Trasplante ortotópico de pulmón izquierdo en ratas

El trasplante de pulmón es actualmente el único tratamiento eficaz para las enfermedades pulmonares terminales, que se han desarrollado rápidamente en los últimos años. En la actualidad, se han completado más de 100.000 operaciones de trasplante pulmonar en todo el mundo¹, pero las tasas de supervivencia a 5 y 10 años después del trasplante pulmonar son solo del 54% y el 32%, respectivamente². En comparación con otros trasplantes de órganos sólidos, es necesario mejorar la tasa de supervivencia después del trasplante pulmonar³. Diversas complicaciones graves después del trasplante pulmonar son los factores clave que afectan la tasa de supervivencia de los receptores, incluyendo la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo, la disfunción crónica del injerto pulmonar y la infección pulmonar ^4,5. El modelo de trasplante de pulmón de rata es una herramienta valiosa para estudiar estos temas, pero su adopción generalizada se ha visto obstaculizada por dificultades técnicas. Aunque el procedimiento ha sido reportado por varios laboratorios, implica una curva de aprendizaje pronunciada, altas tasas de complicaciones postoperatorias y bajas tasas de supervivencia, lo que limita su accesibilidad para los investigadores.

En este estudio, presentamos una técnica mejorada de trasplante pulmonar ortotópico diseñada para superar estos desafíos. Nuestro método se basa en los protocolos existentes, pero introduce refinamientos clave, como la preparación del manguito, la disección de la estructura hiliar, la fijación del pulmón del donante y técnicas de anastomosis optimizadas. Estas mejoras permiten que el procedimiento sea realizado por un solo cirujano con un equipo mínimo, reducen la dificultad de la anastomosis, acortan los tiempos de isquemia fría y caliente y, en última instancia, mejoran la tasa de éxito del modelo. Este enfoque tiene como objetivo apoyar una investigación básica más sólida y reproducible en trasplante de pulmón.

Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de Guangzhou Lai'an Technology Co., Ltd. (Aprobación No. G2024129). El experimento se llevó a cabo en ratas Lewis macho de 6 a 8 semanas de edad y con un peso de 250 a 300 g. Las ratas se criaron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luz: 25 lux) y tuvieron libre acceso a comida y agua.

1. Prepare los brazaletes (Figura 1)

1. Prepare catéteres y cuchillas intravenosas de 14 G y 16 G (Figura 1A).
2. Ajuste los catéteres intravenosos en un manguito con una cola con una cuchilla. Divida cada brazalete en un cuerpo (2-3 mm de longitud) y una cola (2-3 mm de longitud) (Figura 1B).
3. Cree rasguños superficiales en el cuerpo del manguito para aumentar la fricción para la fijación de la sutura.
   NOTA: Guarde manguitos de 16 G para las anastomosis de la arteria pulmonar (AP) y de la vena pulmonar (PV), y reserve manguitos de 14 G para las conexiones de los bronquios (Br) (Figura 1C).

2. Extracción de pulmón del donante (Figura 2)

1. Anestesiar a la rata donante mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg/kg). Coloque la rata en decúbito supino en la mesa de operaciones con la cabeza elevada y la cola bajada e hiperextienda el cuello.
2. Retraiga la lengua hacia afuera y hacia arriba, luego coloque una lámpara quirúrgica anterior al cuello como fuente de luz localizada para lograr una visualización clara de la abertura glotal (Figura 2A).
3. Insertar una cánula intravenosa de 14 G en la vía aérea a través de la glotis.
4. Configure el ventilador en modo controlado por presión, ingrese los parámetros de peso, ajuste la presión a 15 cmH₂O y conecte el ventilador.
5. Verifique si la subida y bajada del tórax es consistente con la frecuencia del ventilador para asegurarse de que el catéter intravenoso esté en las vías respiratorias.
6. Fije las extremidades y la cabeza, desinfecte el pecho y el abdomen, levante la piel abdominal con pinzas y use tijeras para cortar la piel del abdomen, el pecho y la parte delantera del cuello.
7. Realizar una incisión en la línea media, cortar la pared abdominal e inyectar heparina a una dosis de 1.000 UI/kg a través de la vena de la cavidad peritoneal expuesta durante 3 min para asegurar la heparinización sistémica.
8. Corta el diafragma y corta la cavidad torácica desde la mitad del esternón. Fije la pared torácica en ambos lados con hemostáticos. Extirpar el timo y exponer completamente la estructura anatómica de los órganos de la cavidad torácica.
9. Corta la vena cava superior, la vena cava inferior y las aurículas izquierda y derecha a su vez. Inyecte solución salina fría con una jeringa de 20 ml en la raíz del PA lentamente (~1 min) para una perfusión a baja presión hasta que el pulmón del donante se vuelva completamente blanco (Figura 2B).
10. Pinzar el Br del pulmón del donante con pinzas hemostáticas. Levante el Br y corte los tejidos conectados al pulmón del donante. Extraiga el corazón y el pulmón del donante en bloque y sumérjalos en solución salina preenfriada (Figura 2C).
    NOTA: El pinzamiento de Br mientras el pulmón del donante está en estado inspiratorio puede garantizar que los alvéolos del pulmón del donante no colapsen.

