Artículo de método

Separación y caracterización diferencial de vesículas extracelulares microbianas intestinales en ratas sensibles a la sal en condiciones de dieta alta en sal

DOI:

10.3791/68279

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6 de junio de 2025

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1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe el aislamiento de VE microbianos intestinales de ratas sensibles a la sal alimentadas con HSD mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los VE se caracterizaron mediante seguimiento de nanopartículas, ensayos TEM, LPS/BCA y secuenciación de ARNr 16S para analizar el tamaño, la morfología, la composición y el origen de la microbiota.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El alto consumo de sal es un factor de riesgo importante para la hipertensión, y su mecanismo subyacente puede estar estrechamente relacionado con las vesículas extracelulares (VE) secretadas por la microbiota intestinal. Estos VE, producidos por la microbiota intestinal, transportan varios componentes bioactivos que pueden desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la hipertensión inducida por una dieta alta en sal (HSD). Para investigar este mecanismo, desarrollamos un método de extracción eficiente basado en la centrifugación en gradiente de densidad para aislar los VE de la microbiota intestinal de ratas sensibles a la sal alimentadas con una HSD. Mediante el análisis del tamaño de las partículas, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la detección de lipopolisacáridos (LPS), identificamos la distribución del gradiente de los VE de la microbiota intestinal y logramos una extracción precisa. Además, se empleó la secuenciación del gen ARNr 16S para analizar el origen y las diferencias de composición de las VE entre los grupos normales y HSD, revelando el impacto de una ingesta elevada de sal en las características genéticas de las VE de la microbiota intestinal. Este estudio proporciona valiosas herramientas y conocimientos científicos sobre los mecanismos de la microbiota intestinal que subyacen a la hipertensión inducida por la sal y ofrece nuevas perspectivas para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microbiota intestinal, también conocida como microflora de la microbiota intestinal o microecología intestinal, es un complejo de decenas de miles de microorganismos ubicados en el tracto gastrointestinal biológico y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud humana1. En los últimos años, con más investigaciones, se ha descubierto que la microbiota intestinal puede producir vesículas extracelulares (VE)2. Los VE son pequeñas vesículas liberadas por las células, que transportan varias moléculas en la célula, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos 3,4. Pueden interactuar con otros microbios5, células epiteliales intestinales e incluso tejidos y órganos distantes6, afectando así la salud del cuerpo humano 7,8. Existe una estrecha relación entre las VE producidas por estas microbiotas intestinales y la dieta9.

Las VE producidas por la microbiota intestinal pueden ser agentes importantes a través de los cuales una dieta alta en sal (HSD) afecta a la salud del organismo. La HSD no solo altera directamente el equilibrio de la microbiota intestinal10, lo que conduce a una reducción significativa del número de bacterias beneficiosas (como Lactobacillus)11, sino que también promueve la proliferación de bacterias dañinas (como Bacteroides, etc.)12. Este desequilibrio reduce la función de barrera intestinal y aumenta el riesgo de inflamación intestinal. Además, una HSD también afecta aún más al equilibrio ácido-base y a la absorción de nutrientes en el intestino al modificar las actividades metabólicas13 de la microbiota intestinal, como la reducción de la producción de ácidos grasos de cadena corta14,15 con múltiples funciones fisiológicas.

Estos cambios no solo afectan la salud intestinal, sino que también pueden regular indirectamente la producción y liberación de VE y alterar la composición y función del VE. El ambiente rico en sal puede afectar las funciones fisiológicas normales de las células intestinales, incluida la liberación y el transporte de VE, alterando así el papel de las VE en la transmisión de información intercelular y la regulación inmunitaria. Al mismo tiempo, la inflamación intestinal puede promover una variedad de EV con funciones especiales16 y diseminarse a todo el cuerpo a través del eje intestino-órgano y otras formas17,18, lo que está estrechamente relacionado con la aparición y desarrollo de hipertensión19,20, enfermedades cardiovasculares21 y cerebrovasculares22,23, obesidad24,25, diabetes26 y otras enfermedades crónicas.

