Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Summary

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Abstract

En la investigación sobre la patogénesis de la pancreatitis postaguda diabetes mellitus (PPDM-A), la comunicación bidireccional anormal entre las células acinas pancreáticas (PAV) y las células de islotes es un foco clave. Sin embargo, las líneas celulares inmortalizadas no pueden replicar condiciones fisiopatológicas, por lo que la extracción de células primarias de alta calidad es crucial. Los métodos actuales para extraer islotes primarios de ratones se basan principalmente en la perfusión pancreática in vivo mediante canulación de conductos biliares, que tiene una alta barrera técnica y no favorece la operación por parte de investigadores sin experiencia.

Este estudio modificó el método, eliminando la necesidad de una perfusión compleja in vivo . Los ratones C57BL/6J de grado SPF (6-8 semanas) fueron anestesiados y eutanasiados, seguidos del aislamiento del páncreas. El páncreas fue digerido in vitro con colagénasa P; los islotes primarios se separaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll, y las células acinares se obtuvieron mediante filtración en tamiz celular y centrifugación. La viabilidad y función celular se evaluaron mediante tinción de calceína/yoduro propidio (Calceína/PI), ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa y detección de actividad amilasa.

Los resultados mostraron que el método modificado era fácil de manejar: el rendimiento por ratón era de (120 ± 5) islotes primarios y 1,6-1,95 × células acinares; Las tasas de viabilidad de los islotes y células acinares fueron (97,52 ± 0,16%) y (96,55 ± 0,95 %), respectivamente. Además, los islotes mostraban una capacidad normal de secreción de insulina y las células acinas eran sensibles a la estimulación de la ceruleina. Este método es sencillo y fiable, proporcionando un marco viable para estudiar las interacciones pancreáticas exocrino-endocrinas y la PPDM-A. Sin embargo, tiene limitaciones, como una aplicación no validada en ratas.

Introduction

La pancreatitis aguda (PA) puede alterar la función endocrina pancreática a través de múltiples vías, como la lesión parenquimatosa pancreática y cascadas inflamatorias, induciendo así la diabetes mellitus post-aguda (PPDM-A^)1,2. Actualmente, la patogénesis central de PPDM-A sigue siendo incierta, y la comunicación bidireccional anormal entre los compartimentos endocrino y exócrino pancreático es un foco clave^{de investigación 3}. Aunque las líneas celulares β inmortalizadas existentes (por ejemplo, INS-1, MIN6) son herramientas comúnmente utilizadas para modelos celulares diabéticos in vitro, su naturaleza derivada del tumor conduce a diferencias significativas respecto a las células primarias normales en cuanto a respuesta a la glucosa y heterogeneidad celular. Como resultado, no pueden replicar realmente el estado fisiopatológico bajo el microambiente de la pancreatitis^{aguda 4,5}. Por ello, obtener islotes primarios de alta calidad y células acinares se ha convertido en la base técnica central para esclarecer el mecanismo de su interacción.

Los métodos actuales para aislar islotes primarios de ratones se basan principalmente en la tecnología de canulación de conductos, que implica la localización y canulación precisas del conducto biliar para inyectar solución de colagenosa en el parénquima pancreático para una perfusión in^{vivo 6,7}. Sin embargo, para aislar islotes primarios de ratones neonatales, Huang et ^al.8 obtuvieron excelentes resultados utilizando la digestión in vitro sin perfusión pancreática in vivo. Según la experiencia práctica de nuestro equipo de investigación, realizar una perfusión pancreática óptima mediante la canulación de conductos biliares es un reto de realizar rápida y eficazmente sin formación especializada. Inspirados en el método para aislar islotes primarios de ratones neonatales, nuestro equipo modificó el protocolo de extracción para hacerlo más sencillo y accesible para investigadores sin experiencia en perfusión. Este enfoque modificado también ofrece una alternativa más sencilla para aislar islotes primarios de ratones jóvenes o de aquellos con conductos biliares delicados. Además, este método ofrece ventajas tanto en la eficiencia de aislamiento (cantidad) como en la pureza (calidad) de los islotes y células acinares. Permite a los investigadores realizar experimentos dentro del mismo contexto patológico y fisiológico, facilitando un análisis profundo del mecanismo de interacción entre los islotes y las células acinares.