3. Modificación pulmonar del donante (Figura 3)

1. Coloque el bloqueo corazón-pulmón en hielo bajo el microscopio. Sujete la tráquea con un hemostático y asegúrela en plastilina.
2. Cubra los pulmones izquierdo y derecho con papel de lente estéril húmedo, separe los pulmones izquierdo y derecho tanto como sea posible y exponga completamente la estructura anatómica del hilio pulmonar.
3. Separe el PA, el Br y el PV bajo el microscopio con pinzas y lige el Br cerca del pulmón con suturas quirúrgicas 6-0 (Figura 3A-C).
4. Extraiga el PA, el BR y el PV del manguito hecho de manguito de indentación venosa de 16 G, 14 G y 16 G, respectivamente. Fije las paredes del tubo al manguito con 8-0 suturas quirúrgicas (Figura 3D-F).
5. Conserve los pulmones modificados del donante en solución salina, reposicionados en hielo, y espere la implantación.

4. Implante de pulmón de donante (Figura 4)

1. Anestesiar a las ratas receptoras con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (70 mg/kg) e intubar utilizando el mismo método que para los pasos 2.1-2.3.
2. Depilar la región toracodorsal izquierda del receptor, colocar al receptor en la postura de decúbito lateral derecho sobre una mesa de operaciones termostática y desinfectar el campo quirúrgico con alcohol al 75%.
3. Hacer una incisión a través de la piel y la pared torácica en el punto donde el impulso apical es más prominente (en el cuarto espacio intercostal) para entrar en la cavidad torácica.
4. Use un retractor de párpados para abrir la cavidad torácica. Empuje suavemente el pulmón izquierdo a un lado con un hisopo de algodón húmedo para exponer el ligamento pulmonar inferior y luego seccione bruscamente el ligamento.
5. Agarre el pulmón izquierdo con fórceps y retírelo fuera de la cavidad torácica. Asegure el hilio del pulmón con un hemostático y fíjelo a la incisión torácica ventral. Use arcilla para modelar para estabilizar aún más el hemostático en el lado del receptor (Figura 4A).
6. Extirpar el tejido que rodea el pulmón izquierdo, diseccionar el hilio pulmonar y separar la PA, la VP y la Br.
7. Pinzar los extremos proximales de la PA, BR y PV con pinzas vasculares (Figura 4B).
8. Uso 8-0 sutura quirúrgica para preatar la PA, BR y PV del receptor, asegurando una anastomosis rápida durante la implantación pulmonar del donante (Figura 4C).
9. Recorte una plataforma en el pulmón izquierdo del receptor pinzado para facilitar la colocación del pulmón del donante. Realice una pequeña incisión en el extremo distal de la PA, BR y VP del receptor (Figura 4D).
10. Enjuague la PA y la VP con solución salina heparinizada para prevenir la formación de trombos (Figura 4E).
11. Retire el pulmón del donante del hielo y colóquelo en la plataforma pulmonar izquierda del receptor. Levante un lado de la abertura de corte con pinzas, luego implante los manguitos de PA, Br y PV en el receptor secuencialmente y águelos (Figura 4F, G).
    NOTA: La secuencia de la anastomosis debe realizarse de la siguiente manera: primero anastomosar el PA, seguido del Br y, finalmente, el PV.
12. Abra la pinza microhemostática y observe cómo el pulmón del donante cambia gradualmente de blanco a rojo. Inspeccionar y asegurarse de que no haya sangrado en el sitio anastomótico (Figura 4H).
13. Extraer el pulmón izquierdo del receptor y devolverlo a la cavidad torácica (Figura 4I,J).
14. Aumentar adecuadamente la presión del ventilador para asegurar una expansión adecuada de los alvéolos en el pulmón donante.
    NOTA: En el modo de ventilación controlada por presión, la presión no debe exceder los 25 cmH₂O. Durante el procedimiento, los parámetros del ventilador se ajustan en función de la condición del receptor. Si el receptor presenta respiraciones jadeantes, sugiere la presencia de hipoxia, y los parámetros del ventilador deben ajustarse rápidamente en consecuencia.
15. Seque la cavidad torácica con una bola de algodón estéril y luego ciérrela capa por capa (Figura 4K).
16. Espere a que el receptor recupere gradualmente la respiración espontánea, luego retire el ventilador y observe. Cuando la frecuencia respiratoria espontánea alcance unas 100 veces por minuto, retire el tubo endotraqueal (Figura 4L).
    NOTA: Los signos que indican que el receptor está listo para ser retirado del ventilador al recuperar la respiración espontánea incluyen el movimiento de los bigotes, el movimiento de las extremidades y una curva de respiración irregular en la pantalla del ventilador.
17. Aloje a los recipientes en jaulas individuales con libre acceso a alimentos y agua, y mantenga la temperatura a ~22 °C.
18. Administrar inyecciones subcutáneas de meloxicam (5 mg/kg) a los receptores durante 3 días consecutivos para aliviar el dolor.

