo. El tronco vagosimpático y los nervios laríngeos se encuentran en esta área del cuello. Se debe tener cuidado para evitar la estimulación o lesión de estos nervios.
    2. Realice la incisión en la ingle.
      1. Palpar la arteria femoral, realizar una incisión superficial en la piel en la ingle derecha con un bisturí (aproximadamente 8-10 cm).
      2. Use una disección roma para aislar la arteria y la vena femoral.
      3. Enhebre dos suturas (3.0 seda) debajo de cada una de las arterias y venas femorales para aislarlas26. Prepare los catéteres que se insertarán.
        1. Para el cateterismo de la vena femoral derecha, levante ambas suturas para ocluir cualquier flujo sanguíneo. Ate la vena femoral distal al sitio de inserción propuesto.
          1. Inserte el catéter completamente, tirando ligeramente hacia atrás del estilete y atando la atadura distal para asegurar el catéter en su lugar. Retire el estilete y fije el juego de extensión de 6 pulgadas con una llave de paso de tres vías que haya sido cebada con solución salina.
          2. Antes de asegurar el catéter, retire una pequeña cantidad de sangre para asegurar la permeabilidad. Asegure el catéter en el vaso con la sutura proximal, evitando que el catéter se salga.
          3. Conecte el puerto secundario para la administración de líquido de mantenimiento y la infusión de medicamentos. Conecte el puerto primario para la presión venosa central.
        2. Para el cateterismo arterial femoral derecho, use los mismos pasos en la arteria femoral que para la vena descritos en los pasos 4.2.2.3.1.1 a 4.2.2.3.1.3.
          1. Coloque el primer puerto de la llave de paso de 3 vías para un control invasivo de la presión arterial y pierda las incisiones en la ingle y el cuello con grapas quirúrgicas.
    3. Realice la inserción del catéter vesical suprapúbico para el acceso urinario.
      1. La vejiga se encuentra superficialmente en la parte inferior del abdomen, ligeramente a la izquierda de la línea sagital media. Limpiar el abdomen mediante una técnica aséptica.
      2. Insertar un angiocatéter estéril de 18 G (2") paralelo a la pared abdominal, craneal al par de pezones más bajos (5-6 cm por debajo del ombligo), apuntando hacia el ombligo mientras que con una mano, se aplica una ligera presión a cada lado de la vejiga para estabilizar y hacer un poco más grande (el protocolo opcional para la aspiración suprapúbica se puede encontrar en otro lugar27).
      3. Una vez que se confirme el flujo de orina, pegue el catéter con cinta adhesiva al abdomen para asegurar su posición. Conecte un juego de extensión de gran calibre al catéter. Coloque el extremo distal en un tubo de 50 ml colocado debajo del animal.

5. Estabilización y reclutamiento pulmonar postoperatorio estandarizado (Tiempo: ~30-60 min)

NOTA: La estabilización comienza cuando se completan todos los procedimientos quirúrgicos. Es esencial una profundidad suficiente de analgesia/anestesia antes de la relajación muscular, ya que garantiza que los signos vitales, como la PAM y la FC, estén dentro del rango normal y la ausencia de reflejos de abstinencia. MAP y HR se monitorearán continuamente durante todo el protocolo para garantizar la profundidad anestésica adecuada.

  1. Administrar rocuronio (0,3 mg/kg) bolo IV (a través del acceso D5W de la vena del oído) e iniciar una infusión continua de rocuronio (5,5 mg/kg/h) para la relajación muscular antes de la maniobra de reclutamiento pulmonar. Esta infusión continuará durante la duración del experimento para estandarizar el procedimiento de lavado y evitar la asincronía con el ventilador.
  2. Realice una maniobra de reclutamiento pulmonar estandarizada.
    1. Aumento gradual de PEEP: comience en PEEP 6 cmH2O, aumentando 1 cmH2O cada minuto hasta lograr PEEP 10 cmH2O. Ajuste PIP para mantener VT 10 ml / kg.
    2. Permanezca en PEEP 10 cmH2O durante 2 min antes de volver a una PEEP 6 cmH2O de manera inversa (como en el paso 5.2.1) mientras mantiene VT 10 mL/kg.
    3. Cuando esté estable a VT 10 mL/kg en una PEEP 6 cmH2O, registre los ajustes respiratorios, los parámetros fisiológicos y tome una gasometría arterial (punto de tiempo VT 10 mL/kg en CRF).
      1. Asegúrese de que la PaO2 sea de >400 mmHg (respuesta esperada a la hiperoxia en un animal con pulmones sanos). FiO2 1.0 se utiliza durante las fases iniciales del experimento para garantizar una respuesta adecuada a la hiperoxia como criterio de inclusión.
      2. Si no se alcanza:
        1. Verifique la posición del tubo endotraqueal, la configuración del ventilador, el suministro de oxígeno y la técnica adecuada de muestreo de sangre. Repita la maniobra de reclutamiento pulmonar una vez para asegurar un reclutamiento adecuado.
        2. Si aún no mejora, excluya al animal y eutanasiarlo inmediatamente (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) debido al posible problema intrínseco del pulmón (pulmón enfermo por exposición previa no experimental, es decir, en la granja).
      3. Ajuste el RR para mantener PaCO2 entre 35-45 mmHg.
      4. Baje el PIP hasta alcanzar VT 7 mL/kg, manteniendo FiO2 1.0 y PEEP 6 cmH2O.
      5. Después de la estabilización, registre las lecturas de referencia de puntos de tiempo para VT 7 ml / kg en la hoja de CRF con parámetros fisiológicos y muestras, incluida la gasometría arterial y venosa. La estabilización incluye signos vitales, como en los pasos 3.2.10, y valores de gases en sangre de: PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7.35-7.45, BG: 4-5 mmol / L.