El método requiere un control estricto del tiempo de digestión pancreática; Picar el páncreas antes de la digestión también es un paso crucial. Además, debe prestarse atención a la intensidad de la dispersión mecánica del tejido pancreático tras la digestión. Todos estos factores afectan a la cantidad y calidad de islotes aislados y células acinares. Este método no ha sido validado en ratas y no puede ampliarse para su producción en este momento.

Protocol

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité de Ética o el Comité de Ética del Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Changhai (Número de Aprobación: CHEC (A.E)-2025-026). Los ratones C57BL/6J de grado SPF (6-8 semanas, con un peso de 18-25 g, machos o hembras, n = 3) se mantuvieron en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad con libre acceso a comida (dieta de mantenimiento) y agua.

Los objetos punzantes de desecho, como jeringuillas y agujas, deben recogerse en los recipientes dedicados al laboratorio y ser eliminados por agencias profesionales cualificadas. De acuerdo con las Directrices para la Conducta Ética en el Cuidado y Uso de Animales No Humanos en la Investigación, los cadáveres de ratón deberán ser colocados en el congelador dedicado del laboratorio y incinerados por agencias profesionales.

1. Preparación de reactivos

NOTA: Soluciones como el medio de gradiente de densidad estéril deben recogerse en el "Tambor de Recogida de Residuos Químicos" del laboratorio. Todos los residuos químicos deben ser eliminados por agencias profesionales cualificadas según lo acorde el laboratorio.

1. Preparación de la solución de colagenasa P
   1. En un tubo centrífugo de 50 mL, se pesa secuencialmente 25 mg de colagnasa P, 42 mg de cloruro de calcio anhidro y 0,02 g de inhibidor de tripsina. Añade 45,5 mL de la Solución Salal Balanceada de Hank y 500 μL de solución HEPES, luego usa el vórtice hasta que se disuelva completamente. Esteriliza la solución mediante filtración a través de un filtro de 0,22 μm y transfiere la solución filtrada a un nuevo tubo centrifugador estéril de 50 mL. Esto produce una solución de colagenasa P de 0,5 mg/mL, que se utiliza para la digestión posterior del tejido pancreático.
2. Tratamiento de la solución de gradiente de densidad estéril
   1. Filtrar la solución del gradiente de densidad estéril a través de un filtro de 0,22 μm para su esterilización, luego transfiererla a un nuevo tubo centrifugador estéril de 50 mL. Etiqueta claramente la información de la solución y guárdala a 4 °C para usarla más adelante. A partir de entonces, se le denomina "Ficoll".
3. Preparación del buffer de parada y del medio completo
   1. Añadir suero bovino fetal al 10% (FBS) y solución al 1% de penicilina-estreptomicina al medio DMEM en blanco y al medio RPMI-1640, respectivamente, para preparar el medio completo DMEM y el medio completo RPMI-1640 (también el buffer de parada para la digestión pancreática). Etiqueta claramente la información de la solución y guárdala a 4 °C para su uso posterior.
4. Preparación de soluciones de glucosa con diferentes concentraciones
   1. En un tubo centrífuga de 50 mL, añade 50 mL de tampón de bicarbonato Krebs-Ringer HEPES (KRBH) y 0,25 g de albúmina sérica bovina (BSA)-V para preparar una solución de KRBH que contenga un 0,5% de BSA. Luego, en 28,33 mL de la solución de KRBH que contiene 0,5% de BSA, añadir 168 μL de glucosa (1 M) y 1,5 mL de solución de cloruro de calcio (50 mM) para preparar una solución de glucosa de 5,6 mM. En 9,28 mL de la solución de KRBH que contiene 0,5% de BSA, añade 220 μL de glucosa (1 M) y 500 μL de solución de cloruro de calcio (50 mM) para preparar una solución de glucosa de 22 mM.

2. Aislamiento de islotes pancreáticos y células acinas pancreáticas (PAC)

NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben someterse a esterilización por autoclave.