Por lo tanto, el objetivo general de este estudio era desarrollar un método eficaz y fiable para extraer los VE de la microbiota intestinal de ratas sensibles a la sal alimentadas con HSD y estudiar sistemáticamente sus propiedades físicas, composición y funciones. Debido a las características del aumento significativo de la presión arterial después de una dieta alta en sal, se seleccionaron ratas sensibles a la sal y se reveló el efecto de la HSD en la EV de la microbiota intestinal mediante la construcción de un método de extracción eficiente. El método se basó en la centrifugación en gradiente de densidad y combinó varias técnicas de identificación dinámica, como la detección del tamaño de partícula, la medición de LPS/BCA, la microscopía electrónica de transmisión y el análisis proteómico. El protocolo tiene como objetivo revelar los efectos de la HSD en la EV de la microbiota intestinal y sus mecanismos en la enfermedad cardiovascular. Con su alta eficiencia, reproducibilidad y amplia aplicabilidad, este enfoque no solo proporciona una herramienta importante para explorar el mecanismo de las VE de la microbiota intestinal en la hipertensión inducida por la sal, sino que también sienta las bases teóricas para desarrollar estrategias de intervención en enfermedades basadas en las VE. A través de este estudio, esperamos abrir nuevas vías para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión 27,28.

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Protocolo

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Este estudio experimental en animales cumple con las directrices éticas y las normas internacionales pertinentes. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Chengdu (institución: Universidad de Medicina China de Chengdu; número de protocolo: 2018-21).

1. Preparación animal y régimen dietético

  1. Aclimatar ratas Dahl macho sensibles a la sal de 6 semanas de edad, peso corporal de 180 a 200 g, criándolas con una humedad del 50% ± del 10%; Ciclo de luz de 12 h / 12 h; 20,0 ± 2,0 °C durante 1 semana en condiciones específicas libres de patógenos.
  2. Posteriormente, divida las ratas en partes iguales en dos grupos (n = 6). Proporcionar a cada grupo una dieta diferente que dure 6 semanas: una dieta normal de sal (NSD) con 0,5% de cloruro de sodio y una HSD con 8% de cloruro de sodio, que es comúnmente utilizada en los estudios publicados 29,30,31. Los ratones tuvieron acceso ilimitado a comida y agua durante todo el estudio.

2. Monitorización de la presión arterial

NOTA: La pletismografía con manguito de cola se utilizó como método no invasivo para la medición de la presión arterial, y se utilizó el registro de la presión volumétrica (VPR) cuando la presión arterial se midió a partir del volumen sanguíneo de la cola.

  1. Coloque las ratas individualmente en jaulas pequeñas con aserrín, calentadas durante 10 minutos a aproximadamente 37 ° C y colóquelas en un sistema de retención de roedores personalizado con una nariz y puerta ajustables para la entrada de animales. Coloque a las ratas en una almohadilla térmica en posición prona para mantener su temperatura corporal a 37 °C.
  2. Conecte el sensor VPR a la parte inferior de la cola y establezca al menos 10 ciclos de adaptación para estabilizar el BP28.
    1. Llene el brazalete inflable en la raíz de la cola y coloque el sensor pletismográfico (o sensor fotoeléctrico) debajo. Infle lentamente hasta superar la presión sistólica (generalmente 200 mmHg) y luego suelte lentamente. El instrumento detecta automáticamente el valor de la presión de la desaparición de la onda de pulso (presión arterial sistólica) y la recuperación (presión arterial diastólica). Mida de 3 a 5 veces consecutivas y tome el valor promedio.
  3. Entrene a todas las ratas para que se adapten al procedimiento de restricción y realice este estudio en un laboratorio tranquilo alrededor de las 9 a.m. para minimizar los efectos de la variación circadiana.
  4. Mida la presión arterial sistólica (PAS) y la presión arterial diastólica (PAD) cada dos días antes del sacrificio. Estimación de la presión arterial media (PAM) a partir de la PAS y la PAD
    MAPA = (SBP + 2 DBP)/3