6. Ventilación para animales de control

  1. Utilice ventilación controlada por volumen con un volumen corriente de 7 ml/kg, PEEP de 6 cmH2O y FiO2 de 1,0. No induzca lesiones pulmonares en animales de control (es decir, no realice el agotamiento de surfactante o la instilación de endotoxinas).
  2. Continúe la ventilación durante aproximadamente 90 minutos para que coincida con la duración promedio requerida para inducir una lesión pulmonar en animales de experimentación (consulte el paso 7 y la Figura 1). Después de este período, continúe directamente con el paso 10.

7. Inducción de lesión pulmonar aguda (modelo multi-hit)

  1. Realizar el agotamiento del surfactante (Tiempo: 1-2 h)
    1. Antes de comenzar el lavado pulmonar, encienda el aparato de succión y asegúrese de que esté listo para usar. Coloque el cubo de recogida de lavado en su posición. Coloque almohadillas absorbentes debajo de la cabeza del animal y debajo de la mesa quirúrgica para capturar todo el líquido filtrado y recuperado durante el lavado.
      1. Pese las almohadillas antes y después del lavado. Ajuste el ventilador a PEEP 5 cmH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min y FiO2 1.0. Mantenga estos ajustes ventilatorios controlados por presión durante todo el procedimiento de lavado. Espere que la TV disminuya aproximadamente entre un 35% y un 45% durante el lavado completo.
    2. Desconecte el circuito ventilatorio del TET y conecte el aparato de embudo de lavado (consulte el Archivo complementario 1).
    3. Instilar 30 ml/kg de solución salina isotónica tibia (NS) en los pulmones vertiendo suavemente NS en el embudo que se encuentra aproximadamente a 30 cm por encima del lechón.
    4. Masajee la caja torácica presionando bilateralmente en la cara lateral para proporcionar un "apretón" mecánico. Ayudar a mover la solución salina hacia los pulmones y hacerla circular dentro del aparato de lavado. Deje 2-3 s entre masajes.
      NOTA: Evite masajear demasiado rápido o demasiado lento para evitar la eliminación inadecuada del surfactante o el deterioro del retorno venoso. No exceda los 30 s por ronda de lavado.
      1. Elimine el líquido de lavado bajando el embudo debajo del lechón. Desconecte ligeramente el embudo del ETT para permitir que el líquido drene hacia el cubo de recolección en el piso.
      2. Realice una succión activa durante no más de 10 s. Inserte el catéter de succión en el TET mientras continúa el masaje de la caja torácica para facilitar el drenaje de líquidos. Controlar la PAM y la FC, y volver a conectar la ventilación temprano si alguno de los parámetros disminuye significativamente.
      3. Vuelva a conectar el circuito ventilatorio. Si queda exceso de líquido en el ETT, realice una segunda succión.
    5. Deje que el lechón se recupere durante al menos 3 minutos entre rondas de lavado para reducir el estrés y el riesgo de intolerancia.
    6. Comienza la siguiente ronda de lavado una vez que SpO2 vuelva al 100%. Si la SpO2 no vuelve al 100%, compruebe la PaO2a través de la gasometría una vez que la SpO2 se haya estabilizado
      1. Si PaO2 >100 mmHg, repita los lavados pulmonares (pasos 7.1.2-7.1.6).
      2. Si PaO2 <100 mmHg, espere 15 minutos mientras mantiene los ajustes de ventilación de lavado, luego repita el análisis de gases en sangre.
      3. Si PaO2 >100 mmHg, continúe con el lavado y continúe con el paso 7.1.6 para reevaluar la extensión de la lesión.
    7. Confirmar que se logra una lesión por agotamiento de surfactante cuando la PaO2 permanece <100 mmHg durante 15 min. Detenga el lavado y continúe con el siguiente paso.
  2. Instilar endotoxina intratraqueal (Tiempo: 15 min)
    1. Prepare lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (1,5 mg/kg) diluyendo en NS hasta un volumen total de 2 ml en una jeringa de 3 ml.
      NOTA: Seleccione la cepa y la dosis según corresponda, reconociendo la posible variación de los efectos dependiente de la cepa.
    2. Espere 15 minutos después del lavado pulmonar final, luego instile LPS por vía intratraqueal (IT) con el lechón en posición supina.
    3. Mejorar la distribución homogénea de LPS en el pulmón atelectático siguiendo los siguientes pasos:
      1. Reemplace el extremo ETT estándar con un adaptador de puerto en Y para permitir la ventilación simultánea y la administración de LPS a través de un catéter a través del puerto lateral con válvula.
      2. Aplicar PEEP de 10 cmH2O durante 1 min. Ajuste PIP para mantener la VT en 7 ml / kg y establezca el RR en 40 respiraciones / min.
      3. Inserte un catéter a través del puerto lateral en el TET a una profundidad premedida para que la punta se extienda 1-2 mm más allá del TET.
      4. Inyecte el LPS a través del catéter. Enjuague el catéter con 1 ml de NS seguido de un bolo de aire de 9 ml para garantizar una administración completa.
      5. Retire el catéter y cierre el puerto lateral.
      6. Continúe la ventilación con PEEP 10 cmH2O (ajuste PIP para mantener VT 7 ml / kg) durante 3 min después de la administración de LPS.
      7. Desconecte el circuito del ventilador del TET durante 30 s para revertir cualquier reclutamiento involuntario de tejido pulmonar.
      8. Durante la desconexión, ajuste la configuración del ventilador a FiO2 0,5, PEEP 6 cmH2O, PIP para mantener VT 7 ml / kg y aumente el RR a 40-60 respiraciones / min para lograr PaCO2 de 35-45 mmHg.
      9. Una vez que la VT se estabilice en 7 ml / kg, registre las mediciones fisiológicas de 0 horas de Timepoint y complete la hoja CRF. Ajuste el RR en función de PaCO2 del análisis de gases en sangre.

