Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Summary

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Abstract

La observación directa es un método fundamental para el descubrimiento y la comprensión científica. La imagen de fluorescencia de molécula única en lapso de tiempo permite observar proteínas individuales mientras se mueven e interactúan con su entorno, haciendo visibles estados que normalmente estarían ocultos en las mediciones de conjunto. El seguimiento de una sola proteína es especialmente adecuado para estudiar proteínas de membrana, donde su naturaleza bidimensional permite una imagen rápida y de campo amplio con sensibilidad a un solo fluoróforo. El uso de bicapas lipídicas artificiales que imitan membranas donde se encuentran proteínas transmembrana o de membrana periférica (como membranas plasmáticas o membranas de orgánulos intracelulares de varios tipos celulares) permite medir interacciones específicas en entornos cercanos a los nativos. También permite la adición gradual de complejidad, un componente a la vez, mientras suprime la interferencia de fondo por fluorescencia y dispersión Raman. Añadiendo control de temperatura, también es posible determinar las propiedades termodinámicas de las interacciones de partícula única. En este trabajo, describimos un protocolo para la preparación de muestras, la recogida de datos, el seguimiento de fluorescencia de molécula única y el análisis de trayectorias de proteínas de membrana en bicapas lipídicas utilizando Aquaporina-4. Este trabajo sirve como ejemplo fundamental y puede adaptarse a diferentes proteínas y composiciones de bicapas.

Introduction

En condiciones biológicas naturales, las proteínas de membrana están rodeadas por una extensa red de interacciones, que incluye otras proteínas de membrana, proteínas en los fluidos intracelulares y extracelulares, diversos tipos de lípidos y colesterol, sustratos o ligandos, interacciones en solución e interacciones entre matrices extracelulares e intracelulares. Un enfoque biofísico clásico para comprender mejor las interacciones específicas y colectivas comienza con un solo componente, introduciendo gradualmente componentes adicionales uno a uno hasta que la complejidad refleje el entorno nativo: un enfoque de "divide y vencerás" en biofísica. Un método moderno a escala molecular para estudiar estas interacciones es mediante observación directa mediante imágenes de fluorescencia de una sola molécula en time-lapse para rastrear proteínas individuales mientras se mueven e interactúan con su entorno. En este artículo, describimos los pasos fundamentales de este enfoque, incluyendo la formación de bicapas lipídicas en cubiertas de cuarzo y la inserción de una gran proteína membrana en estas bicapas prefabricadas de manera adecuada para la imagen de una sola proteína. A esto le seguirá un protocolo 'de trabajo' para rastrear proteínas individuales en bicapas soportadas.

Este artículo describe cómo crear bicapas lipídicas con soporte sólido utilizando pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) que se rompen en cubiertas de cuarzo hidrofílico. Las superficies de cuarzo se preparan mediante un lavado ácido o una limpieza con ozono ultravioleta (UV). Los lípidos utilizados para crear los SUV deberían, cuando sea posible, coincidir con la composición química principal de la membrana biológica de interés (por ejemplo, la aquaporina-4 (AQP4)) se encuentra en la membrana plasmática de los astrocitos y los componentes principales son POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), colesterol (30%), PI (2,5%) y SM (5,6%)^1,2). Para evitar la interacción con el sustrato sólido, aditivos como el polietilenglicol (PEG) injertado a un lípido levantan la bicapa de la^{superficie 3,4}. La cantidad de cada aditivo debe ajustarse cuidadosamente para asegurar que la difusión de proteínas no se obstruya, al tiempo que se proporciona suficiente soporte para levantar la membrana desde la superficie del sustrato. Los aditivos como los lípidos PEGilados suelen presentar dos fases: una 'fase de cepillo' y una 'fase de hongo'. La fase de cepillo ocurre cuando el PEG está en alta concentración, haciendo que el polímero se mantenga erguido para reducir la dificultad estérica. La fase hongo ocurre en concentraciones bajas, cuando los polímeros están suficientemente separados para existir como bobinas aleatorias. En general, la fase de cepillo dificulta la difusión, pero la fase de seta ofrece poco soporte. La concentración entre las fases de cepillo y setas es óptima, proporcionando soporte con un impacto mínimo en la difusión ^3,4.

Algunas proteínas de membrana se insertan espontáneamente en membranas lipídicas soportadas por sólidos, como las P450 y la citocromo P450^{reductasa 5}, mientras que otras deben insertarse con detergentes, lo cual es un proceso delicado. Es necesario lavar cuidadosamente estos detergentes, así como cualquier proteína no incorporada que pueda interferir con el seguimiento de una sola proteína, un proceso que se describirá en detalle. El enfoque principal de este artículo es la preparación de una muestra para el seguimiento de molécula única (SMT) utilizando imágenes de fluorescencia en lapso de tiempo. Esto requiere un objetivo con alta ampliación y apertura numérica (NA) — normalmente un objetivo de inmersión en aceite de 100x y 1,45 NA ^6,7. También requiere una cámara rápida y altamente sensible (cámara EMCCD, CMOS o ICCD) y excitación láser. La excitación láser debe cubrir un campo de visión lo suficientemente grande para medir trayectorias largas de proteínas, lo que a menudo se logra mediante reflexión interna total para crear un campo evanescente de unos 50 μm x 100 μm o epiiluminación con óptica de modelado de haz (gaussiana a top-hat) de unos 80 μm x 80^μm 8, o una lámina óptica altamente inclinada y laminada (HILO) con un campo similar al TIRF. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) tiene la ventaja de reducir la señal de fondo. A continuación se presenta un diseño sencillo y relativamente económico de microscopio TIRF. Añadiendo controles de temperatura, es posible medir varias propiedades termodinámicas como la entalpía, la entropía y la energía libre de^{Gibbs 9}. La técnica también requiere el marcaje por fluorescencia de la proteína de membrana en un grado de marcado que garantiza que la mayoría de las proteínas de membrana lleven una etiqueta fluorescente.