1. Añade la solución salina equilibrada de Hank y la solución de colagenasa P a la placa de 12 pozos. Y añadir 3 mL de solución de colagnasa P a un tubo centrífugo de 50 mL para la digestión posterior.
   NOTA: Añadir 2 mL de solución salina balanceada de Hank a tres pozos y 2 mL de solución de colagenasa P a un pozo.
2. Pesa y anestesia al ratón con una inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,025 mL/g antes de la cirugía, comprueba el estado anestésico pellizcando la almohadilla del ratón: la profundidad de la anestesia se determina por una disminución gradual de la frecuencia respiratoria y sin respuesta al pinzamiento de la almohadilla. Una vez confirmada la anestesia profunda, se eutanasia a los ratones mediante dislocación cervical. Sumerge los ratones en etanol al 75% durante 5 minutos para desinfectarlos y luego transfiere a un armario de bioseguridad para aislamiento pancreático.
   NOTA: El tribromoetanol (1,25%) se proporciona como solución prepreparada al comprar; No se requiere preparación manual. Los investigadores deben llevar guantes y mascarillas durante todo el experimento. Si hay contacto con la piel durante la inyección de tribromoetanol al 1,25%, limpia inmediatamente el reactivo residual con etanol anhidro, enjuágalo con agua corriente durante 5 minutos y aplica hidratante para aliviar la sequedad. No hay productos químicos corrosivos involucrados en este estudio. Los reactivos químicos de desecho, como el tribromoetanol al 1,25%, deben recogerse en recipientes sellados dedicados etiquetados como "Residuos Químicos Peligrosos".
3. Haz una incisión abdominal en forma de "V" para abrir la cavidad abdominal del ratón. El órgano linfoide rojo oscuro en la región hipocondríaca izquierda es el bazo, y el órgano blanco unido al bazo es el páncreas. Realizar cuidadosamente una disección roma del páncreas a lo largo del borde inferior del estómago y la unión pancreaticoduodenal.
4. Lava el tejido pancreático aislado con la Solución Sal Balanceada de Hank y elimina las adherencias mesentéricas residuales, el bazo y el tejido adiposo peripancreático.
5. Mueve el páncreas preprocesado a una placa de 12 pozos que contenga 2 mL de solución de colagnasa P. Sujeta el páncreas en su sitio con unas pinzas con la mano izquierda y utiliza una jeringuilla de 1 mL con la mano derecha para inyectar la solución de colagenasa P en el parénquima pancreático hasta que el tejido pancreático se muestre translúcido y edematoso.
   NOTA: El volumen de solución de colagenasa P para perfusión es de 600-800 μL.
6. Corta el páncreas en trozos de tejido de 1-2 mm³ rápidamente con tijeras quirúrgicas.
   NOTA: El tamaño de las piezas de tejido es aproximadamente igual al diámetro interior de la punta estándar de una pipeta de 200 μL.
7. Corta la punta distal de 1-1,5 cm de una pipeta de 1 mL (para agrandar la abertura) y utiliza esta punta modificada para transferir los fragmentos de tejido pancreático junto con 2 mL de solución de colagnosa P a un tubo centrífugo de 50 mL precargado con 3 mL de solución de colagenasa P.
8. Incuba el tubo de la centrífuga en un baño maria a 37 °C durante 12 minutos, agitando suavemente el tubo cada 5-6 minutos durante este periodo.
   NOTA: El propósito de agitar el tubo de la centrífuga es asegurar el contacto completo entre el tejido pancreático y la solución de colagnosa P.
9. Añade 10 mL de medio completo RPMI-1640 para terminar el efecto digestivo de la solución de colagenasa P.
10. Haz una pipete repetida con una pipeta Pasteur de 5 mL (15-20 movimientos de subida y bajada) hasta que no queden grumos grandes de tejido evidentes.
11. Añade 10 mL de medio completo RPMI-1640, luego centrifuga a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C y desecha el sobrenadante.
12. Resuspende el proyectil con 20 mL de medio completo RPMI-1640. Filtra la suspensión por un tamiz de 40 hejadas, luego centrifuga a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C.
13. Descarta el sobrenadante con cuidado, añade 20 mL de solución Ficoll para resuspender el perdigón y añade lentamente 15 mL de medio completo RPMI-1640.
    NOTA: En este punto, se puede observar una interfaz líquida clara.
14. Centrifuga suavemente a 640 × g durante 20 minutos a 25 °C.
    NOTA: Evitar sacudidas violentas durante la centrifugación para evitar interrupciones de la interfaz.
15. Retira cuidadosamente el tubo de la centrífuga y aspira la capa superior de medio rojo usando una pipeta Pasteur de 5 mL. Luego, aspira cuidadosamente el líquido que contiene los islotes en la interfaz de la capa líquida y transfiere a un nuevo tubo centrífugo de 50 mL. Añade 20 mL de medio completo RPMI-1640, centrifuga a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C y desecha el sobrenadante.
16. Suspende el perdigón con 20 mL de medio completo RPMI-1640, centrifuga a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C y desecha el sobrenadante.
17. Resuspende el pellet con 10 mL de medio completo RPMI-1640 y transfiere a una placa de cultivo celular de 60 mm.
18. Bajo un microscopio biológico invertido (aumento de 100 veces), selecciona manualmente los islotes usando una pipeta de 20 μL. Transfiere los islotes seleccionados a una placa de cultivo celular de 24 pozos precargada con 500 μL de medio completo RPMI-1640 por pozo.
19. Descartar la capa de solución de Ficoll, volver a suspender el pellet (del paso 2.15) con 10 mL de medio completo DMEM, filtrar a través de un colador de celdas de 100 μm, centrifugar a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
20. Resuspende el pellet con 10 mL de medio completo DMEM, centrifuga a 180 × g durante 2 minutos a 4 °C y desecha el sobrenadante. Luego, se resuspende el pellet con 5 mL de medio completo DMEM para experimentos posteriores.