8. Ventilación durante el período de observación (Tiempo: ~6 h)

  1. Cambie a ventilación controlada por volumen con FiO2 a 0,5 y PEEP a 6 cmH2O. Ajuste la PIP según sea necesario para mantener la VT a 7 ml/kg (no establezca una PIP máxima). Ajuste el RR, hasta un máximo de 60 respiraciones/min, para mantener el PaCO2 normal.
  2. Use mediciones de gases en sangre por hora para guiar los ajustes de RR durante el resto del experimento. Ajuste continuamente el PIP para mantener la VT en 7 ml/kg.
  3. Aplicar estos parámetros de ventilación de manera uniforme tanto a los animales de control como a los de impacto múltiple durante todo el período de observación de 6 h (ver Figura 1).

9. Procedimiento de tratamiento - opcional (Tiempo: ~ 10-20 min)

  1. Para posibles estudios de intervención, administre el agente terapéutico a través de una vía clínicamente relevante, como intratraqueal (IT), intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular o intranasal. Seleccione el momento del tratamiento según el diseño experimental. Si no se administra ningún tratamiento, vaya al paso 10. A continuación se proporciona un ejemplo de administración de TI:
    1. Coloque el lechón en decúbito lateral derecho.
    2. Mantenga la PEEP a 6 cmH2O. Ajuste la PIP para lograr una VT de 7 ml/kg.
    3. Inserte el catéter en el puerto lateral con válvula a la longitud predeterminada (como se describe en el paso 7.2.3.3). Instilar la mitad de la dosis o volumen previsto de la intervención. Siga con un bolo de 1 ml de NS y 9 ml de aire. Limite el volumen total a 2,5 ml/kg para minimizar el riesgo de oclusión de la ventilación después de la inyección en bolo.
    4. Selle el puerto lateral con válvula con la tapa para evitar fugas de ventilación.
    5. Vuelva a colocar el lechón en decúbito lateral izquierdo y repita los pasos 9.1.3-9.1.4.
    6. Regrese el lechón a la posición supina. Ajuste PIP para mantener la VT a 7 ml/kg.
    7. Continúe con la ventilación como se describe en el paso 8.