La proteína transmembrana de interés en este artículo es AQP4. AQP4 es un canal de agua polarizado en los extremos de los astrocitos y otras áreas de la vasculatura del sistema nervioso^{central 10}. Puede transportar hasta 3.000 millones de moléculas de agua por segundo y está implicada en la homeostasis del agua, la migración celular, el edema cerebral, el aprendizaje y la formación de la memoria mediante plasticidad^{sináptica 11}. La desregulación de la función de AQP4 se ha relacionado con diversas condiciones neurológicas, incluyendo edema cerebral, neuromielitis óptica y epilepsia 12,13,14,15. AQP4 es una proteína de 32-37 kD, dependiendo de su isoforma, y tiene una estructura cuaternaria tetramérica con ocho dominios de membrana hidrofóbicos conectados por bucles de unión, un dominio intracelular N-terminal y un gran dominio intracelular^{C-terminal 16}. Existen dos isoformas principales de AQP4, M1 y M23; La diferencia surge de la iniciación en el residuo de metionina 1 o en el residuo de metionina 23. Las investigaciones han demostrado que la isoforma M1 puede formar díadas o tríadas consigo misma, dependiendo de su estado de^{palmitoilación 9}. La isoforma M23 se ensambla en grandes agregados proteicos conocidos como Arrays Ortogonales de Partículas (OAPs). Cuando se coexpresa, la isoforma M1 limita el crecimiento de la OAP formando un recubrimiento proteico periférico alrededor de su^exterior 17,18,19. La dinámica de la agregación de la CAO puede ser un factor clave para modular la permeabilidad al agua y la homeostasis en el cerebro. En este artículo, describimos los pasos necesarios para rastrear AQP4 individuales en una membrana y observar interacciones individua-proteína.

Protocol

1. Preparación de pequeñas vesículas unilamelares

1. Saca las soluciones de caldo lipídico del congelador y déjalas alcanzar la temperatura ambiente.
2. Saca un frasco limpio de 10 mL del horno y déjalo enfriar a temperatura ambiente.
3. Añade 900 μL de cloroformo de grado espectroscópico y 100 μL de metanol de grado espectroscópico al matraz frío de fondo redondo, y luego añade las cantidades adecuadas de cada lípido de la mezcla. Haz girar el frasco para asegurarte de que los lípidos estén bien mezclados.
   NOTA: Otros autores utilizan diferentes proporciones de cloroformo:metanol, pero hemos encontrado que la mejor proporción para formar pasteles lipídicos uniformes fue de 9:1.
   En el Archivo Suplementario 1 se proporciona una hoja de cálculo para calcular las cantidades correctas de lípidos. Si preparas lípidos para verificar la formación de bicapas lipídicas en la superficie del sustrato, utiliza un lípido marcado con fluorescencia.
4. Coloque un conector de destilación al vacío sobre el matraz de fondo redondo, como se muestra en la Figura 1, y conéctalo a la línea de nitrógeno (aparato de secado).
   NOTA: Utiliza N₂(g) purificado y pásalo por un filtro de 0,22 μm antes de conectarlo al secado.
5. Enciende el N₂(g) y ajusta la presión para que el flujo sea tal que apenas se note en el dorso de la mano.
   NOTA: Mojar el dorso de la mano puede ayudar a detectar la evaporación.
6. Dejar que la muestra se seque bajo un flujo de N₂(g) durante 2,5-3 horas, comprobando periódicamente que el nitrógeno continúe fluyendo. Es probable que la muestra parezca seca en la primera media hora; Sin embargo, continúa fluyendo nitrógeno durante 2-2,5 horas adicionales para eliminar cualquier disolvente restante.
   NOTA: La muestra también puede secarse durante la noche.
7. Añade 1 mL de tampón por cada 5,0 μmol de lípidos totales en el matraz de fondo redondo.
   NOTA: El tampón utilizado en este estudio consistía en 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} y 140 mM NaCl; Este es el mismo tampón utilizado durante toda la preparación de la muestra.
8. Coloca un tapón de cristal en el frasco y envuélvelo con película de parafina.
9. Coloca el matraz en una pinza de un soporte de anillos y sumerge la parte inferior del matraz en un baño de un sonicador ajustado a 60 °C. Dejar que el matraz incube durante 1 hora, girando suavemente cada 15 minutos para crear liposomas multilamelares, que aparecen como una solución opaca sin lípidos adheridos al matraz.
10. Tras la incubación de 1 hora, enciende el sonicador (~35 kHz) y ajusta la amplitud a su máxima temperatura. Luego, mueve el matraz dentro del baño para encontrar la posición donde se produce la mayor agitación, de modo que la solución choque y rocie dentro del matraz. Sonicate durante 30 minutos, buscando un cambio de opaco a transparente y ligeramente opalescente.
11. Retira la solución lipídica del matraz y colócala en un tubo de microcentrífuga, luego centrifuga a 100.000 × g durante 1 hora a 4 °C. Retira el sobrenadante del tubo de la microcentrífuga.
    NOTA: Puede formarse un pequeño pellet en la parte inferior del tubo. Si la bolitas es grande, deséchala y repite el proceso.
12. Usa los SUV después de centrifugar, guárdalos a 4 °C durante una semana o mantenlos a -80 °C con algo de trehalosa.
    NOTA: La cantidad recomendada de trehalosa es de 1 mg por mL de solución lipídica. Para obtener resultados óptimos, se pueden fabricar nuevos SUV semanalmente y almacenarlos en la nevera.
    NOTA: Este es solo un método para preparar los SUVs. Además de los SUV, se pueden producir vesículas unilamelares pequeñas, medianas y grandes utilizando extrusión o liposomas unilamelares gigantes mediante electroformación^{20, 21, 22 y 23}.