3. Detección de viabilidad de islotes pancreáticos y células acinares

1. Transfiere los islotes aislados y un número adecuado de células acinares a placas de cultivo celular de 12 o 24 pozos que contengan 1 mL de medio completo RPMI-1640 y 1 mL de medio completo DMEM, respectivamente. Colocar las placas en una incubadora de celdas de CO₂ a 37 °C y 5% durante 15 minutos para que se equilibren.
2. Centrifugar las placas de cultivo celular de 12 y 24 pozos a 180 × g durante 30 s a 25 °C. Mientras tanto, prepare el reactivo de tinción siguiendo las instrucciones del kit de viabilidad y citotoxicidad celular de calceína/propidio yoduro (Calceína/PI) (protégelo de la luz durante la preparación).
3. Desecha suavemente el medio, lava los islotes y las células acinares una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y luego centrifuga bajo las mismas condiciones que el paso 3.2.
4. Desecha el PBS y vuelve a suspender los islotes y las células acinares con el reactivo de tinción preparado. Envuelva la placa de cultivo con papel de aluminio (para protegerla de la luz) e incuba en una incubadora de celdas de CO₂ a 37 °C y 5% durante 30 minutos.
5. En un entorno protegido por la luz, captura imágenes usando un microscopio de fluorescencia (aumento 100x) y realiza un análisis de viabilidad celular mediante ImageJ.

4. Ensayo de amilasa acinar

1. Siembra las células acinares en una placa de 12 pozos con una densidad de 1,5 × 10⁶ células por pozo con 1 mL de medio. Configurar las células de control (Ctrl) y estimuladas con cerúlea (10 nM, 20 nM, 50 nM; etiquetadas como C10, C20, C50). Tras 30 minutos de estimulación, recoge los sobrenadantes para detectar la actividad de la amilasa según las instrucciones del fabricante.

5. Ensayo de liberación de insulina estimulada por glucosa

1. Sembra 10 islotes por pozo en una placa de 24 pozos. Estabiliza los islotes en medio RPMI-1640 completo durante 2 horas y luego descarta el medio.
2. Incuba los islotes en 1 mL de solución de glucosa de 5,6 mM durante 1 hora. Recoge el sobrenadante después.
3. Lava los islotes con un buffer KRBH. A continuación, incuba los islotes en una solución de glucosa de 22 mM durante 1 hora y recoge el sobrenadante de nuevo.
4. Detectar las concentraciones de insulina en los dos sobrenadantes (de las condiciones de baja y alta glucosa) utilizando un kit ELISA Mouse INS (Insulina). Calcular el índice de insulina estimulada con glucosa (GSI):
   GSI = Concentración de insulina en medio con alta glucosa / Concentración de insulina en medio con baja glucosa

Results

Tras la centrifugación por gradiente de densidad de solución de Ficoll, se observaron islotes cerca de la interfaz entre la capa líquida transparente e incolora y el medio, con PACs presentes como sedimento en el fondo del tubo (Figura 1).

