Artículo de método

Evaluación de la hiperalgesia de rodilla en ratones mediante la medición de la aplicación de presión

DOI:

10.3791/68480

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13 de junio de 2025

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1Department of Internal Medicine, Division of Rheumatology, Rush University Medical Center, 2Chicago Center on Musculoskeletal Pain

En este artículo

Resumen

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El protocolo describe cómo medir la hiperalgesia de rodilla en ratones. Mostramos ejemplos en modelos murinos de dolor agudo de rodilla, así como en modelos de osteoartritis (OA).

Resumen

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La evaluación de la hiperalgesia de rodilla proporciona un ensayo sólido para medir la sensibilización periférica en la rodilla y representa un comportamiento dependiente del dolor clínicamente relevante que se puede utilizar en modelos de artritis en roedores. Se han descrito varios métodos para determinar el umbral de las respuestas a la compresión de la rodilla en roedores. Aquí, nuestro objetivo fue adaptar los métodos existentes para desarrollar un método estandarizado para evaluar la hiperalgesia de rodilla en ratones adultos, utilizando un dispositivo de medición de aplicación de presión (PAM). El protocolo incluye pasos detallados, recomendaciones de capacitación para nuevos experimentadores y consejos para lograr resultados consistentes. Proporcionamos sugerencias para la formación óptima de un nuevo experimentador. Por último, se proporcionan resultados representativos tanto para los modelos agudos de hiperalgesia transitoria como para los modelos experimentales de osteoartritis (OA), que se caracterizan por dolor crónico. Este método es muy sensible a las intervenciones farmacológicas, por lo que es adecuado para evaluar los efectos de mediadores como las citocinas y para ensayos de cribado de fármacos de rendimiento medio. En resumen, el enfoque descrito proporciona un método sólido y clínicamente relevante para cuantificar la hiperalgesia de rodilla.

Introducción

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La osteoartritis (OA), la forma más común de artritis, se caracteriza por la degradación progresiva del cartílago, la sinovitis, el remodelado óseo yel crecimiento de osteofitos, y se presenta clínicamente como dolor y pérdida de la función articular. La artrosis es una de las principales fuentes de dolor crónico en el mundo, con un profundo impacto en la vida de los pacientes debido a la movilidad reducida y a los problemas de salud asociados, como la ansiedad y la depresión 2,3. Los fármacos comúnmente prescritos para el dolor de la artrosis incluyen antiinflamatorios no esteroideos (AINE), viscosuplementación, corticosteroides y opioides, pero su eficacia es limitada y su uso prolongado se asocia con efectos adversos graves o riesgo de adicción 1,4.

En los últimos años, grandes estudios de cohortes han intentado describir cuidadosamente el dolor experimentado durante la artrosis progresiva5. Como parte de este esfuerzo, varios estudios han realizado pruebas sensoriales cuantitativas (QST) en sujetos con OA, con el objetivo general de identificar la sensibilización y determinar las asociaciones entre las medidas de QST y los síntomas y la gravedad de la OA, así como la respuesta al tratamiento (revisado en6). La Asociación Internacional para el Estudio del Dolor define la sensibilización como un aumento de la capacidad de respuesta de las neuronas nociceptivas a su entrada normal y/o el reclutamiento de una respuesta a entradas normalmente por debajo del umbral7. Cada vez está más claro que la sensibilización es un proceso clave que subyace al dolor crónico en la artrosis. Un hallazgo particular del QST que distingue sólidamente a los sujetos con OA sintomática de los controles es una reducción en el umbral de presión del dolor (PPT). Un metanálisis de los valores de PPT (tanto en la rodilla como en sitios distantes de la rodilla) de 1.003 participantes con y sin OA de rodilla informó una diferencia de medias estándar significativa (DME, diferencia en las medias dividida por la desviación estándar) en PPT entre personas con OA y controles8.

La observación de que los pacientes con OA muestran sensibilización a los estímulos mecánicos, que se manifiesta como umbrales de presión del dolor disminuidos cuando se aplica una fuerza a la articulación, sugiere mecanismos subyacentes de sensibilización periférica y central que resultan de cambios en la vía del dolor6. Los fundamentos moleculares y celulares de estos cambios se pueden estudiar en modelos de OA en roedores. En los últimos años, se han desarrollado modelos de ratón sofisticados para modelar la naturaleza lentamente progresiva de la artrosis de rodilla, y este enfoque ha revelado que distintos mecanismos de dolor operan de manera dependiente del tiempo, lo que puede tener una importante importancia traslacional9. Por ejemplo, en el curso de la artrosis de rodilla experimental inducida quirúrgicamente, los ratones desarrollan alodinia mecánica en la pata trasera operada al principio del curso de la enfermedad, mientras que los déficits de carga de peso solo se hacen evidentes en la enfermedad en etapa tardía9.