3. Extracción de vehículos eléctricos

  1. Recogida de muestras
    1. Sumerge un hisopo de algodón estéril en alcohol al 75% y úsalo para estimular el ano de la rata. La estimulación estaba destinada a promover el peristaltismo intestinal y relajar el esfínter anal, favoreciendo así la defecación. Una vez expulsadas las heces, recójalas con pinzas estériles en recipientes estériles del tamaño adecuado y guárdelas inmediatamente a -80 °C.
  2. Preparación de la muestra
    1. Con una cuchara, transfiera 5 g de heces a un tubo de centrífuga de 50 ml previamente pesado. Añada 50 ml de PBS precalentado a 37 °C libre de endotoxinas (concentración máxima de muestra del 10%) al tubo y gírelo durante 30 min. Enfríe la centrífuga de alta velocidad a 4 °C.
    2. Centrifugar a 8.000 x g durante 15 minutos después de colocar las muestras simétricamente para permitir que la centrífuga se equilibre. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de centrífuga estéril.
    3. Vuelva a centrifugar a 8.000 x g durante 15 min. Aspire el sobrenadante y utilícelo para un análisis posterior.
  3. Preparación del extracto crudo
    1. Utilice una unidad de filtro estéril de 0,22 μm. Coloque la unidad de filtro sobre hielo y sujete firmemente la bomba de vacío. Transfiera el sobrenadante obtenido a la parte superior del filtro. Encienda la bomba de vacío para recoger las muestras filtradas.
    2. Transfiera el filtrado a un filtro centrífugo (10 kDa, 15 mL), centrifugue a 4 °C, 3.000 x g durante 30 min y concentre la muestra a al menos 1400 μL.
    3. Recoger la muestra concentrada y, si es necesario, diluirla a 1400 μL utilizando PBS libre de endotoxinas preenfriado. Mantenga la muestra en hielo inmediatamente después de la dilución.
      NOTA: El extracto crudo puede utilizarse inmediatamente o almacenarse a -80 °C durante varios meses.
  4. Separación de vehículos eléctricos
    1. Prepare la zona de influencia de degradado A y la zona de influencia de degradado B como se describe a continuación. Prepare el tampón con un día de anticipación, ya que el compuesto tarda varias horas en disolverse por completo. El tampón preparado puede almacenarse a 4 °C durante 6 meses.
      1. Preparación del tampón de gradiente A: Disolver 0,25 M de sacarosa, 6 mM de EDTA y 60 mM de Tris en 800 mL de agua libre de endotoxinas mediante agitación magnética con mezclador, con el pH ajustado a 7,4 utilizando ácido clorhídrico. Diluir hasta 1 L con agua libre de endotoxinas. Utilice un filtro de tapa de botella de 0,22 μm para filtrar el tampón.
      2. Preparación del tampón de gradiente B: Disolver 0,25 M de sacarosa, 1 mM de EDTA y 10 mM de Tris en 800 mL de agua libre de endotoxinas mediante agitación magnética con mezclador, con pH ajustado a 7,4 con ácido clorhídrico. Diluido a 1 L con agua libre de endotoxinas. Utilice un filtro superior de botella de 0,22 μm para filtrar el tampón.
    2. Mezcle 1 volumen de tampón de gradiente A y 5 volúmenes de medio de gradiente de densidad (el medio es una solución de yodixanol al 60%) para preparar la solución de trabajo.
    3. Preparación de la solución de iodixanol (10%, 20%, 40%): Para preparar una solución de iodixanol al 10%, mezcle 1 unidad de solución de trabajo y 4 unidades de tampón B; para una solución de yodixanol al 20%, mezcle 2 unidades de solución de trabajo y 3 unidades de tampón B; para una solución de yodixanol al 40%, mezcle 4 unidades de solución de trabajo y 1 unidad de tampón B. Prepare cada solución fresca y guárdela en hielo.
      NOTA: Se deben preparar nuevas soluciones de trabajo para cada experimento, y se puede preparar un volumen adicional de soluciones del 10% para dar cuenta del error experimental.
    4. Mezcle la solución preparada en el paso 3.3.3 con 7 mL de medio de gradiente de densidad para hacer una solución de yodixanol al 50%.
    5. Para preparar un gradiente de densidad, agregue una solución de azul de tripano a la solución al 40% y una solución de yodixanol al 10% (peso / vol) para proporcionar un contorno claro entre las distintas capas.
    6. Transfiera 8 mL de solución de yodixanol al 50% al fondo del tubo de centrífuga de polipropileno de pared delgada. Incline el tubo a 70° y transfiera 8 mL de solución de yodixanol al 40% a la superficie líquida. Agregue 8 mL de solución de yodixanol al 20%, luego 7 mL de solución de iodixanol al 10% y finalmente 2 mL de PBS libre de endotoxinas.
      NOTA: La preparación de un gradiente de densidad requiere práctica. La calidad del gradiente de densidad tiene un gran impacto en los resultados experimentales. No coloque el tubo en posición vertical entre los diferentes pasos del proceso de adición, ya que esto afecta negativamente la calidad del gradiente de densidad.
    7. Enfríe previamente la centrífuga y coloque el gradiente de densidad preparado en la ultracentrífuga. Parámetros de entrada para iniciar, valores de parámetros: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
    8. Para la separación manual de la densidad en gradiente, extraiga lentamente 2 mL de la solución desde el centro de la superficie del sistema que contiene un total de 34 mL de líquido. Cada 2 ml es un gradiente, dividiendo así la solución del gradiente de densidad en 17 gradientes.
    9. Transfiera las fracciones de densidad a un tubo de muestra estéril con una pipeta y colóquelas inmediatamente en hielo. Sujete el tubo de centrífuga entre el pulgar y el índice para asegurarse de que permanezca en posición vertical.
  5. Recuperación de vehículos eléctricos
    1. Utilizando un sistema de extracción de EV totalmente automatizado que aplica oscilación de presión negativa a través de un sistema de oscilación ultrasónica de doble acoplamiento en el chip de ultrafiltración, elimine las impurezas de ácido nucleico y proteínas en la muestra a través del nanoporo e intercepte los EV, lo que conduce al enriquecimiento y purificación de los EV.
      1. Retire el filtrado en el paso 3.4.7 y agréguelo al chip de ultrafiltración.
      2. Opere el instrumento de acuerdo con las instrucciones del instrumento y recoja el filtrado filtrado, es decir, la solución enriquecida con exosomas. El proceso principal se muestra en la Figura 1.