2. Marcado de proteínas

NOTA: El marcaje de proteínas con sondas fluorescentes utilizando varios conjugados, como ésteres y maleimidas del NHS, está bien documentado y bien comprendido. Sin embargo, el grado de marcado (DOL) es especialmente importante en el seguimiento de una sola proteína. En este estudio, fue esencial determinar qué porcentaje de proteínas transmembrana estaban marcadas y la distribución de fluoróforos en cada tetramero AQP4.

1. Colocar un tubo de diálisis en un vaso que contiene 0,1 M de tampón de fosfato a pH 8,3 que ha pasado por un filtro de 0,22 μm. Luego, déjalo reposar en el buffer toda la noche en posición invertida, permitiendo que la membrana se acondicione.
2. Al día siguiente, sustituye el tampón dentro del tubo de diálisis por la solución proteica.
   NOTA: El volumen de solución proteica debe estar dentro de 20-250 μL. Debe haber ~1-5 mg de proteína disuelta en la solución.
3. Una vez que la proteína se coloca en el tubo de diálisis, déjala reposar invertida durante la noche en el tampón de fosfato de 0,1 M.
4. Tras la diálisis, transfiere la proteína a un tubo de microcentrífuga.
5. Prepara un nuevo tubo de diálisis repitiendo el paso 2.1.
6. Prepara el tinte NHS colocando unos granos (3-4) sobre un pequeño trozo de papel de pesaje, luego transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y disuelve en 100 μL de DSMO. A continuación, se aplican dos diluciones de 1 mL de 10 veces en DMSO, utilizando la dilución final para determinar las concentraciones de cada muestra mediante espectroscopía UV-vis. Para lograr un DOL medio de 2-3, añade un exceso de colorante reactivo de tres molares a la solución proteica mientras agitas suavemente.
   NOTA: Un espectrómetro UV-vis estándar será suficiente para este propósito, aunque un espectrómetro de pequeño volumen es ventajoso debido al tamaño de la muestra.
7. Añade el tinte reactivo al tubo de la microcentrífuga que contiene la proteína en volúmenes iguales. Una vez añadido el tinte reactivo y la proteína, nuta durante un mínimo de 8 horas.
8. Tras la nutación, transfiere la proteína marcada al tubo de diálisis preparado en el paso 2.5 y colócala en un vaso que contenga un tampón de fosfato fresco. Coloca una barra agitadora en el buffer y déjala girar suavemente durante 6 horas, seguida de un cambio de buffer y otras 6 horas de diálisis.
9. Tras los dos intercambios de tampón, coloca el tubo de diálisis que contiene la proteína marcada en un vaso limpio que contiene el tampón final en funcionamiento.
   NOTA: El último tampón de trabajo utilizado en este estudio consistió en 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} y 140 mM NaCl a pH 7,4.
10. Tras la diálisis, mide el DOL usando un espectrómetro UV-vis.
    NOTA: Es importante seguir métodos estándar para medir el DOL. A continuación se muestra una ecuación para el cálculo.
    (1)
    Donde la absorbancia medida en el pico del colorante es y el pico proteico en 280 nm es . El coeficiente de extinción de la proteína es (calculado a partir del peso molecular de la proteína), mientras que y son proporcionados por el fabricante del colorante.

3. Preparación de cubiertas de cuarzo de 25 mm de diámetro

NOTA: A continuación se presentan dos métodos diferentes:

1. Lavado ácido
   NOTA: Existen varios procedimientos publicados de lavado ácido, incluyendo pirañas y grabado en bases. Hemos comprobado que el procedimiento a continuación proporciona una superficie extremadamente limpia e hidrofílica sin grabado, lo cual es preferible para estudios de molécula única mediante imagen de fluorescencia.
   1. El método de lavado ácido requiere una campana extractora mientras calienta la solución y EPI (gafas, bata de laboratorio, guantes). Debe haber un bote de bicarbonato sódico disponible en el capó por si hay derrames.
   2. Colocar las cubiertas en un vaso de precipitados y llenar con agua nanopura, 30% de peróxido de hidrógeno y ácido nítrico concentrado en partes iguales en volumen (solución 1:1:1).
   3. Calienta los cubos en esta solución durante 30 minutos hasta que la solución empiece a burbujear.
   4. Comprueba la solución y mezcla girando suavemente cada 10 minutos para evitar que las cubiertas se peguen entre sí. Al girar la solución, observa cómo los deslizamientos se separan y luego se separan. Una vez separados, ve reduciendo la velocidad poco a poco para mantenerlos separados, permitiendo que la solución burbujeante enrole los deslizantes.
      NOTA: La solución no debe calentarse con demasiada intensidad, ya que la reacción produce calor. Ajusta la placa calefacta a un burbujeo suave, normalmente en la configuración más baja. Con estos ajustes, la solución se mantiene a ~70 °C. También se recomienda peróxido de hidrógeno fresco.
   5. Cuando hayan pasado 30 minutos o la solución deje de burbujear, deja que la solución 1:1:1 se enfríe a temperatura ambiente, luego enjuaga bien las cubiertas con agua purificada usando un suave giro.
2. Ozono UV
   1. Limpia las cubiertas de cuarzo con n-hexano y luego metanol, usando pañuelos de lente.
   2. Coloca las cubiertas en un limpiador UV de ozono con la superficie a tratar orientada hacia la lámpara.
   3. Fluye osígeno en la cámara a 5 psi durante 5 minutos; Luego, apaga el flujo de oxígeno.
   4. Después, enciende las luces UV durante 15 minutos y deja reposar las fundas un mínimo de 10 minutos para que el ozono escape.
   5. Después de usar cualquiera de los dos métodos de limpieza, asegúrate de usar inmediatamente las cubiertas limpias. Si usas engobe previamente limpiado, repite el proceso para regenerar la superficie.
      NOTA: La ozonización UV requiere una circulación constante para eliminar el ozono del aire. El sistema debe colocarse bajo un snorkel para manipulación de aire o en una campana extractora.