Se registró el tiempo de operación de cada paso del proceso de trasplante pulmonar en 30 ratas. En la Tabla 1 se muestra el momento de la preparación del manguito, la extracción del pulmón del donante, la isquemia fría y la isquemia tibia. Utilizando nuestro método mejorado, después de la capacitación preliminar, la tasa de éxito de la cirugía de trasplante alcanzó el 100%. Esta tecnología puede proporcionar apoyo para investigaciones posteriores sobre las complicaciones después del trasplante de pulmón. Hemos utilizado esta tecnología durante más de 2 años. Las siguientes figuras muestran nuestro proceso desde la fabricación del manguito (Figura 1), la extracción del pulmón del donante (Figura 2C), la modificación del pulmón del donante (Figura 3), hasta la implantación del pulmón del donante (Figura 4) y la evaluación de los resultados quirúrgicos (Figura 5). Seis meses después del trasplante singénico, se realizó una tomografía computarizada (TC) y una evaluación anatomopatológica de los receptores. Encontramos que la ventilación de los pulmones trasplantados fue buena en la TC, similar a la del grupo de operación simulada (solo toracotomía sin trasplante pulmonar); no hubo diferencias significativas en la apariencia macroscópica de los pulmones ex vivo entre el grupo de operación simulada y el pulmón derecho autólogo, y no se encontraron cambios patológicos evidentes en los resultados de la tinción de hematoxilina-eosina (HE). En resumen, nuestro trasplante de pulmón ortotópico izquierdo en rata fue exitoso, y la madurez de esta tecnología sentó las bases para la construcción de otros modelos de enfermedad después del trasplante pulmonar.

Figura 1: Preparación del manguito. (A) Diferentes tamaños de cánulas intravenosas y cuchillas de corte del manguito. (b) Aumento de 5x. Cortar el manguito bajo un microscopio. Barra de escala = 1 mm. (C) Puños para PA (16 g), PV (16 g) y Br (14 g). Abreviaturas: IV = intravenoso; PA = arteria pulmonar; PV = vena pulmonar; Br = bronquios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Extracción de pulmón del donante. (A) Intubación endotraqueal del donante. (B) Perfusión pulmonar del donante. (C) Coloque el pulmón limpio y perfundido del donante en hielo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Modificación pulmonar del donante. (A) Liberar la AP. (B) Libere y lige el Br. (C) Libere el PV (D-F) Fije el PA, el Br y el PV al manguito sucesivamente. Todas las imágenes microscópicas se capturaron con un aumento de 5x. Barra de escala = 1 mm. Abreviaturas: PA = arteria pulmonar; PV = vena pulmonar; Br = bronquios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Implante pulmonar del donante. (A) El receptor se fijó en la mesa de operaciones termostática; se abrió la pared torácica; y el pulmón izquierdo se retrajo y se fijó en la incisión. (B) Liberar y bloquear las estructuras hiliares. (C) Nudo quirúrgico preatado. (D) Haga una pequeña incisión en el extremo distal de la PA, BR y PV. (E) Enjuague con solución salina heparinizada. (F,G) Anastomosis de PA, Br y PV en secuencia. (H) Abra el clip hemostático para permitir la ventilación y la circulación sanguínea. (I) Resección del pulmón izquierdo del receptor. (J) Devolver el pulmón del donante a la cavidad torácica. (K) Cierre del cofre. (L) Esperar a que el destinatario se despierte. Todas las imágenes microscópicas se capturaron con un aumento de 5x. Barra de escala = 1 mm. Abreviaturas: PA = arteria pulmonar; PV = vena pulmonar; Br = bronquios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Evaluación posttrasplante. El grupo de operación simulada solo se sometió a toracotomía sin trasplante. La tomografía computarizada y la evaluación anatomopatológica de las muestras se realizaron 6 meses después. El grupo trasplantado recibió un trasplante singénico y se sometió a una tomografía computarizada y evaluación anatomopatológica 6 meses después. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tiempo de operación de cada procedimiento. Preparación del manguito: el tiempo total que se tarda en hacer tres manguitos (incluidos los manguitos para PA, PV y Br), Extracción de pulmón del donante: el tiempo que se tarda en extraer el pulmón del donante. Isquemia fría: tiempo durante el cual el pulmón donado se mantiene en hielo. Isquemia tibia: el tiempo que transcurre desde la extracción del pulmón donante del hielo hasta la reperfusión. Abreviaturas: PA = arteria pulmonar; PV = vena pulmonar; Br = bronquios.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 82470103), la Beca Especial de Investigación de la Fundación Médica Wu Jieping (No. 320.6750.2025-01-1), la Asociación de Educación Médica de China (Subvención No. ZJWYH-2023-YIZHI-003), el Proyecto de Investigación en Epidemiología Clínica del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Respiratorias (Subvención No. SKLRD-L-202504), el Proyecto de Tecnología de Características Clínicas de Guangzhou (Subvención No. 2023C-TS10) y el Proyecto Principal de Investigación Clínica bajo el Programa de Mejora de la Capacidad de Investigación de la Universidad Médica de Guangzhou (Subvención No. GMUCR2024-01007).