Method Article

Sistema integrado de detección molecular basado en PCR para la detección simultánea de cuatro parásitos intestinales zoonóticos de múltiples fuentes

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para detectar cuatro parásitos intestinales zoonóticos de múltiples fuentes simultáneamente basado en una combinación de un sistema de detección molecular integrado basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las enfermedades infecciosas son factores críticos que afectan la salud humana, el desarrollo económico y la estabilidad social. Entre ellas, las enfermedades zoonóticas del parásito intestinal se han convertido cada vez más en un foco de preocupación mundial como enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes, en particular Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis y Giardia. Solo se publicaron unos pocos estudios sobre la epidemiología de los parásitos anteriores, acompañados de problemas como objetivos de detección únicos, bajas tasas de detección y altas tasas de detección omitidas. Este estudio tiene como objetivo establecer un sistema integrado de detección molecular basado en una combinación de pruebas de PCR para la detección simultánea de los cuatro parásitos intestinales zoonóticos anteriores en muestras recolectadas de ratones salvajes, mascotas de compañía y ganado (ganado vacuno y ovino), con el fin de proporcionar un soporte técnico eficiente para la detección rutinaria de parásitos en múltiples escenarios, incluidas las interfaces animal-ambiente, especialmente en las instalaciones de vigilancia locales.

En este estudio, tomando como prueba primaria la detección de Enterocytozoon bieneusi en heces de 95 ratones salvajes y 30 gatos y perros (25 de gatos y 5 de perros), cuando se utilizaron dos juegos de cebadores para amplificar el gen ITS, los resultados positivos de cada PCR fueron exactamente los mismos (5,26%), pero la combinación de 2 juegos de pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resultó una tasa positiva más alta (6,32%) para Enterocytozoon bieneusi. Para Giardia, se detectaron 9 muestras positivas utilizando el gen beta-giardina (BG), mientras que no se detectaron positivos utilizando los genes glutamato deshidrogenasa (GDH) y triosa fosfato isomerasa (TPI). Los resultados anteriores demostraron que una combinación de pruebas de PCR para múltiples segmentos genéticos objetivo mejoró la capacidad de detección de patógenos designados, en comparación con cualquier prueba de PCR individual. Las secuencias diana se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Este sistema fue diseñado para mejorar y facilitar la vigilancia del estado de infección, la distribución y la evolución filogenética de los parásitos intestinales zoonóticos de múltiples fuentes, proporcionando una base para advertencias precisas y sensibles en una etapa temprana. Esto tiene como objetivo construir un puente técnico para lograr el objetivo de Una Salud a través de las interfaces humano-animal-entorno.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis y Giardia son patógenos protozoarios comunes y fácilmente descuidados con prevalencia global. En los últimos años, debido a factores como la recuperación y la intrusión en los nichos ecológicos de los focos naturales, la popularidad de la cría de animales de compañía y el desarrollo de la cría de ganado y aves de corral, la prevalencia de enfermedades parasitarias intestinales zoonóticas de múltiples fuentes en roedores, animales de compañía (gatos y perros) y ganado (ganado vacuno y ovino) se ha convertido cada vez más en un foco de interés emergente, y enfermedades infecciosas reemergentes en zonas nacionales y rurales, que ponen en grave peligro la salud humana y la seguridad de la salud pública mundial 1,2,3,4.

Estos parásitos tienen especies intragenéricas complejas y una amplia adaptabilidad del huésped. Pueden infectar no solo a roedores, animales de compañía, rumiantes de ganado, aves de corral y aves, sino también a especies zoonóticas, que pueden infectar a los humanos, causando síntomas clínicos como dolor abdominal, diarrea y vómitos. Son particularmente susceptibles entre los niños, los ancianos, las mujeres embarazadas y las poblaciones inmunodeprimidas, y pueden transmitirse a través del agua, los alimentos y el aire, lo que representa importantes riesgos zoonóticos para la salud pública 3,5,6.