10. Eutanasia y finalización del experimento

  1. Realice los registros fisiológicos finales y la recolección de muestras después de 6 h de ventilación durante el período de observación (paso 8).
  2. Eutanasia al animal con 120 mg/kg de Pentobarbital Sódico IV (240 mg/mL) administrados en bolo (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
  3. Asegurar la muerte de un animal con ausencia de signos vitales (latidos del corazón, presión arterial y respiración). Auscultar la ausencia de frecuencia cardíaca y sonidos respiratorios con un estetoscopio para confirmar la muerte. La muerte se confirma además con una colección de tejido terminal del corazón y el pulmón.
  4. Recolectar las muestras de tejido y fluidos corporales para su posterior análisis bioquímico, molecular y/o histológico14,17 para futuros experimentos.
  5. Guarde todos los datos en el equipo de monitoreo y el ventilador, asegúrese de que las copias de seguridad se carguen en la unidad local y en la unidad compartida, y apague todos los equipos.
  6. Deseche todos los objetos punzantes / biopeligrosos según las instrucciones de las políticas locales.
  7. Limpie todas las superficies con el producto antiséptico preferido.
  8. Lave todos los instrumentos y déjelos secar durante la noche.

Resultados

Los criterios de valoración de este modelo están alineados con los criterios de la American Thoracic Society para ALI (mínimo 3 de 4), que incluyen alteraciones fisiológicas, histológicas, inflamatorias y de barrera alveolo-capilar16,17. Se pueden incluir otros criterios de valoración en función del estudio y a discreción de cada grupo de investigación que desee implementar este modelo. La lesión pulmonar moderada se define como una relación entre la fracción parcial de oxígeno en la sangre arterial y la fracción de oxígeno inspirado (PaO2/FiO2, también conocida como relación P/F) < 200 mmHg y la grave < 100 mmHg17. El índice de oxígeno (OI) se calcula utilizando la siguiente fórmula: OI = (presión media en la vía aérea [mAWP) * %O2)/PaO2, y los valores entre 8-16 se clasifican como lesión moderada28. En comparación con los animales de control, los animales de múltiples golpes mostraron lesiones pulmonares graves a moderadas debido a su índice de oxigenación alterado, relación P / F y disminución de la distensibilidad del sistema respiratorio (Figura 2). Se presentaron signos claros de lesión histológica utilizando una puntuación de lesión pulmonar histológica de modalidad 516,17 (Figura 3), con afluencia de neutrófilos en el espacio alveolar e intersticial, restos proteicos que llenan los espacios aéreos y engrosamiento del tabique alveolar. La afluencia de neutrófilos en el BALF proporciona una indicación de procesos inflamatorios junto con un aumento de la citocina IL-6 en el tejido pulmonar (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Diagrama de flujo de la lesión pulmonar aguda en lechones neonatales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Se observa un ALI de moderado a grave siguiendo la lesión multi-hit presentada en este protocolo. (A,B) El aumento del índice de oxigenación (entre 8-12) y la baja relación PaO2/FiO2 (P/F) se obtienen en el modelo multi-hit presentado en este documento (línea roja) en comparación con el control (línea azul), en línea con la lesión pulmonar moderada a grave. (C) La función pulmonar se ve afectada en animales con múltiples impactos, lo que aquí se muestra como una disminución del >50 % en la distensibilidad del sistema respiratorio. Número de animales (N): control (N = 5) y multigolpe (cepa LPS O55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Todos los valores utilizados significan ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: El modelo ALI de múltiples golpes muestra una lesión histológica heterogénea. (A, B) Se observa evidencia macroscópica de lesión pulmonar en parches que afecta preferentemente la cara central posterior del pulmón de múltiples golpes. (C, C) Imágenes representativas (100x) de secciones pulmonares teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) que muestran la afluencia neutrofílica en el espacio alveolar e intersticial, con engrosamiento alveolar y septal en el pulmón multigolpe. (E, F) Las imágenes representativas (400x) de secciones pulmonares teñidas con H&E resaltan el deterioro de la integridad estructural, la infiltración neutrofílica y la deposición de desechos en el espacio alveolar del pulmón multigolpe. Los cuadrados azules representan el área ampliada en (E,F). La barra de escala negra representa 100 mm (C, D) y 50 mm (E, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: El modelo de múltiples golpes muestra una respuesta inflamatoria después de la ALI. (A) Afluencia de neutrófilos con neutrófilos que alcanzan más del 75% de la fracción de células totales en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) 6 h después de la lesión pulmonar inducida (multi-golpe) en comparación con los animales de control. (B) La citocina proinflamatoria IL-6 está elevada en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y (C) en el tejido pulmonar 6 h después de la LPA inducida. El número de animales (N) varía debido al material disponible en el momento del análisis. Para BALF (B), se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, mientras que para el tejido pulmonar (C), se realizó la tecnología de perlas láser multiplex. Todos los valores se muestran como media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Formulario de seguimiento de casos para el modelo de lesión pulmonar aguda de lechones neonatales. Haga clic aquí para descargar este fle.