4. Identificación de vehículos eléctricos

  1. Detección de tamaño y concentración de partículas
    1. Evalúe la distribución de tamaño y el potencial zeta utilizando un contador de nanoculoómetro basado en detección de pulso resistivo (RPS). Seleccione chips de nanoporos con un rango de medición de 60-200 nm para este experimento. Además, evalúe la distribución del tamaño de partícula y el potencial zeta de los EV utilizando un contador de nanobibliotecas.
      1. Tome una cantidad adecuada de solución de EVs y dilúyala en (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Se colocaron diferentes diluciones de soluciones de vehículos eléctricos en el instrumento para realizar pruebas.
      3. Se seleccionó el múltiple de dilución con mejor estabilidad y se volvió a probar para obtener datos más precisos.
  2. Ensayo de LPS y BCA
    1. Ensayo de BCA: Lisar los EV con tampón RIPA y, a continuación, separar las proteínas. Determine el contenido de proteínas de los EV utilizando el kit de determinación de la concentración de proteínas BCA.
    2. Ensayo LPS: Usando el kit de detección de endotoxinas, agregue muestras, un detector de endotoxinas y cromogénicos de acuerdo con los pasos del kit. Mida la absorbancia a 545 nm y calcule la expresión de LPS de las vesículas externas de acuerdo con la curva estándar.
  3. Evaluación TEM: Para la tinción negativa y el análisis TEM, aplique muestras a una rejilla de cobre luminiscente recubierta con una película de carbono continua y tiña con formiato de uranilo al 0,75%. Para crio-EM, absorba los vehículos eléctricos en una rejilla de carbono EM de malla 300 con una superficie hidrofílica y congele en nitrógeno líquido. Observe y analice las rejillas utilizando el Cryo-TEM y grabe las imágenes a 22.000 aumentos32.
  4. Caracterización de proteínas: Lisar EVs utilizando tampón RIPA y luego separar las proteínas. Determine la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA, separe cantidades iguales de proteínas de cada muestra mediante SDS-PAGE y tiña con una solución de colorante azul de Coomassie después de la electroforesis para visualizar los perfiles de proteínas33,34.
  5. Secuenciación y análisis S: Extraiga el ADN genómico de las muestras fecales utilizando un kit de extracción de ADN fecal. Evaluar la integridad y concentración de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa y un espectrofotómetro. Amplifique la región V3 - V4 del gen 16S rRNA con cebadores universales, purifique los productos de PCR, cuantifique y secuséntelos en la plataforma Illumina. Realice análisis de datos mediante la canalización QIIME235.
    1. Clasifique las variantes de secuencia de amplicones (ASV) mediante DADA2 y compárelas con la base de datos Silva mediante el algoritmo VSEARCH. Utilice el análisis de α-diversidad para evaluar la riqueza y diversidad de especies dentro de las muestras, utilizando principalmente índices como el índice de Shannon y el índice Chao1. El análisis de β-diversidad compara la composición de la comunidad microbiana entre muestras y generalmente se visualiza mediante análisis de coordenadas principales (PCoA). Utilice métodos de análisis diferencial, como el análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe) y el análisis de diagramas volcánicos, para identificar taxones microbianos con condiciones significativamente diferentes o entre grupos.