Bajo un microscopio óptico, los islotes eran típicamente redondos u ovalados y de color marrón dorado, con un rendimiento estable de (120 ± 5) islotes por ratón (Figura 2A,B). Los PACs recién aislados eran esféricos y principalmente distribuidos en racimos (3-8 células acinares por clúster). Los extremos apicales de las células acinares eran de color más oscuro, con gránulos de zimógeno claramente visibles; No se observaron gránulos ni estructuras vesiculares alrededor de las células, y el fondo de la solución era claro. El rendimiento de las células acinares osciló entre 1,6 y 1,95 × 10⁷ células por ratón [(1,77 × 10⁷) ± (1,75 × 10⁶)] (Figura 2C,D).

Los resultados de la tinción de calceína/PI de islotes y células acinares se muestran en la Figura 3A: las células teñidas con calceína (verde) representaban la mayoría, mientras que las células tintidas por PI (rojas) eran raras. Se realizó un análisis cuantitativo de las imágenes de tinción viva/muerta utilizando ImageJ. Los resultados mostraron que las tasas de viabilidad de los islotes aislados y las células acinares fueron (97,52 ± 0,16) % y (96,55 ± 0,95 %), respectivamente (Figura 3B).

La actividad basal amilasa de las células acinares pancreáticas aisladas fue de (0,79 ± 0,01) U/mL. Tras la estimulación con caeruleína a concentraciones de 10 nM, 20 nM y 50 nM, las actividades amilasas de las células acinares fueron (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL y (1,39 ± 0,02) U/mL, respectivamente. Los resultados unidireccionales de ANOVA indicaron que, en comparación con el grupo control (Ctrl), todos los grupos estimulados con ceruleína mostraron diferencias significativas en la actividad de la amilasa (todos los P < 0,001). Además, se observó una diferencia significativa en la actividad de la amilasa entre los grupos de ceruleína de 20 nM y 10 nM (P < 0,001) (Figura 4A).

Cuando se estimulaba con una solución de glucosa de 5,6 mM, la secreción de insulina de los islotes aislados era de (0,27 ± 0,04) ng/mL/islote/h. Cuando se estimuló con una solución de glucosa de 22 mM, la secreción de insulina de los islotes aislados fue (0,94 ± 0,04) ng/mL/islote/h, con un GSI de 3,44. Los resultados indican que los islotes aislados presentan una respuesta típica y eficaz a la secreción de insulina bajo estimulación con soluciones de glucosa de diferentes concentraciones (Figura 4B).

Los miembros de nuestro equipo de investigación observaron que la cantidad y calidad de islotes aislados y células acinares están estrechamente relacionadas con el tiempo de digestión, que requiere un control estricto durante la operación y se ve menos afectado por diferentes operadores. Mientras tanto, las fluctuaciones en el rendimiento y la viabilidad también están estrechamente relacionadas con la disección completa del páncreas y la separación mecánica del tejido pancreático, que requiere atención durante la operación.

Figura 1: Resultados de la centrifugación con gradiente de densidad de disolución de Ficoll. La capa de islote se encuentra en la interfaz entre la capa líquida transparente y incolora y el medio de cultivo. El precipitado en la parte inferior del tubo de la centrífuga son PAC. Abreviatura: PAC: células acinas pancreáticas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Características morfológicas y cuantitativas de islotes y PACs. (A) Morfología de islotes aislados de tejido pancreático de ratón. Barra de escala = 100 μm. (B) Análisis cuantitativo del número de islotes aislados del tejido pancreático de ratón (n = 3). (C) Morfología de los PAC aislados del tejido pancreático del ratón. Barra de escala = 100 μm. (D) Análisis cuantitativo del número de PACs aislados del tejido pancreático del ratón (n = 3). Todos los datos se expresaron como media ± SD. Abreviatura: PAC: células acinas pancreáticas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Evaluación de la viabilidad de islotes y PACs. (A) Tinción de fluorescencia de yoduro de calceína/propidio para evaluar la viabilidad de islotes y PACs de ratón. Verde: células vivas. Rojo: células muertas. Barra de escala = 100 μm. (B) Análisis cuantitativo de la viabilidad de islotes y PACs (n = 3). Todos los datos se expresaron como media ± SD. Abreviaturas: PACs: células acinares pancreáticas; PI = yoduro de propidio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Evaluación de la actividad amilasa de los PACs y capacidad de secreción de insulina en los islotes. (A) Actividad amilasa de los PACs bajo estimulación con diferentes concentraciones de ceruleína (Ctrl: Grupo control; C10, C20 y C50: Las concentraciones de ceruleina fueron 10 nM, 20 nM y 50 nM (n = 3). (B) Análisis cuantitativo de las concentraciones de secreción de insulina estimulada por glucosa (n = 3). Todos los datos se expresaron como media ± SD. ***P < 0,001. Abreviaturas: GSI = índice de insulina estimulada por glucosa; PAC: células acinas pancreáticas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