Discusión

El modelo ALI de lechones neonatales consiste en un modelo de múltiples golpes que incluye lavado pulmonar para la eliminación de surfactante (que imita el síndrome de dificultad respiratoria que conduce a un atelectrotrauma), alta exposición al oxígeno (que conduce a especies reactivas de oxígeno), ventilación mecánica (baro/volu-trauma), así como la administración IT de LPS como estímulo inflamatorio, reflejando los diversos componentes que se cree que están involucrados en la patogénesis de la DBP en bebés prematuros2. Durante el proceso de agotamiento del surfactante, hay un aumento intencional de la presión y el oxígeno para contribuir a la lesión. La exposición a la hiperoxia con FiO2 1.0 es de aproximadamente 3 h, y se agrega alta presión durante aproximadamente 90 min durante la fase de lesión pulmonar inducida (lavado por agotamiento de surfactante e instalación de endotoxinas). Los niveles altos de oxígeno inspirado durante la reanimación (FiO2 0,9 alto vs. FiO2 0,3 bajo) en los recién nacidos extremadamente prematuros dieron lugar a un mayor estrés oxidativo e inflamación, con una exposición a la hiperoxia inferior a 1 h29. Tras el agotamiento del surfactante en el modelo de lechón, los pulmones colapsarán / resultarán en atelectasia, y la capacidad de mantener la permeabilidad alveolar se reducirá para una ventilación y oxigenación adecuadas. Como tal, aunque los ajustes se reduzcan en el período de observación, la eliminación del surfactante dará como resultado la necesidad de una presión más alta para lograr un volumen corriente de 7 ml / kg. Los pulmones podrán producir surfactante a medida que pase el tiempo, y el alcance del proceso perjudicial en curso podría disminuir con el tiempo. Sin embargo, este nuevo modelo de lechón neonatal de ALI muestra poca recuperación (Figura 2) de la función pulmonar (distensibilidad) y la oxigenación (relación PF) durante el período de observación durante 6 h después de la lesión pulmonar inducida. Este modelo se asemeja mucho a las circunstancias posnatales iniciales más comunes que enfrentan los bebés extremadamente prematuros, lo que lo hace muy relevante para los esfuerzos traslacionales. El modelo crea una lesión pulmonar aguda de moderada (100-200 mmHg) a grave (<100 mmHg) definida por la relación P/F28. El efecto LPS con la inflamación alcanza su punto máximo entre una y 2 h después de la lesión30. Este modelo se puede utilizar como un andamio que puede ser manipulado por otros grupos cambiando la duración de la observación o el tratamiento utilizado para adaptarse a su programa de investigación.

Pasos críticos en el protocolo

A pesar de la priorización hacia la accesibilidad, este modelo de animal grande sigue siendo complejo, lo que requiere un equipo altamente calificado para trabajar en colaboración para completar este experimento. Hay pasos críticos en el protocolo que requieren precaución adicional. Estas consideraciones son fundamentales para garantizar el éxito de este complejo marco experimental.

Transporte del animal

Se espera que el desapego temprano de la madre sea un momento extremadamente estresante para el animal, lo que potencialmente conduce a la incapacidad de mantener la estabilidad cardiovascular y la posible muerte durante el transporte. Sin embargo, el protocolo de transporte (ver paso 3) presentado aquí permitió animales muy tranquilos (algunos incluso se quedaron dormidos), lo que permitió una experimentación completa. Si bien es difícil hacer recomendaciones claras sobre la duración máxima del transporte, los lechones pudieron soportar cómodamente un transporte de aproximadamente 60 minutos en nuestra experiencia.

Optimización de la ventilación

El ventilador debe configurarse para compensar el cumplimiento del circuito para garantizar que se administre todo el volumen corriente a los pulmones. Esto es particularmente importante durante el agotamiento del surfactante, ya que el lechón puede volverse hemodinámicamente inestable si se pierde el volumen corriente en el circuito. Los investigadores deben confirmar que el ventilador disponible permitirá la administración adecuada del volumen corriente para un recién nacido. Los ventiladores para adultos a menudo no podrán lograr volúmenes corrientes neonatales apropiados. La PIP se utiliza para mantener los valores de volumen corriente espiratorio (7 ml/kg utilizados en este protocolo como se describió anteriormente por otros 14,19,20,21,31,32, excepto durante el lavado pulmonar - ver la siguiente sección). El uso estandarizado del adaptador de tubo endotraqueal con un puerto lateral con válvula durante la administración de LPS, o para cualquier tratamiento de TI, permite mantener la presión de la vía aérea evitando la desconexión del circuito ventilatorio.