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Resultados

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Las concentraciones de EVs se determinaron en diferentes fracciones (Figura 2A). Los resultados experimentales mostraron que la concentración de los EV exhibió un patrón de distribución normal típico en una serie de soluciones de gradiente de densidad (Figura 2B). En concreto, en la fracción 9, la concentración de VE alcanzó su punto más alto (3,85 x 109), lo que sugiere que la principal fracción de distribución de los VE puede ser de 9

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Discusión

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En este estudio, nos centramos en las VE de la microbiota intestinal en ratas sensibles a la sal en un HSD y logramos una serie de logros clave. En primer lugar, se construyó con éxito un método de extracción eficiente basado en la centrifugación en gradiente de densidad para aislar los VE de la microbiota intestinal de rata sensible a la sal en HSD, y la mayoría de los componentes no EV se aislaron mediante un meticuloso y estandarizado proceso de procesamiento de muestras y manipulació...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contrapuestas que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82205240), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Sichuan (2025ZNSFSC1836) y el Proyecto Clínico Básico del Hospital Ortopédico Provincial de Sichuan (PY202414).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Essential Supplies
Centrífuga (10 nkDa 2 mL)UFC903096Millipore
Tude(50 mL)Centrífuga BKMAN20220404
TudesZ30815SCA
Biosharp24902581
Reagents
022124240705
Coomassie Blue Fast Staining SolutionBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotimeA006241112
EtanolKESH
HCl
OptiPrep (60% en peso/vol, yodixanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
ácido fosfotúngsticoRUIXIN
SacarosaDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Solución de tinción de azul de tripano (0,4%)BeyotimeBD07242904
Equipment
ABP01690
BiomicroscopeMoticBA210Digital
Desk centrifugeCenceCHT210R
Microcentrífuga de alta velocidad de escritorioDLABD3024
+ copa centrífuga de 500 mLCence
balanza electrónica de alta precisiónSKRBN-200
Nantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Giro de cubeta oscilante + SW 32.1 Ti Cubeta de rotorBECKMAN COULTER
Microscopio electrónico de transmisiónJEOLJEM-1400FLASH
Rotador
UltracentrífugaBECKMAN COULTEROptima XE-100
Sistema de agua ultrapuraULPHWUPR-II-15TNZ
Bomba de vacío multifunción de cieculación de aguaQiang QiangSHZ-D (III)
Filtro centrífugo Centrífuga Sistema de filtración al vacío BECKMAN COULTERChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit Beyotime Absorbance Microplate Reader SpectraMax Rotor de aluminio de ángulo fijo Gabinete de flujo laminar dede tubo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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