Al igual que en los pacientes con artrosis, los ratones con artrosis experimental desarrollan un umbral de dolor disminuido para el dolor aplicado a la rodilla al principio del curso de la artrosis de rodilla experimental10. Esto es indicativo de la sensibilización de los nociceptores inervantes de la rodilla, que de hecho puede visualizarse y cuantificarse mediante imágenes de calcio in vivo de los ganglios de la raíz dorsal lumbar11. La evaluación de la hiperalgesia de rodilla proporciona un ensayo sólido y relativamente sencillo para medir la sensibilización periférica, lo que representa un comportamiento dependiente del dolor clínicamente relevante que se puede utilizar en modelos de artritis en roedores. Se han descrito varios métodos para determinar el umbral de las respuestas a la compresión de la rodilla en roedores. Estudios más antiguos informan que se aprieta la rodilla entre el pulgar y el índice, y se registra una respuesta subjetiva de retirada o una respuesta de vocalización en el animal 12,13,14 En 2007, Barton et al. informaron sobre la medición de la aplicación de presión (PAM) como una nueva técnica conductual para registrar la hipersensibilidad mecánica en la rodilla de la rata en la artritis inflamatoria 15. Posteriormente, el método fue validado en ratones con artritis de rodilla inducida por antígenos 16. La PAM es una técnica que utiliza un transductor de fuerza para ejercer una fuerza creciente sobre la rodilla afectada al tiempo que proporciona retroalimentación visual, lo que permite la compresión de la rodilla de forma reproducible, lo que aumenta su sensibilidad y reproducibilidad. Estos dos estudios publicados anteriormente se centraron en modelos de artritis inflamatoria, donde la hinchazón de la rodilla es prominente. Por lo tanto, nos propusimos adaptar estos métodos15,16 para desarrollar un método estandarizado para evaluar la hiperalgesia de rodilla en ratones, que pueda aplicarse fácilmente a modelos de OA y que responda altamente a la intervención farmacológica, como se describe aquí.

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rush. El protocolo descrito consiste en evaluar la hiperalgesia de rodilla en la rodilla derecha en respuesta a un estímulo mecánico en ratones adultos C57BL/6 (10 semanas a 2 años de edad) de ambos sexos. Para medir la hiperalgesia de rodilla en la rodilla izquierda, cambie de mano.

1. Configuración del dispositivo de medición de aplicación de presión (PAM)

  1. Conecte un cable del dispositivo PAM a la computadora y el segundo cable del dispositivo PAM al transductor de fuerza.
  2. Encienda la computadora e inicie el software PAM. Ajuste la presión máxima a 450 g.
    NOTA: El software y el pequeño transductor pueden medir hasta 500 g. Por lo tanto, el experimentador puede elegir una meseta entre 450 g y 500 g, pero el límite máximo no debe cambiar dentro de un experimento.
  3. Deje a los ratones en la sala de pruebas durante 15-30 minutos hasta que se aclimaten y se hayan calmado. Asegúrese de que la sala de pruebas sea una habitación separada de donde se alojan los ratones y que la habitación esté en silencio. Utilice la misma sala de pruebas durante todo el estudio.
  4. Realice la aclimatación previa, si es necesario, para calmar a los ratones antes de que comience el estudio: en este caso, sujete a los animales sosteniendo el ratón con la mano izquierda, sujetando la espalda y sujetando firmemente la cola conlos dedos 4 y 5 (como lo harían para la prueba), 2 días antes del primer día de prueba para aclimatar a los ratones al ensayo. Dentro de un experimento dado, aclimata a todos los ratones de la misma manera.
  5. Después de la aclimatación, asegúrese de que el ratón esté tranquilo y no se retuerza cuando esté sujeto. Si el ratón no está tranquilo, devuélvalo a su jaula y posponga las pruebas durante unos días.