Estrategia estandarizada de reclutamiento pulmonar después de la cirugía

La atelectasia puede desarrollarse en los pulmones de los lechones durante las etapas preparatoria y quirúrgica. Se ha administrado una maniobra de "reclutamiento pulmonar" después de la relajación muscular33 para garantizar una aireación pulmonar adecuada. Después de la maniobra de reclutamiento, se espera que la presión parcial de oxígeno en sangre arterial sea superior a 400 mmHg, dada la respuesta hiperóxica normal en pulmones abiertos sanos. Si no se alcanza esto, el investigador debe considerar si los pulmones no se reclutaron adecuadamente debido a condiciones experimentales no optimizadas o si el lechón puede tener una condición preexistente (por ejemplo, si el lechón se obtiene de una granja donde pueden ocurrir exposiciones desconocidas). El protocolo permite probar la explicación anterior con el reinicio de la maniobra de reclutamiento una vez para ver si se puede lograr este objetivo. Si no se alcanzan los 400 mmHg de PaO2 por segunda vez, considere la exclusión del animal, como una condición preexistente que podría existir, lo que influiría inapropiadamente en los resultados experimentales.

La suficiente homeostasis metabólica y de líquidos es de suma importancia

Esto limitará los importantes efectos de confusión relacionados con la mala hidratación y el control metabólico. Estos lechones recién nacidos a término, generalmente nacidos en una camada grande, no tendrán una oportunidad similar para amamantar. Como tales, pueden estar expuestos a algún nivel de deshidratación posnatal antes de ser utilizados en el experimento. Proporcionar una ingesta total de líquidos de 5-8 mL/kg/h es suficiente para mantener un buen volumen intravascular14,34. Asegurar el control metabólico ocurre con el mantenimiento de un nivel de glucosa en sangre entre 4-5 mmol / L (rango fisiológico normal para lechones recién nacidos35,36). El lactato alto en sangre es otra referencia utilizada para reflejar un suministro deficiente de oxígeno y posiblemente refleje un estado bajo de líquido intravascular antes de la hipoxia. Un régimen de líquidos suficiente y un animal bien hidratado soportan lavados de agotamiento de surfactante con estabilidad cardiovascular y no generan acidosis severa. Los valores de referencia de la hemoglobina y otros parámetros bioquímicos varían según la edad y la especie37,38. La hemoglobina más baja puede afectar la oxigenación, lo que requiere un muestreo de sangre optimizado y conservador39,40. Cada extracción de sangre se compensa con un volumen igual de NS. Se utilizaron electrolitos en sangre, urea y niveles de creatinina para seguir un régimen de líquidos suficiente.

Permitir un tiempo de recuperación suficiente durante el procedimiento de lavado pulmonar

Durante el lavado pulmonar, se requiere una ventana importante de recuperación de al menos 3-5 min entre cada lavado para permitir un retorno venoso adecuado para evitar una congestión hepática peligrosa41, hemorragia hepática e insuficiencia cardíaca derecha. Este fenómeno se observó en algunos animales dentro de la cohorte experimental. El manejo adecuado y proactivo de los fluidos es imperativo para el mantenimiento de la estabilidad clínica. Al recrear un pequeño entorno de cuidados intensivos para este modelo de lechón, es esencial contar con un médico, un neonatólogo o un técnico veterinario superior que pueda facilitar la traducción de conocimientos entre los miembros del equipo para reconocer situaciones importantes y sus planes de contingencia asociados.

Solución de problemas recomendada

El lechón estará bajo anestesia general y analgesia durante todo el tiempo quirúrgico y experimental. Una persona se dedica a monitorear al lechón durante todo el experimento. Cada animal es diferente en su sensibilidad y respuesta a los anestésicos. Es fundamental monitorear la condición del animal inmediatamente después de la inducción de la anestesia con signos vitales y gases en sangre cada hora. Proporcionará información sobre el nivel de anestesia y la estabilidad metabólica, además de la evaluación física según sea necesario. Existe una variabilidad en el número de lavados pulmonares (de 6 a 20) y, por lo tanto, en el tiempo (de 28 a 115 min), necesarios para alcanzar el agotamiento del surfactante.

Posibles problemas y soluciones durante la inducción, estabilización y cirugía de la anestesia: (1) Si se desarrolla apnea, se debe apagar el gas anestésico y se debe apoyar la respiración con ventilación con bolsa y máscara hasta que regrese la respiración espontánea. (2) Si hay signos de hipovolemia a través de una FC alta, una PAM baja o una CVP baja, se debe administrar un bolo de líquido de 10 ml / kg de NS y se debe considerar una mayor tasa de líquido de mantenimiento. (3) Cuando la hipotensión con MAP decreciente a 30-40 mmHg, que no se resuelve con el bolo de líquido, las bombas de anestesia deben disminuirse / detenerse, y los signos de perfusión e hipotensión se reevalúan después de 10-15 min. Análisis de gases en sangre para determinar los niveles de hemoglobina para evaluar posibles hemorragias internas. (4) Si los síntomas respiratorios indican neumotórax (desaturación aguda o bradicardia >20%), el lechón es sacrificado inmediatamente.