Actualmente, la identificación de los cuatro parásitos anteriores se basa principalmente en la morfología, que es propensa a la identificación errónea debido a las similitudes morfológicas dentro de los géneros y factores subjetivos, particularmente en la distinción entre especies y genotipos. Las técnicas de biología molecular se han utilizado ampliamente para identificar especies, géneros y genotipos de estos parásitos. Para Blastocystis y Cryptosporidium, la detección se centra principalmente en el gen del ácido ribonucleico ribosómico de subunidad pequeña (ARNr SSU) 3,7,8; para Enterocytozoon bieneusi, el gen del espaciador transcrito interno (ITS) 4,9; y para Giardia, los genes beta-giardina (BG), glutamato deshidrogenasa (GDH) y triosa fosfato isomerasa (TPI)10,11. Aunque la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) anidada ha mejorado enormemente las capacidades de identificación y tipificación de estos cuatro parásitos, es insuficiente para detectar casos perdidos e identificar nuevas especies o cuasiespecies con características genéticas significativas. Esto a menudo afecta la eficiencia de la investigación epidemiológica, la transmisión y el control de enfermedades en humanos, animales y otros huéspedes, lo que plantea grandes desafíos para la seguridad de la salud pública en humanos, animales y el medio ambiente.

Debido a las similitudes en los síntomas, las rutas de transmisión y el rango de huéspedes de estos cuatro parásitos, aún no existe ningún sistema molecular integrado para una detección eficiente mientras se evita la detección perdida e identifica con precisión nuevas especies o cuasiespecies con diferencias genéticas significativas. Este estudio estableció un sistema de detección molecular integrado maduro basado en la tecnología de secuenciación de alto rendimiento de PCR mediante la revisión de la literatura, para la detección simultánea de los cuatro parásitos intestinales zoonóticos en muestras de múltiples fuentes (ratones salvajes, animales de compañía, ganado vacuno y ovino). Combinado con el análisis bioinformático, este sistema se aplicó para identificar parásitos intestinales zoonóticos de múltiples fuentes, monitorear factores epidemiológicos como la distribución de infecciones y la evolución filogenética, y la alerta temprana de infecciones humanas y animales y contaminación ambiental.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio fue aprobado y realizado por el comité de ética animal del Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Jiangsu. Este estudio se realizó de acuerdo con la edición 2020 de las Directrices de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense sobre Eutanasia Animal, los principios rectores del Reglamento sobre la Administración de Animales de Experimentación (Orden No. 2 de la Comisión Estatal de Ciencia y Tecnología de la República Popular China, 1988) y los Principios Rectores para el Trato Humanitario de los Animales emitidos por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular China.

1. Preparación de heces frescas de ratones salvajes, animales de compañía y ganado (bovinos y ovinos)

  1. Anestesiar ratones mediante inhalación de dióxido de carbono de una fuente de dióxido de carbono comprimido enlatado en una caja de plástico hermética transparente, con una tasa de reemplazo del 30% al 70% del volumen del recipiente por minuto. Después de la anestesia completa y el coma, realice la dislocación cervical en los ratones.
  2. Recolección de muestras fecales frescas: recolecte muestras fecales de perros, gatos, vacas y ovejas dentro de 1 h después de la defecación, con un tubo por las heces del animal, y evite la contaminación cruzada.
    1. Capture roedores usando jaulas de cebo con dispositivos de liberación en diferentes hábitats silvestres. Coloque los ratones capturados en bolsas para ratones y transpórtelos rápidamente al laboratorio. Bajo operación estéril en un gabinete de bioseguridad, diseccionar los ratones para recolectar el recto que contiene heces, colocarlo en un criotubo de 2 ml y almacenarlo a -80 ° C para su posterior detección.
    2. Selecciona perros y gatos de tiendas de mascotas en diferentes regiones como objetos de investigación. Recoja las heces recién excretadas inmediatamente, en criotubos de 5 ml, etiquetados con información completa de la muestra, y transpórtelos rápidamente al laboratorio para su almacenamiento a -80 °C.
    3. Seleccionar bovinos y ovinos de explotaciones ganaderas (intensivas o camperas) como objetos de investigación. Recoja las heces recién excretadas inmediatamente en criotubos de 50 ml, etiquetados con información completa de la muestra, y transpórtelos rápidamente al laboratorio para su almacenamiento a -80 °C.