En los últimos años, la diabetes mellitus post-pancreatitis (PPDM) ha recibido una amplia atención^{1, 9, 10}. Investigar los mecanismos moleculares por los cuales los PACs afectan la secreción de hormona de islotes en el contexto de la AP es de gran importancia.

La patogénesis de la AP está principalmente asociada con la activación excesiva de enzimas pancreáticas en las células acinares, lo que conduce a la autodigestión del tejido pancreático^11,12. Aunque actualmente existen líneas celulares como AR42J, 266-6 (líneas celulares acinares) y MIN6, INS-1 (líneas celulares β), estos modelos celulares in vitro no pueden replicar completamente la complejidad fisiológica de las células acinares primarias y los^{islotes 4,5}. Por ello, aislar las células acinares primarias y los islotes es crucial para estudios en profundidad sobre la interacción entre los compartimentos exocrino y endocrino del páncreas. Actualmente, los métodos para aislar islotes están bien establecidos; Sin embargo, la mayoría no satisface las necesidades de investigación para estudiar la interacción entre islotes y células acinas^{pancreáticas 6,7,8}.

Este protocolo experimental optimiza el procedimiento de perfusión pancreática, reduciendo la barrera técnica y permitiendo así a investigadores sin formación especializada en canulación de conductos biliares realizar experimentos. Mientras tanto, garantiza la cantidad y calidad de islotes aislados y células acinares, proporcionando un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios de ratón y células acinares pancreáticas primarias.

Aunque este método simplifica el proceso de aislamiento de islotes, los pasos clave siguen requiriendo un control estricto para garantizar altos rendimientos y una separación efectiva de los islotes y las células acinas pancreáticas. Estos pasos incluyen una perfusión pancreática adecuada, una alteración tejidurenta adecuada (asegurando un corte completo de la piquería), digestión pancreática (control preciso del tiempo de digestión y agitación manual durante la digestión) y pipeteo mecánico (control del número e intensidad de los movimientos de pipeteo). Antes de la selección de islotes, los islotes resuspendidos deben estabilizarse en una incubadora de células durante aproximadamente 10 minutos para facilitar una recogida más eficiente.

Es importante señalar que durante la perfusión pancreática se obtienen mejores resultados cuando se inyectan vesículas de líquido más claras; Todo el tejido pancreático debe estar completamente perfundido, pero el tiempo de perfusión debe controlarse en 1-2 minutos. Si se detecta baja viabilidad celular, ajusta el tiempo de contacto entre el tejido pancreático y la colagnosa P (incluyendo el tiempo de perfusión y el tiempo de digestión en baño marea). Además, presta atención al daño mecánico durante el aislamiento, por ejemplo, evita la fuerza excesiva al dispersar tejido pancreático. La técnica aséptica debe mantenerse durante el aislamiento de islotes y células acinares para evitar la contaminación. Los reactivos preparados deben filtrarse a través de un filtro de 0,22 μm. El proceso de aislamiento debe realizarse en un armario de bioseguridad, y todos los instrumentos y consumibles utilizados durante el aislamiento deben ser estériles. Los dos medios completos preparados también contienen una solución de penicilina-estreptomicina al 1%.

Para la anestesia del ratón: fija la piel del cuello del ratón con el pulgar y el índice izquierdos, y sostiene su abdomen con el anular y el meñique (manteniendo una postura de cabeza abajo y abdomen hacia arriba para exponer la cavidad abdominal). Sujeta la jeringuilla con la mano derecha, insértala en un ángulo de 30° en la piel de la parte inferior izquierda del abdomen del ratón (a 1 cm de la ingle y 0,5 cm de la línea media), inyecta el anestésico lentamente y presiona el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril durante 10 segundos tras la extracción de la aguja para evitar fugas de fármaco. Solo se sacrifica al ratón por dislocación cervical una vez que esté completamente anestesiado.