Limitaciones

El modelo aquí representa un ALI neonatal a corto plazo (6 h) en un modelo animal grande. La cronicidad de la lesión que conduce al TLP es un factor importante a considerar. Es posible que este modelo no capture completamente este aspecto de la patogénesis, y los datos que informan el progreso de la lesión pulmonar más allá de las 6 h siguen sin determinarse. Sin embargo, la consistencia de este modelo se erige como una base sólida sobre la que construir (extendiendo la longitud / modificando el protocolo), lo que permite versatilidad a los grupos de investigación que lo implementarán. A pesar del énfasis puesto en la accesibilidad y viabilidad de este gran modelo animal durante su concepción, se justifican conjuntos de habilidades específicas para la ejecución sin problemas del experimento. La experiencia clínica con una base sólida en fisiología y el conocimiento para manejar cambios / deterioros rápidos a través de medicamentos / infusión / etc. es necesaria para la implementación y finalización exitosa en las primeras fases. Este conjunto de habilidades se puede transferir a los miembros del equipo para el mantenimiento continuo del modelo a lo largo del tiempo. Además, un equipo compuesto por un técnico veterinario, técnicos de laboratorio y estudiantes de posgrado con los que se ha establecido una sólida comunicación y colaboración puede garantizar una cobertura adecuada de todos los componentes de cada experimento. Se espera que se requieran al menos tres miembros del equipo para llevar a cabo el experimento de principio a fin cuando se optimice el flujo de trabajo.

Importancia y su posible aplicación

La traducción clínica se basa en sólidos estudios fundamentales a nivel preclínico. Sin embargo, muchos ensayos clínicos fracasan debido al desajuste entre el modelo preclínico y la fisiología humana, lo que destaca la importancia de los modelos animales grandes estrechamente relacionados para fortalecer el potencial de traducción. La generación de un nuevo modelo de lesión pulmonar de lechones neonatales es fundamental para comprender mejor los eventos patogénicos tempranos, fomentando un entorno propicio para el desarrollo de DBP en el pulmón prematuro humano. El modelo presentado aquí recrea aspectos importantes de un entorno de cuidados intensivos (hiperoxia, ventilación de alta presión y falta de surfactante) para bebés prematuros durante los primeros días de vida, que se modela de cerca. Este nuevo y versátil modelo de lechones neonatales de múltiples golpes ofrecerá una visión inestimable de los procesos patógenos tempranos de la DBP, un conocimiento avanzado sobre los candidatos terapéuticos, así como su optimización de la administración terapéutica para una traducción clínica eficaz. Actuará como un excelente vector para las colaboraciones, fomentando un marco de prueba de hipótesis para estudios de prueba de concepto que varían desde la seguridad hasta la eficacia, y la generación de conocimiento. Al servir como base para ensayos futuros, este modelo avanzará significativamente los esfuerzos de traducción clínica para la lesión pulmonar aguda observada en los recién nacidos prematuros.