4. Formación de bicapas e incorporación de AQP4 en una membrana de dos capas

NOTA: El tampón utilizado en este estudio consistía en 100 mM de HEPES, 5 mM de_{CaCl 2} y 140 mM de NaCl a pH 7,4.

1. Coloca la cubierta recién limpia en un portamuestras de 25 mm usando un tubo de objetivo SM1 de 1/4 de pulgada. Después, corta una junta de doble capa de parafilm de 8 mm de diámetro y colócala en el centro del portamuestras (véase la Figura 3).
2. Aplica una gota de 50 μL del SUV en el centro de la junta de 8 mm, sella y luego incuba a 37 °C durante 1 hora.
   NOTA: Esto permite que los liposomas se fusionen con la superficie hidrofílica de cuarzo y se rompan, formando una doble capa continua.
   Lo más probable es que la cantidad de liposomas añadidos a la zona de la junta pueda variar, y una junta mayor pueda requerir más liposomas para formar una doble capa continua. Sin embargo, las cantidades especificadas en el paso 4.2 casi siempre promueven la formación de una bicapa continua.
3. Tras la incubación, enjuaga la muestra con una pipeta para eliminar la solución. Luego, añade 50 μL de tampón fresco a la bicapa. Luego, repite el proceso un total de 10 veces.
   NOTA: Es crucial que la punta de la pipeta no toque la bicapa lipídica y que quede algo de solución para mantener la bicapa hidratada. Al llevar la punta a la parte superior de la gota, verás que hace contacto. Puedes eliminar la solución sin dañar la bicapa manteniendo un contacto mínimo con la superficie de la gota. Eventualmente, la gota se invierte y se desvía hacia la junta; Este es el momento ideal para dejar de eliminar la solución. La luz reflejada debería cambiar en ese punto y puede servir como señal para detenerse. Si te preocupa eliminar demasiada solución, baja la configuración de la pipeta durante el lavado para dejar una cantidad cómoda de amortiguador por encima de la bicapa lipídica.
   La integridad de la formación de bicapas lipídicas bajo estas condiciones puede evaluarse de antemano utilizando la recuperación por fluorescencia tras el fotoblanqueamiento (FRAP). Esto requiere tener un componente en la mezcla lipídica marcado^{fluorescentemente como} 6,7,24,25.
4. Tras completar el lavado final, retirar el tampón de nuevo y añadir una alicuota de 50 μL de la proteína deseada en detergente igual o inferior a su concentración micelar crítica. Deja al menos 1 hora para la incorporación de proteínas a 37 °C.
   NOTA: El detergente ablandará suavemente la bicapa y ayudará a que la proteína se incorpore a la membrana. En este protocolo, el detergente utilizado era 50 μM n-Dodecyl-beta-D-tiomalaltosida (DOTM), un detergente no iónico, y la concentración de proteínas era de 2 nM.
5. Después de una hora, enjuaga la muestra con un tampón para eliminar cualquier proteína y detergente no incorporados.
6. Añade 5 mg de perlas de poliestireno de estado (Bio-perlas) a la muestra, déjala reposar al menos 1 hora antes de retirarla. La muestra está entonces lista para la imagen (véase más abajo).

5. Aditivo antifade

1. Disuelva 5 mg de Trolox y 80 mg de D-glucosa en 10 mL de tampón (ver arriba). Sacude y haz un vórtice hasta que no queden sólidos. Nutato durante la noche en la oscuridad y luego filtra la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Prepárate fresco cada semana.
2. Disolver 6,5 mg de glucosa oxidasa (1650 U) y 8 μL de Catalasa (29.200 U/mL en tampón) en 92 μL de tampón. Mezcla la solución suavemente sin que se forme un vórtice, luego centrifuga y transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Guárdalo a 4 °C y protégelo de la luz.
   NOTA: Esta solución puede almacenarse en la nevera durante varios meses; Sin embargo, si aparece algo de turbidez, deséchala y prepara una solución nueva.
3. Mezcla 99 μL de solución de 5.1 con 1 μL del paso 5.2 en un tubo nuevo. Tras el enjuague final de la muestra, añade la solución antifade sobre la muestra (llamada solución de imagen).
   NOTA: Las soluciones antifade pueden alterar las funciones de las proteínas transmembrana; Es importante verificar la compatibilidad con el sistema.

6. Configuración y ajustes del microscopio

NOTA: Se utilizó un microscopio TIRF personalizado para este estudio de molécula única. Esta sección describe los componentes principales y las técnicas de alineación clave para un microscopio de fluorescencia básico adecuado para imágenes rápidas en lapso de tiempo (Figura 4), que es un instrumento fiable.