Si te pincha con una aguja contaminada (expuesta a sangre o tejido de ratón) o es mordida por un ratón, aprieta inmediatamente la zona alrededor de la herida en el lavabo más cercano (aprieta desde el extremo proximal hasta distal de la herida para expulsar una pequeña cantidad de sangre), enjuaga la herida continuamente con agua corriente durante 15 minutos y luego desinfectala con etanol al 75% o 0,5% povidona-yodo.

Los resultados de los ensayos de actividad de amilasa de células acinares mostraron que las células acinares pancreáticas aisladas tenían un bajo nivel de activación basal y eran sensibles a la estimulación de ceruleina: la actividad de amilasa aumentó gradualmente con el aumento de la concentración de ceruleina, alcanzó el nivel más alto a 20 nM de ceruleína y disminuyó ligeramente cuando la concentración de ceruleína era de 50 nM. Los resultados del ensayo de secreción de insulina estimulada con glucosa mostraron que los islotes aislados mostraron una respuesta típica y eficaz a la secreción de insulina bajo estimulación con soluciones de glucosa de diferentes concentraciones. Estos resultados indican que las células acinares e islotes extraídos por este protocolo son adecuados para experimentos in vitro posteriores.

El procedimiento de aislamiento de islotes y células acinares de este protocolo experimental es fácil de operar. Los resultados experimentales muestran que los islotes y células acinares aisladas mediante este protocolo muestran una excelente cantidad y viabilidad. Además, varios miembros de nuestro equipo han validado este protocolo usando varios ratones; Los resultados de la validación indican que tiene buena reproducibilidad, datos fiables y fluctuaciones mínimas en el rendimiento celular. Sin embargo, este protocolo también tiene ciertas limitaciones. Aunque depende poco de las habilidades técnicas del operador, sigue requiriendo que el operador tenga conocimientos básicos de anatomía del ratón para diseccionar completamente el páncreas del ratón; esto es un requisito previo para todo el proceso de aislamiento. Si se aíslan tejidos pancreáticos de varios ratones simultáneamente, la cantidad de solución de colagnasa P y otros reactivos debe ajustarse en consecuencia. Además, no se recomienda el aislamiento simultáneo de más de dos ratones: la diferencia de tiempo entre el procesamiento de tejidos pancreáticos de diferentes ratones durante la disección, perfusión y picada afectará el tiempo de contacto entre el tejido pancreático y la colagnasa P, perjudicando así la eficiencia y viabilidad del aislamiento celular. Por tanto, su aplicación a gran escala puede ser limitada. Además, este protocolo no ha sido validado en ratas. Si se aísla islotes y células acinares de ratas, la dosis de algunos reactivos y el tiempo de digestión pueden necesitar ajustes adicionales.