Divulgaciones

Todos los demás autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Martin Post, Hospital for SickKids, Toronto, quien generosamente nos prestó un ventilador neonatal que se ha utilizado durante este proyecto. También agradecemos a Dan DeVette y su equipo del servicio veterinario y de cuidado de animales del Instituto del Corazón de la Universidad de Ottawa por toda la ayuda durante el desarrollo de este modelo. Este trabajo ha sido apoyado por el fondo de innovación CHAMO de CHEO, la Red de Células Madre, la asociación de la Princesa Lovisa, la Fundación David y Astrid Hagelén y la Fundación Sueca Heart Lung.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bisturí #10Incisión cutánea
Jeringuilla de 1 mlBectonDicksonBD309659Slip Tip 
Jeringuillas de 10 mlBectonDicksonBD302995Enjuague jeringuillas para líneas arteriales y venosas
18 g de angiocatheter InsyteCanulación de vejiga
Jeringuillas de 20 mlBectonDicksonBD302830Bolus fluido si es necesario
Agujas hipodérmicas de 22 GBectonDicksonJeringuilla de recambio
24 G angiocathetersInsyte160465Acceso intravenoso de oído y arteria y vena femoral
25 g de agujas hipodérmicasBectonDicksoninyección intramuscular (IM) de bupenorfina
Jeringuillas de 3 mlBectonDicksonEliminación de espacios muertos en la línea de inyección y monitorización de medicamentos
Corbatas de seda 3-0EthiconA304HUtilizado para asegurar catéteres arteriales y venosos
Grifos de registro de 4 víasDiscofix, BraunD500456020acoplado a fluidos y líneas de monitorización para lavado y muestreo
Juego de extensiones de 6"Tecnologías de Infusión SAIExt-6acoplado a vías intravenosas/arteriales y nbsp;
Conjunto de extensiones de 60"BBV6223Líneas de infusión de fármacos
Adaptador de acceso a la vía aérea AirLife Neo-Verso Y para tubos endotraquealesVyaireCSC300Utilizado para administrar material intratraquealmente
Bupenorfina, 0,3 mg/mLCDMV128140Bolito intramuscular como analgésico
Dextrosa, 5%BaxterJB0063Mantenimiento de la glucosa en sangre
Cortinas desechables3M3M1050Drapeados estériles de campo
Electrodos ECG3M220790electrodos de un solo uso para ECG
Catéter de administración de tubo endotraqueal (ETT)
Tubo endotraqueal 3,5 Teleflex5-10107Usado para traqueostomía
Epinefrina, 1 mg/mLHospira07541L01Diluido con solución fisiológica normal estéril a 0,1 mg/mL para reanimación si es necesario
Analizador de gases sanguíneos Epoc  Siemens10736398Sistema de análisis sanguíneo epoc con NXS host
Tarjetas de muestra EpocSiemensBD309659Cartuchos de gases sanguíneos
Formalina, 10% tampónFisher ScientificSF100-4Fijación pulmonar
Almohadilla térmicaKent ScientificTPZ-814EAmanta circulante de agua
Bombas de infusión intravenosa (IV) x 3Sigma AldrichZ401358Infusión de ketamina/propofol y rocuronio
Ketamina, 10 mg/mLVetoquinol112170Infusión continua (diluida con solución fisiológica normal estéril) en bomba de jeringuilla para el mantenimiento de la anestesia y nbsp;
Ketamina, 100 mg/mLVetoquinol112170Se usa como bolo para inducción de anestesia general y bomba de jeringuilla para el mantenimiento de la anestesia y nbsp;
Anillares lactadosBaxterJB2323Mantenimiento del volumen sanguíneo
Equipamiento de lavado: embudo, conector de tres vías, conector ETT, tubería de 4 piesN/DN/DTubería casera para lavar
Lipopolisacárido, LPS (O55:B5), 100 mgSigma-AldrichL2880-100mgSegundo golpe, lesión pulmonar
Humidificador respiratorio MR850Fisher y PaykelMR850JXX*
Pentobarbital sódico (eutanilo), 240 mg/mLVetoquinol381Bolo intravenoso para la eutanasia humanitaria
Transductor de presiónSuministros Veterinarios McCarthyV6402para presiones arteriales/venosas en Surgivet
Propofol, 10 mg/mLSe usa como bolo para inducción de anestesia general y bomba de jeringuilla para el mantenimiento de la anestesia y nbsp;
PulsioxímetroMaismoNEOPT-500
Rocuronio, 10 mg/mLAuropharma2498820Se utiliza después de la cirugía y antes del inicio de la inducción de la lesión pulmonar, seguida de una infusión continua
Solución salina, 0,9%BaxterJB1324Enrojes de línea sanguínea y reanimación del volumen sanguíneo
Agua estérilN/DN/Dpara humidificador ventilador
Catéter de succión 10 CH/25 cmMediplast608810251Utilizado para el lavado bronquealveolar del lóbulo pulmonar
Catéter de succión 6 CH/40 cmMediplast60880640Eliminar el exceso de solución salina durante el lavado
Instrumentos quirúrgicos: mango de bisturí, pinzas mosquito, pinzas para el pulgar, tijeras metzenbaum, grapas, tijeras quirúrgicas, separadores, gasa, cuenco de acero inoxidableN/AN/APaquete quirúrgico autoclavado
Surgivet: manguito NIBP, sonda de temperatura,   2 pulsiómetros invasivos, ECG, pulsiómetroSuministros Veterinarios McCarthyv9203Incluye: manguito no invasivo de presión arterial (NIBP), termómetro, presión arterial (BP) 2x invasiva, electrocardiografía (ECG) y pulsioxímetro
Bombas de jeringuilla x 3Bombas de anestesia
Cintaaseguramiento de líneas intravenosas en el oído
Cinta umblicalEthiconasegura el tubo endotraqueal dentro de la tráquea
Ventilador (Servo-I)Getting ingeDebe tener ajustes neonatales para un volumen de marea adecuado
Circuito ventilatorioFisher y PaykelRT265con humidificador
Abrazadera ocluidora de tubo VorseN/DN/DOcluye el tubo durante el lavado

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