1. Usa un láser He:Ne de 633 nm para excitar las muestras. El láser pasa por un filtro pasa banda y una placa de onda de 1/4 para refinar la línea láser y convertir la excitación de luz polarizada linealmente en luz polarizada circularmente.
   NOTA: La polarización circular reduce el efecto de la orientación de la sonda.
2. El haz pasa a través de una lente de 300 mm y un filtro de línea láser de 633 nm, se refleja en un espejo dicróico pasa largo de 633 nm y se enfoca en la parte trasera de un objetivo de microscopio de aceite de 100x y 1,45 N/A. Alinea el haz para asegurarte de que atraviesa suavemente el centro del objetivo y se mantenga recto al salir del objetivo.
   NOTA: En este punto, el microscopio está configurado para epifluorescencia (epi). Se puede añadir una pequeña cantidad de leche en polvo a una cubeta, con fondo transparente. La cubeta, a continuación, se coloca sobre el objetivo del microscopio con una gota de aceite de inmersión entre ellas. Esto te permite observar que el haz atraviesa directamente el objetivo.
3. La emisión de las proteínas marcadas con fluorescencia pasa a través del espejo objetivo, dicróico, el filtro pasa largo y una lente de 300 mm, para luego ser imagonada en una cámara EMCCD. Utiliza lentes de tubo de mayor distancia focal para ampliar las imágenes en la cámara y mejorar la precisión de la superlocalización, lo cual es beneficioso para proteínas y agregados transmembrana de movimiento lento. Asegúrate de calibrar los píxeles de la cámara en nanómetros.
   NOTA: Sin embargo, se consigue un aumento de 1x con la lente de tubo especificada por el fabricante del objetivo, lo que aumenta la relación señal-ruido al enfocar la fluorescencia en menos píxeles. Las distancias focales más comunes incluyen objetivos de 200 mm, 180 mm, 165 mm y 164,5 mm. Recomendamos usar un blanco de aumento de la USAF de 1951. Usando un objetivo de 300 mm en este montaje, se midió una calibración de píxeles de 74 nm con una ampliación total de 170x.
4. Controla la temperatura de la muestra mediante un collar objetivo y un portamuestras equipado con un calentador/enfriador^{Peltier 26}.
   NOTA: Mantener una temperatura estable es crucial para garantizar la estabilidad térmica del microscopio y permitir mediciones precisas dependientes de la temperatura y el enfoque del instrumento.
5. Los actuadores piezoeléctricos mueven la muestra en las direcciones XYZ. Una vez que la muestra está enfocada, ajusta el haz hacia el borde del objetivo del microscopio (véase la Figura 4) utilizando la etapa unida al espejo giratorio final hasta alcanzar un ángulo crítico. Esto genera un campo de excitación evanescente. El microscopio está ahora en TIRF.
   NOTA: Se puede determinar que el microscopio está en TIRF cuando la reflexión posterior del láser es una línea (no una mancha), y el fondo de la muestra disminuye en intensidad y se alarga.

7. Recogida de datos

NOTA: La cámara debe estar preparada para una recogida rápida de datos.

1. Ajusta la velocidad de desplazamiento vertical de píxeles a aproximadamente 600 ns y haz overclocking al voltaje de reloj vertical (normalmente +4). Luego, ajusta la lectura horizontal de píxeles a su configuración máxima (30 MHz a 16 bits en este ejemplo). Ajusta la ganancia del preamplificador a 2 y configura la salida del amplificador para la multiplicación de electrones. Finalmente, ajusta la ganancia del multiplicador de electrones a su nivel más alto.
2. Pon la exposición a 25 ms. A 25 ms de exposición, asegúrate de que la tasa de fotogramas sea ligeramente mayor (25,802 ms en la cámara utilizada aquí).
3. Ajusta la potencia del láser para que la señal esté claramente por encima del fondo.
   NOTA: Ajustar la potencia del láser puede ser complicado. Demasiado alto, y la sonda se blanquea demasiado rápido; demasiado baja, y la relación señal-ruido dificulta el seguimiento. Recomendamos ajustar la potencia de modo que la señal supere el fondo en 3-5 veces para las partículas con la señal más débil. La sección 2 explica por qué el brillo molecular muestra una distribución.
4. Recoge suficientes datos para proporcionar al menos 1.000 pistas por muestra.

8. Análisis de seguimiento

NOTA: En nuestros laboratorios, el análisis de seguimiento de partícula única se realiza típicamente utilizando scripts personalizados en MATLAB basados en el trabajo de Crocker y Grier y modificados por los^{autores 3,26,27}. A continuación se muestra una descripción utilizando ImageJ, un software de acceso gratuito para la comunidad investigadora. Ambos métodos producen resultados idénticos.

1. Haz los conjuntos de datos de recorte a un tamaño consistente y luego corrige el fondo usando ImageJ.
   NOTA: Si los datos recogidos son los mismos entre conjuntos, no es necesario recortar. Esto suele hacerse solo si la región de interés del sensor de la cámara se ha desplazado entre recogidas de datos. Las capacidades de ImageJ pueden ampliarse significativamente con plugins. Una opción es instalar y usar FIJI, que es ImageJ incluido con un conjunto de plugins estándar. Entre estos plugins está TrackMate, que se usará para el protocolo aquí^28,29.
   El sitio Wiki de ImageJ ofrece guías y ejemplos para muchos plugins. También incluye tutoriales en vídeo.
2. Dentro de FIJI, arrastra y suelta la película o el archivo apilado *.tif que se va a analizar (véase Archivo Suplementario 2).
3. Introduce los detalles de calibración de píxeles. En la pestaña Analizar , selecciona Establecer escala y aplica la calibración píxel-distancia para el instrumento.
4. Guarda una copia para llevar un registro de cualquier cambio respecto al original.
5. Resta el fondo de la ventana elegida y aplícalo a la copia guardada de los datos originales. En la pestaña Proceso , elige Restar Antecedentes.
   NOTA: Esto se optimizará en función de los datos. Un buen punto de partida es usar una "bola rodante" que sea más grande que las partículas que se están imaginando.
6. En la pestaña de Plugins , selecciona Seguimiento | Compañero de pista. Esto abre la ventana de diálogo TrackMate , que guía al usuario durante el proceso de seguimiento.
   NOTA: Una vez completado el seguimiento, es posible exportar las pistas para su análisis posterior fuera de ImageJ.

9. Procesamiento de datos

NOTA: Aquí se discute cómo procesar los datos representativos y cómo calcular distribuciones de tamaño de paso para obtener una constante media de difusión.