2. Entrenamiento para la medición de la hiperalgesia de rodilla

  1. Comience con animales ingenuos y aprenda a reconocer las respuestas cuando los animales están tranquilos. Esto le informará al experimentador para que reconozca cuál es una respuesta normal para ese ensayo.
  2. Utilice un modelo experimental en el que la hiperalgesia de rodilla haya sido caracterizada por un evaluador experimentado para saber qué esperar. Reconocer que en la OA experimental, las respuestas pueden ser menos obvias que en los modelos agudos o inflamatorios.
  3. Use lidocaína o un opiáceo para revertir el comportamiento del dolor: esto ayudará a evaluar cómo diferenciar entre una respuesta al estrés y una respuesta real relacionada con el dolor.
  4. Realice todas las pruebas de una manera ciega a la asignación de grupos. Realizar un experimento de modelo de artrosis con analgésicos conocidos en un experimento controlado por vehículo. Confirme que el probador puede distinguir estos grupos y obtener mediciones reproducibles.
  5. Es de esperar que completar la capacitación pueda llevar varias semanas.

3. Medición basal de la hiperalgesia de rodilla mediante PAM

NOTA: Muchos modelos experimentales de artritis inflamatoria u osteoartritis son unilaterales (por ejemplo, artrosis de rodilla inducida quirúrgicamente). Para evaluar la hiperalgesia de rodilla en estos modelos, siempre medimos primero el umbral de retirada de la rodilla en la rodilla contralateral de todos los ratones que se van a probar. Después de eso, probamos la rodilla ipsilateral. A modo de ejemplo, este protocolo se puede aplicar para medir la hiperalgesia de rodilla en la OA experimental inducida por DMM. En este modelo, el daño articular se acompaña de hiperalgesia de rodilla, que se desarrolla en la semana 2 después de la cirugía, y se mantiene hasta la semana 1617.

  1. Acuna al ratón en la mano izquierda, sujetando la espalda y sujetando firmemente la cola conlos dedos 4 y 5.
  2. Pase el dedo índice de la otra mano (mano derecha) a través de la brida del transductor (Figura 1A). Luego, coloque el dedo índice con el transductor en una bolsa de plástico transparente (por ejemplo, una bolsa de sándwich). Esto evitará que el transductor se ensucie, por ejemplo, con la orina del ratón.
    NOTA: El transductor es frágil y se rompe fácilmente si no está protegido de líquidos o cuando se aplica una fuerza demasiado alta.
  3. Con el pulgar y el dedo medio derechos, agarre la pierna derecha y use el dedo medio para sujetar suavemente la pata en el tenar de la mano izquierda (Figura 1B). La posición correcta de la rodilla al inicio de la prueba es alrededor de una flexión de 90°.
  4. Con la rodilla en flexión de 90°, el pulgar derecho toca el lado lateral de la rodilla. Con el dedo índice tocando el lado medial del transductor, aplique presión lentamente contra la rodilla. Según las indicaciones del software de la computadora (línea azul en el gráfico), aplique una fuerza creciente a una velocidad constante (30 g / s), hasta 450 g o hasta que el mouse muestre comportamientos relacionados con el dolor, como vocalización, espasmos musculares, retorcimiento corporal o movimiento de bigotes.
  5. Una vez que el ratón muestre un comportamiento relacionado con el dolor, retraiga el dedo con el transductor de la rodilla y registre la presión que se muestra en la pantalla (Figura 1C). Si el ratón no muestra un comportamiento relacionado con el dolor cuando se alcanzan los 450 g, suelte el transductor y asigne un valor de 450 g como umbral de extracción para esa prueba.
    NOTA: Cada ratón individual expresa una respuesta al dolor a su manera. Por lo tanto, el evaluador tiene que determinar qué comportamientos relacionados con el dolor expresan los ratones individuales. Sin embargo, algunos ratones no expresan comportamientos relacionados con el dolor en absoluto, y en este caso, el evaluador puede volver a probar la rodilla contralateral para determinar la respuesta al dolor individual de ese ratón un par de días después o continuar midiendo el lado ipsilateral y determinar el patrón de comportamiento. Esta última opción requiere muchas horas de experiencia, por lo que se recomienda la primera opción para un principiante.
  6. Regrese el mouse a la jaula y proceda a probar el siguiente mouse. Cuando se haya probado una rodilla en todos los ratones, regrese al primer ratón y repita la prueba. Pruebe cada rodilla 2 veces y tome un promedio de los resultados de las dos pruebas como resultado final. Este número se denomina umbral de retiro.
    1. Si hay una diferencia de ≥ 60 g entre la1ª y la2ª medición, tome una3ª medida y utilice la media de las tres medidas como resultado final. Trate de no estresar a los ratones y evite múltiples mediciones consecutivas en el mismo ratón. Es por eso que tiene que haber algún tiempo entre cada medición consecutiva.
  7. Pruebe la hiperalgesia de rodilla en condiciones de ceguera para evitar sesgos. Utilice crotales individuales para facilitar el cegamiento. Determinar si el comportamiento del ratón es indicativo de dolor requiere práctica, experiencia y confianza porque el evaluador tiene que usar su juicio. Por eso es importante cegar a los grupos experimentales.