2. Extracción de ADN total de heces frescas de ratones salvajes, animales de compañía y ganado (bovinos y ovinos)

  1. Pretratamiento fecal:
    NOTA: Se utilizó el mini kit de heces QIAamp Fast DNA.
    1. En funcionamiento estéril en un gabinete de bioseguridad, agregue aproximadamente 200 mg de heces de diferentes fuentes en el tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS), agregue perlas de acero y homogeneice completamente con un molinillo de tejidos.
    2. Calentar a 70 °C durante 5 min y centrifugar a 10.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente (15-25 °C).
    3. Agregue 600 μL de sobrenadante a un tubo de centrífuga de 2 mL que contenga 25 μL de proteinasa K, agregue 600 μL de tampón AL y vórtice durante 15 s.
    4. Incubar a 70 °C durante 10 min. Agregue 600 μL de etanol 100% anhidro al lisado y vórtice para mezclar.
  2. Agregue con cuidado 600 μL del lisado a una columna de centrifugado, centrifugue a 14000 × g durante 1 min y coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Repita este paso una vez más.
  3. Abra con cuidado la columna de centrifugado, agregue 500 μL de tampón AW1, centrifugue a la velocidad máxima durante 1 min y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Abra con cuidado la columna de centrifugado, agregue 500 μL de tampón AW2 y centrifugue a la velocidad máxima durante 3 min.
  4. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 2 ml (preparado por separado) y centrifugue a 14000 × g durante 3 min. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml etiquetado y agregue 100 μL de tampón de elución directamente a la membrana de la columna de centrifugación.
  5. Incubar a temperatura ambiente (15-25 °C) durante 1 min y centrifugar a 14000 × g durante 1 min para eluir el ADN.
  6. Determine la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro ultramicro. Utilice el ADN extraído para su posterior detección o guárdelo a -20 °C para su conservación a largo plazo.
    NOTA: La relación A260/A280 debe ser de 1,8-2,0 para garantizar la integridad y pureza del ADN extraído.

3. Detección por PCR convencional anidada de Cryptosporidium y Blastocystis dirigida a ARN ribosómico de subunidades pequeñas (ARNr SSU)

NOTA: Para este paso se utilizó la mezcla de PCR Dream Taq Green.

  1. Prepare el sistema de reacción de PCR en hielo usando PCR Mix: 25 μL de tampón 2× Taq, 2 μL de cada uno de los cebadores directos e inversos, 16 μL de ddH2O y 5 μL de plantilla, con un volumen total de 50 μL.
  2. Para Cryptosporidium, siga los pasos 3.2.1-3.2.2.
    1. Utilice F1R11 y F-1R1-1 8,11 como cebadores de reacción de primera ronda. Establezca el programa de reacción: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 90 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    2. Utilice F2R21 y F-1R2-1 8,11 como cebadores de segunda ronda, con el siguiente programa de reacción: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 1 min, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
  3. Para Blastocystis, siga los pasos 3.3.1-3.3.4.
    1. Utilice F1R13 y F1-1R-1 3,12 como cebadores de reacción de primera ronda. Establezca el programa de reacción para F1R1 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 60 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 100 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    2. Establezca el programa de reacción para F1-1R-1 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 1 min, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    3. Use F2R23 y F2-1R-1 3,12 como cebadores de segunda ronda. Establezca el programa de reacción para F2R2 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 60 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 1 min, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    4. Establezca el programa de reacción para F2-1R-1 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 50 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
      NOTA: Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1 1,3,8,11,12.
PatógenoTamaño esperado del producto (pb)Secuencias de cebadores (5′-3′)Referencias
Cryptosporidium830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tabla 1: Secuencias de cebadores para el ARNr de SSU de Cryptosporidium y Blastocystis.