1. Arrastrar y soltar la pila de imágenes en FIJI; Luego, aplica la calibración (74 nm/píxel).
2. Resta el fondo usando la rescrata de bola rodante con un ancho de 5 píxeles. Recorta el campo en cuatro secciones separadas de 11 μm x 11 μm y analízalo por separado.
   NOTA: Esto es para minimizar cualquier varianza de umbral debida al campo de excitación al rastrear proteínas de membrana.
3. Inicia el plugin TrackMate . Verifica que la calibración se aplique a los píxeles (véase Archivo Suplementario 3) y que el tiempo cubra el rango deseado.
   1. En TrackMate, selecciona el Laplaciano de Gauss (LoG) como método de detección para las partículas, con un diámetro estimado de 350 nm usando el filtro mediano preprocesado. Haz clic en el botón Vista previa para verificar que las partículas detectadas son razonables.
      NOTA: Algunas partículas pueden estar claramente en el fondo; No te preocupes por estos: se eliminarán en el siguiente paso.
   2. Cuando esté satisfecho con los ajustes de conteo, procesa el resto de la pila, seguido de umbral. Utiliza el umbral automático o arrastra la caja de selección para ajustar el umbral.
   3. Después de elegir cómo visualizar las partículas detectadas, selecciona el método de seguimiento: Advanced Kalman Tracker para este conjunto de datos, con los siguientes ajustes: 350 nm para los radios de búsqueda y un espacio máximo de fotogramas de 2 fotogramas.
      NOTA: También es posible añadir penalizaciones, división de vías y fusión de vías. Para este conjunto de datos, solo se realizó el seguimiento.
   4. Decide cómo filtrar y visualizar las pistas.
      NOTA: En este conjunto de datos, solo se muestran los puntos detectados (véase Archivo Suplementario 4).
   5. Tras procesar las pistas individuales, exporta los datos de seguimiento como un archivo XML para usarlos en un software de edición de hojas de cálculo (véase Archivo Suplementario 5).

Results

Como se describe en la sección 2 del protocolo, las lisinas se marcaron usando ésteres NHS conjugados a una molécula de colorante fluorescente (NHS-dye). Tras la conjugación con la proteína, mide el DOL con un espectrómetro UV-Vis. Para este experimento, el DOL de los tetrameros AQP4 fue de 4,12. A continuación, determina la probabilidad de que cada tetramero AQP4 tenga al menos una molécula de colorante usando la distribución de Poisson que se muestra a continuación.

(2)

Donde P es la probabilidad de que cada AQP4 esté etiquetado, usando la ecuación 2, la probabilidad de que cada tetramero AQP4 tenga una etiqueta fluorescente adherida es del 98%. La distribución de etiquetas por tetramero se muestra en la Figura 2 y refleja la distribución de brillo observada en la muestra.

La relación señal-ruido obtenida en estos datos de ejemplo fue 8-9x superior al fondo para un solo fluoróforo y más de 15-20 para las partículas más brillantes. Esta variación proviene de la posición en el haz de excitación y del DOL descrito en el paso 2 del protocolo.

Dentro del archivo XML generado, las columnas de interés son J, K, L y M, que corresponden al ID del número de partículas, el marco en el que se detectó la partícula, la posición X de la partícula y la posición Y de la partícula, respectivamente (véase Archivo Suplementario 6). En la segunda hoja del archivo se calculan la distribución del tamaño del paso y el coeficiente medio de difusión, donde los tamaños del paso son las distancias que una partícula recorre entre marcos, y la difusión media está dada por la ecuación 3:

(3)

Donde D_media es el coeficiente medio de difusión y Δt es la tasa de fotogramas. Esta ecuación asume movimiento browniano, que generalmente es válido para desplazamientos pequeños y puede confirmarse analizando la etiqueta media-cuadrática frente al tiempo de una muestra de pistas^{individuales 3,30,31}.

Un histograma de tamaños de paso muestra una distribución de partículas que se difunden, lo que puede atribuirse a OAPs de diferentes tamaños (Figura 5).

Figura 1: Aparato de secado de lípidos. El aparato consta de un matraz de fondo redondo de 10 mL con un conector de destilación al vacío. El nitrógeno entra a baja presión a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 μm con una aguja unida a una tapa de síntesis amarilla, que está conectada a un conector de destilación al vacío. La presión se libera a través de un tubo de Tygon unido a una jeringuilla con una aguja de corte. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Distribución esperada de las etiquetas fluorescentes en cada unidad AQP4 usando la ecuación 2. El número más probable de fluoróforos es 4, y el 98% de todos los AQP4 tendrán una etiqueta fluorescente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Conjunto de portamuestras. El conjunto está hecho de un tubo de lente SM1 de 1" con las roscas macho retiradas y biseladas para evitar interferencias con el objetivo del microscopio. Incluye una cubierta de cuarzo y una junta de parapelícula. Todo el conjunto está asegurado con un anillo de retención SM1. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Microscopio. En el lado derecho hay un diagrama simplificado del microscopio; La línea verde muestra la luz de excitación que proviene del láser. Empezando por la derecha, la luz láser pasa a través de una placa de onda de 1/4, y luego se enfoca con una lente de 300 mm. La luz se refleja mediante un espejo dicróico de paso largo sobre el objetivo, donde se enfoca en la apertura trasera. Al usar un espejo de traslación para desplazar el haz de excitación, el haz se posiciona en el borde de la apertura del objetivo, creando un campo evanescente en la muestra. La luz emitida en foco es recogida por el objetivo y se representa mediante la línea roja. La luz emitida pasa entonces a través del filtro dicroico, luego un filtro paso largo, y es enfocada por un objetivo de 300 mm sobre la cámara, proporcionando un aumento óptico de 1,7x (aumento total de 170x del objetivo y el de tubo). En el lado izquierdo hay una imagen del microscopio. Ten en cuenta que se utilizan espejos giratorios adicionales para posicionar correctamente el láser. Simultáneamente, el brazo de detección se dispone para maximizar la recogida de fotones de las proteínas transmembrana marcadas con fluorescencia. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Histograma de tamaños de pasos. La línea azul con círculos rojos es un histograma de todos los tamaños de pasos. La línea negra es adecuada para múltiples coeficientes de difusión. La distribución de probabilidad por tamaño de paso se da por: donde f_i es la población fraccionaria de cada tipo de partícula difusora, asumiendo que cada una sufre un movimiento browniano. El histograma y el ajuste muestran una distribución heterogénea de partículas de movimiento más lento y más rápido, atribuida a una distribución de múltiples tamaños de OAP. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Calculadora de hojas de cálculo utilizada para determinar composiciones en mol%, cantidades totales de lípidos y componentes fluorescentes/FRAP opcionales para la preparación de un SUV. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Pila de imágenes en bruto de microscopía de fluorescencia de una sola molécula utilizada en el seguimiento de trayectoria (archivo fuente del tutorial de TrackMate). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Vista previa animada de datos de fluorescencia de molécula única que muestran intensidad y fondo antes del procesamiento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Animación de trayectorias de partículas filtradas (postumbral) mostrando trayectorias representativas de AQP4 a lo largo del tiempo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5: Superposición animada que muestra el seguimiento de partículas de campo completo de moléculas AQP4 usando la salida de TrackMate. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 6: Hoja de cálculo que muestra coordenadas de trayectoria extraídas y distribuciones de tamaño de paso calculadas utilizadas para el análisis de difusión. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