4. Medición de la hiperalgesia de rodilla en un modelo de dolor agudo de rodilla

  1. Después de la medición basal de la hiperalgesia de rodilla, afeite el pelaje alrededor de la rodilla.
  2. Anestesiar al animal con isoflurano y comprobar la anestesia adecuada con el reflejo de pinzamiento del dedo del pie. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. Inyecte 5 μL de Pam3CSK4 (1 μg o 3 μg disueltos en agua estéril) o control del vehículo (5 μL) a través del tendón rotuliano en el espacio intraarticular de la rodilla derecha o izquierda, utilizando una jeringa Hamilton con una aguja 30G.
  3. Evaluar la hiperalgesia de rodilla 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 24 h después de la inyección en condiciones de cegamiento.
  4. Para evaluar el efecto de la lidocaína, inyecte lidocaína (20 mg/kg en solución salina) o solución salina por vía intraarticular 4 h después de la inyección de Pam3CSK4. Luego, evalúe la hiperalgesia de rodilla después de 0,5 h, 2 h y 20 h.

5. Valoración longitudinal de la hiperalgesia de rodilla en un modelo prolongado de artrosis

  1. Evaluar la hiperalgesia basal de rodilla en ratones machos C57BL/6 de 12 semanas de edad.
  2. Realizar la desestabilización del menisco medial (DMM) o cirugía simulada en una rodilla, como se describe en18.
  3. Evalúe la hiperalgesia de rodilla a las 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas y 16 semanas después de la cirugía.
  4. Para evaluar el efecto de la lidocaína intraarticular, evalúe la hiperalgesia de rodilla 4 semanas después de la DMM y, a continuación, inyecte lidocaína (20 mg/kg en 5 μL) o solución salina bajo anestesia con isoflurano como se describe en el paso 4.
  5. Evaluar la hiperalgesia de rodilla 20 min, 120 min y 240 min después de la inyección de lidocaína.

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Resultados

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Evolución temporal de la hiperalgesia de rodilla en un modelo de dolor agudo de rodilla
Todos los resultados mostrados han sido reportados previamente por nuestro grupo, y nos remitimos a10para una descripción detallada. El primer ejemplo muestra un modelo para inducir hiperalgesia aguda y transitoria de rodilla. En este experimento, inyectamos Pam3CSK4, un ligando sintético del receptor tipo Toll 2 (TLR2) (1 μg o 3 μg, disuelto en agua estéril...

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Discusión

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La medición de la hiperalgesia de rodilla en ratones ofrece un medio relativamente rápido y sencillo de evaluar la hiperalgesia de rodilla asociada con artritis experimental. Como se puede observar en los resultados representativos mostrados, el ensayo puede detectar hiperalgesia de inicio agudo y transitoria (Figura 2A). Hemos reportado este comportamiento en respuesta a varios mediadores inyectados en la articulación de la rodilla, incluyendo un fragmento ...

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Divulgaciones

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AMM es consultora de Novartis, Merck, Roivant y Averitas. Ha recibido apoyo de investigación de Orion y Eli Lilly. SI y REM no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nuestra investigación está financiada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, Números de Subvención/Premio: P30AR079206 (AMM), R01AR060364 (AMM), R01AR064251 (AMM), UC2AR082186 (AMM), R21AR085242-01 (AMM) y R01AR077019 (REM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antagonista del receptor de quimioquina C-C 2 (CCR2RA)TocrisRS 504393
Ordenador (de cualquier tipo)Mínimo para Windows 7
LidocaínaSigmaL5647
Medición de Aplicación de Presión (P.A.M)Ugo Basile38500Incluía transdutor, ordenador y cables
Bolsa para bocadillosWhole Food Market6-1/2 x 5-7/8Cubre el transductor
ligando Pam3CSK4 del receptor tipo toll-like 2invitrogenTLRL-PMS

Referencias

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