En conclusión, este protocolo experimental proporciona un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios de ratón y células acinas pancreáticas primarias. Es más adecuado para investigadores inexpertos para realizar aislamiento de islotes y células acinares, al tiempo que ofrece un marco experimental práctico para estudios in vitro sobre interacciones exócrino-endocrinas pancreáticas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 & mu; Filtro m	Millex	SLGPR33RB	Filtra la solución de P de colagénasa preparada
0,25 M cloruro de calcio (Estéril)	Beyotime	ST365	Vía de señalización dependiente del calcio para activar la secreción de insulina
Jeringuilla de 1 ml	Jierui	10084692516405	Se utiliza para la perfusión de colagenasa P en tejido pancreático.
Solución de tribromoetanol al 1,25%	Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.	JT0781	Anestesia
Tubo centrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	30121589	Recoge el sobrenadante de la celda para centrifugarlo y almacenarlo.
1x Hank' Solución salina balanceada s	Biosharp	BL561A	Prepara la solución de colagenasa P y enjuaga el tejido pancreático
Placa de cultivo celular de 12 pozos	SARSTEDT	83.3921	Conserva el tejido pancreático y la acinar extraída del cultivo
Tubo centrífuga de 15 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A	Mantener soluciones durante el experimento
Placa de cultivo celular de 24 pozos	SARSTEDT	83.3922	Cultivo de los islotes extraídos
40-malla y nbsp; Tamiz	Instrumentos Weidan	N/A	Filtrar tejido pancreático
Pipeta Pasteur de 5 mL	Biosharp	BS-XG-03L	Pipetar líquidos y alterar físicamente el tejido pancreático
Tubo centrífugo de 50 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A	Mantener las soluciones durante el experimento, contener tejidos y centrifugar
Platos de cultivo celular de 60 mm	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	12211	Contenedor para contener medios de cultivo que contienen islotes para facilitar la recogida
Solución de etanol al 75%	HYNAUT	N/A	Remojad los ratones para desinfectarlos.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	N/A	Genera imágenes.
Centrífuga Beckman Allegra X-12/X-12R	BECKMAN	Allegra X-12/X-12R	Centrifugadora
Albúmina sérica bovina (BSA)-V	Solarbio	A8020	Mantén la función fisiológica normal de los islotes y usa (it/this) para preparar soluciones de glucosa de diferentes concentraciones.
ratones C57BL/6J, grado SPF, 6 y guiño; 8 semanas, peso 18 y ndash; 25 g	Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica Naval
Kit de ensayo de viabilidad y citotoxicidad de células de calceína/PI	Beyotime	C2015L	Detectar la viabilidad celular y la citotoxicidad de las células animales basándose en la tinción de doble fluorescencia de Calcein-AM (Calcein AM) y yoduro de propidio (PI) de células viables y muertas simultáneamente.
Cloruro de calcio (anhidro)	Sangon Biotech	10043-52-4	Prepara la solución de colagenasa P
Colador celular (100 y mu; m)	Biosharp	BS-100-XBS	Filtrado de células acinares
Colagenasa P	Sigma	11213857001	Tejido pancreático digestivo
Solución de D-(+)-glucosa (20%, Estéril)	Beyotime	ST491	Estimula la secreción de insulina de los islotes.
DMEM básico (1x) (Dulbecco' s Eagle Medium modificado)	Gibco	C11995500BT	Cultivo de células acinares
Suero fetal bovino (FBS)	Biowest	S140B-500	Prepara el medio de cultivo
Solución estéril PREMIUM de Ficoll-Paque	Cytiva	17544203	Medio del gradiente de densidad para la estratificación del gradiente de densidad
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	N/A	Generar imágenes y realizar análisis estadísticos.
Solución HEPES (1 M)	Biosharp	BL1061A	Prepara la solución de colagenasa P
Centrífuga de alta velocidad/refrigerada	Sigma	3K15	Centrifugadora
ImageJ	Laboratorio de Instrumentación Óptica y Computacional (LOCI) de los Institutos Nacionales de Salud	N/A	Analizar imágenes de fluorescencia celular y calcular la viabilidad celular.
Microscopio biológico invertido	Leica	N/A	Observa la morfología celular y selecciona los islotes.
Microscopio de fluorescencia invertida	OLYMPUS	IX73	Observa las señales celulares fluorescentes y captura imágenes fluorescentes.
Amortiguador de bicarbonato Krebs-Ringer HEPES	LEAGENE	CZ0103	Mantén la función fisiológica normal de los islotes y usa (it/this) para preparar soluciones de glucosa de diferentes concentraciones.
Kit ELISA INS (Insulina) del ratón	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	EM0260	Detecta el nivel de secreción de insulina en los islotes.
Pinzas oftálmicas (10 cm, curvadas con gancho)	Dispositivos Médicos Qingyi	N/A	Asistir en la disección
Pinzas oftalmológicas (10 cm, rectas con diente)	Dispositivos Médicos Qingyi	N/A	Ayudar en la disección y separación repentina del tejido pancreático y en la extracción del tejido pancreático
Solución de estreptomicina de penicilina	Gibco	15140-122	Prepara el medio de cultivo para evitar la contaminación
RPMI-1640 mediano,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	Termina la solución digestiva de la colagenasa P. y cultiva los islotes
Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja)	Sigma	T6522	Prepara la solución de colagenasa P
Tijeras quirúrgicas (10 cm, punta recta)	Dispositivos Médicos Qingyi	N/A	Asistencia en anatomía y corte del tejido pancreático en pequeños trozos
Baños de agua	OAICLAB	AY-HF	Mantén la temperatura de digestión.
Kit de ensayo de actividad de α-amilasa y β-amilasa	Elabscience	E-BC-K006-M	Detectar los niveles de amilasa secretada por las células acinares bajo diferentes condiciones