En este artículo, presentamos un método de seguimiento de partícula única para observar directamente proteínas de membrana individuales mientras se desplazan a través de una membrana de bicapa lipídica apoyada por sólidos e interactúan entre sí. AQP4 fue elegido como ejemplo representativo debido a su capacidad para formar autoensamblajes dinámicos regulados por sus diferentes isoformas 32,33,34. Arriba, exponemos un método fiable para la preparación de muestras y parámetros clave para rastrear proteínas de membrana única en escalas de milisegundos. Los pasos incluyen: (1) preparar los SUVs, (2) determinar el nivel adecuado de marcaje fluorescente, (3) preparar soportes sólidos, (4) crear muestras de proteínas transmembrana dentro de una bicapa lipídica soportada por sólidos, (5) preparar agentes antidesvanecimiento, (6) construir un microscopio simple de molécula única, (7) recopilar datos de seguimiento de moléculas individuales y (8) analizar los datos de seguimiento usando ImageJ.

El método paso a paso descrito es conceptualmente sencillo; Sin embargo, cada paso crítico tiene sus propios inconvenientes y limitaciones. Entre estos, la preparación de la muestra es la más desafiante (pasos 1-5). Por lo tanto, hay que tener en cuenta varios detalles. La primera es cómo crear una bicapa lipídica con soporte sólido. Existen tres métodos principales: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fusión y ruptura de SUV, y (3) recubrimiento de^centrifugado 35,36,37,38,39. Cada método tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, el método de Langmuir-Blodgett proporciona un mayor control sobre las propiedades y la composición química de las bicapas, incluyendo composiciones asimétricas entre los dos folios, y permite la formación de múltiples capas de manera controlada. Sin embargo, usar un canje LB es técnicamente exigente, lleva tiempo y es costoso conseguir³⁵. El recubrimiento por centrifugado es una técnica relativamente sencilla para crear bicapas lipídicas; sin embargo, tiende a producir múltiples capas y requiere un gran exceso de material, a menudo una cantidad imprácticamente^{grande de 39}. La fusión y ruptura de vesículas son procesos sencillos que requieren solo una pequeña cantidad de material. Sin embargo, crear una superficie hidrofila es crucial, y algunas composiciones lipídicas forman bicapas mediante fusión de vesículas más fácilmente que otras (por ejemplo, en nuestro laboratorio hemos encontrado que las vesículas con carga neta negativa forman bicapas mediante fusión de vesículas solo con la adición de cationes divalentes y tiempos de incubación prolongados)⁴⁰. Además de establecer una superficie hidrofílica (paso 3), otras consideraciones importantes al formar una bicapa sólida mediante fusión de vesículas incluyen lavar la nueva bicapa tanto antes como después de incorporar la proteína de membrana. El lavado previo a la inserción elimina el exceso de SUV y las vesículas multilamelares más grandes (MLV), mientras que el lavado final tras la inserción de membrana elimina la proteína no incorporada. Un lavado insuficiente puede introducir señales de fondo durante los estudios de seguimiento.

Hemos analizado numerosos detergentes para determinar si son adecuados para la inserción de proteínas transmembrana en bicapas lipídicas soportadas por sólidos, incluyendo C12E9, Tween-20, TritonX-100 y muchos otros. Nuestro detergente preferido es el DOTM porque es fácil de quitar y es el más suave para la membrana (menos probable que altere la integridad de la membrana). La cantidad de proteína añadida es fundamental. Demasiado, y será imposible observar las vías individuales. Al adaptar este procedimiento a otras proteínas transmembrana, la cantidad tendrá que ajustarse mediante prueba y error. Sin embargo, las cantidades dadas en este procedimiento son un excelente punto de partida. La cantidad de detergente debe mantenerse igual o por debajo de la concentración micelar crítica; de lo contrario, la bicapa se solubilizará y se eliminará del sustrato de cuarzo.

La inserción de proteínas de membrana en la bicapa lipídica soportada debe optimizarse para cada conjunto de condiciones experimentales. Sin embargo, existen algunos métodos comunes para lograr esto, incluyendo el uso de proteoliliposomas y la incorporación directa de proteínas de membrana en una bicapa⁴¹ preformada. Un proteolipósoma es un liposoma, como un SUV, con una proteína incrustada en él. Estos proteoliliposomas pueden fusionarse con una bicapa lipídica sólida preformada o incorporarse simultáneamente con los SUV durante la formación de la bicapa⁴². La fusión provoca la ruptura, liberando la proteína en la membrana. Es sencillo de implementar, pero da lugar a una orientación aleatoria de las proteínas de membrana. Esto puede provocar interacciones fuertes con el soporte sólido, resultando en diferentes propiedades de difusión dependiendo de la orientación de la^{proteína 3}. Este protocolo describe un método que utiliza la incorporación directa, lo que da lugar a una preferencia orientacional para AQP4 y otras proteínas de membrana con grandes dominios hidrofílicos en un lado de la proteína 2,5,43,44.