4. Detección por PCR convencional anidada del gen Enterocytozoon bieneusi ITS y de los genes Giardia BG, GDH y TPI

NOTA: Para este paso se utilizó la mezcla de PCR Dream Taq Green.

  1. Prepare el sistema de reacción de PCR en hielo utilizando una mezcla de PCR: 25 μL de tampón 2× Taq, 2 μL de cebadores directos e inversos, 16 μL de ddH2O y 5 μL de plantilla, con un volumen total de 50 μL.
  2. Para Enterocytozoon bieneusi, siga los pasos 4.2.1-4.2.2.
    1. Utilice F1R19 y F1-1R1-12 como cebadores de reacción de primera ronda. Establezca el programa de reacción de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 50 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    2. Utilice F2R29 y F2-1R2-12 como cebadores de segunda ronda, con el programa de reacción de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 50 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
  3. Para Giardia, siga los pasos 4.3.1-4.3.3.
    1. Utilice BG-F1R1, GDH-F1R1 y TPI-F1R1 2,10 como cebadores de reacción de primera ronda para los tres genes diana. Establezca el programa de reacción de la primera ronda para todos de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 50 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 1 min, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    2. Establezca el programa de reacción de segunda ronda para BG-F2R2 2,10 y TPI-F2R2 2,10 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 55 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 50 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
    3. Establezca el programa de reacción de segunda ronda para GDH-F2R2 2,10 de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, recocido a 60 °C durante 40 s y extensión a 72 °C durante 50 s, con un alargamiento final a 72 °C durante 7 min.
      NOTA: Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2 2,9,10.
PatógenoTamaño esperado del producto (pb)Secuencias de cebadores (5′-3′)Referencias
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGGCCTC
F2: GCTCTGAATATATCTGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tabla 2: Secuencias de cebadores para el gen ITS de Enterocytozoon bieneusi y los genes Giardia BG, GDH y TPI.

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Results

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Resultados de las pruebas de PCR del gen Cryptosporidium de ratones, el gen Blastocystis SSU, el gen ITS de Enterocytozoon bieneusi y el gen Giardia BG
Las 95 muestras fecales rectales de ratones se analizaron para detectar el gen ITS de Enterocytozoon bieneusi utilizando dos juegos de cebadores, lo que resultó en 5 muest...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis y Giardia son parásitos intestinales zoonóticos comunes; los dos primeros están clasificados como patógenos biológicos de categoría B por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU., y los cuatro están catalogados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como 24 de los parásitos transmitidos por alimentos más importantes del mundo. Pueden infectar potencialmente a humanos, animales ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por la Comisión Provincial de Salud de Jiangsu (subvención no. Ym2023024), Proyecto de Investigación Médica Municipal de Yancheng (subvención no. YK2023085), y el Fondo Abierto del Laboratorio Clave de Microbiología Patógena para Enfermedades Infecciosas Emergentes y Reemergentes (Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Jiangsu) (PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Kit de extracción de gel QiaquickQiagen 28704Kit de extracción de gel de ADN
Escalera de ADN de 100 pbTransGen  BiotecnologíaBM311Escalera de ADN
Tinción 4S Green Plus Nucleic AcidBBIA616696-0500Tinción de ADN
10 y veces; Búfer TBESolarbioT1051Buffer de electroforesis
Qubit 4.0Termohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/spectroscopy-elemental
-análisis isotópico/espectroscopía molecular/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Instrumento cuantitativo de fluorescencia
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
TIPO=DETALLE		Sensor de gel
  Mini kit rápido de heces de ADN para extracción de ADNQIAGEN51604Kit de extracción de ácidos nucleicos
ProFlex BaseTermohttps://www.thermofisher.com/
en/en/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixTermoK1082Amplificación PCR 

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