La observación directa es una herramienta poderosa utilizada en el descubrimiento científico. La imagen dinámica de molécula única es especialmente importante en biofísica de proteínas de membrana, donde observar el movimiento y las interacciones de proteínas individuales se utiliza para poner a prueba hipótesis o generar nuevas que describan mejor cómo se comporta una proteína. El protocolo y los métodos descritos aquí son ideales para bicapas lipídicas bidimensionales soportadas por sólidos, pero pueden extenderse a entornos más complejos con múltiples componentes², celdas^vivas 34,45,46,47 y tres ^{dimensiones 48}. El seguimiento de molécula única abre la puerta a muchos otros experimentos, incluyendo el seguimiento de molécula única de dos^{colores 49}, FRET de molécula única^50,51 y la imagen dinámica de superresolución como la Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM) y la Topografía a Nanoescala de Imagen por Acumulación de Puntos (PAINT). Al ampliar el instrumento para incluir el control de temperatura, también se pueden explorar las propiedades termodinámicas de las proteínas de^membrana 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de onda 1/4	Thorlabs	WPQ05M-633	Asegúrate de igualar el láser
Objetivo 100X Oil	Olimpo	12-563-659	1,45 N/D apocromático
16:0-18:1 PC	Lípidos polares Avanti	850457	POPC Fosfolípidos
18:0 PEG2000 PE	Lípidos polares Avanti	880210	Sal de amonio
Objetivo de 300 mm	Thorlabs	AC254-300-A-ML
Láser He:Ne de 633 nm	Melles Griot	05-LHP-927	Puede cambiarse a otras fuentes y a otras longitudes de onda
Filtro pasa banda de 633nm	Chroma Tech	633/10X	Coincidencia con el láser que se está usando
Filtro pasa-largo de 655 nm	Chroma Tech	ET655lp	Cambia para que coincida con las longitudes de onda del tinte/láser
Andor Solis I	Andor	Andor Solis I	Software para captura de imágenes
ATTO 655	ATTO-TEC	655 d.C.	Modificación NHS-Ester, cualquier tinte con la modificación adecuada para trabajar con moléculas individuales puede usarse. Se recomienda ATTO, pero se puede usar Cy5/7
Bio-perlas SM-2 Resina	BioRad	1523922
Cloruro de calcio	Millipore Sigma	C4901
Catalase	Sigma-Aldrich	C3155-50MG	de hígado bovino, soltion acuosa y ge; 30.000 unidades/mg
Cloroformo	Fisher Scientific & nbsp;	C547-1	HPLC o grado espectroscópico
Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667-500MG
Cubiertas	Óptica ESCO	R525000	Cuarzo de 25mm
Divisor de haz dicróico	Semrock	FF545/650-Di01-25x36	Cambia para que coincida con las longitudes de onda del tinte/láser
Cámara EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15mL	Greiner Bio-one	188261	Tubos de cultivo celular Cellestar
Glucosa oxidasa	Sigma-Aldrich	G2133-50KU	de Aspergillus niger, Typer VII, ≥ 100000 unidades/g sólido (sin oxígeno añadido)
Pistola de calor	Carga portuaria	56434	Utilizado en el calentamiento del parafilm, generalmente se podía emplear cualquier pistola de calor
HEPES	Biorreactivos de Fisher	BP310-500
Aceite de inmersión de baja autofluorescencia	Thorlabs	MOIL-30
Methonal	Fisher Scientific & nbsp;	A452-1	HPLC o grado espectroscópico
Tubo microcentrífuga	VMR	525-1126	1,5 mL
Micro Pipetters	Ependorf		Varios; 1000 y micro; L, 100 y micro; L y 10 & micro; Se sugieren L
& Oslash; Tubos de lente de 1,5"	Thorlabs	SM1.5L10	El hilo externo se corta para preparar la muestra
Tabla óptica	Newport	Dependencia del RPR	El tamaño de la tabla depende del espacio disponible
Tejidos ópticos	Thorlabs	MC-50E	Limpieza de varios componentes
Parafilm	Millipore Sigma	P7669	No comprueba nada fluorescente en los gases durante el proceso
Actuador piezoeléctrico	Newport	PZA12
Aisladores neumáticos de vibración	Newport	Serie I-2000	se utiliza para estabilizar la mesa óptica ante cualquier irregularidad
Baño refrigerado	Fisher Scientific & nbsp;	Isotemp 3016
Controlador de obturador	Thorlabs	SC10	Vinculado al software de imagen
Cloruro de sodio	Millipore Sigma	S988
Filtro Steritop	Millipore Sigma	S2GPT05RE
Controlador y controlador de la caja de interruptores	Newport	PZC200	Controlador de escenario
Filtro de jeringuilla	J.T. Baker	SF01-98	PES 25mm 0.2 y micro; M
Elemento TEC	Thorlabs	TEC3-2.5	Se utiliza para conectar la bomba de calor Peltirer al portamuestras y al collar objetivo
Controlador de temperatura	Ingeniería Meerstetter	TEC-1091
Detector de temperatura	Thorlabs	TH100PT
Termistor	Thorlabs	TH10K
Dializador de tubo	G Biociencias	786-611	MWCO 4K
Limpiador UV de ozono	Novascan	PSDP_UV	Pro Series - Digital y nbsp;
Zoom Optics	Thorlabs	SM1NR1