Un modelo de rata de transporte transversal de la corteza tibial para el tratamiento de la isquemia de la extremidad inferior

Resumen

Este procedimiento demuestra el transporte transverso de la corteza tibial en ratas, permitiendo la visualización y el análisis de la revascularización durante la isquemia de la extremidad.

Resumen

El transporte transverso de la corteza tibial (TTT) es una técnica quirúrgica emergente utilizada para promover la revascularización en las extremidades inferiores isquémicas. Este vídeo muestra un modelo reproducible de rata de TTT, detallando la creación quirúrgica de un fragmento de hueso cortical, el protocolo de transporte y las evaluaciones postoperatorias. El procedimiento permite el transporte controlado hacia arriba y hacia abajo de un fragmento óseo para estimular respuestas angiogénicas. Las radiografías representativas obtenidas en los días postoperatorios 1, 7 y 12, junto con imágenes por perfusión microvascular realizadas el día 19 tras la eutanasia, muestran un movimiento claro de fragmentos óseos y una mejora en la perfusión de las extremidades tras la TTT.

Este modelo proporciona una plataforma práctica y reproducible para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la angiogénesis inducida por TTT y evaluar posibles estrategias terapéuticas para enfermedades isquémicas. Para construir este modelo, simulamos el procedimiento clínico TTT en ratas Sprague-Dawley, que implicó tres pasos quirúrgicos principales: ligadura de la arteria femoral superficial, creación y movilización de un fragmento de hueso cortical, y aplicación de un fijador externo personalizado. Durante 12 días, el fragmento fue transportado gradualmente hacia adelante y luego hacia atrás. Las imágenes por perfusión confirmaron una mayor vascularización en el miembro isquémico tras completar el ciclo de transporte. En conjunto, este modelo estandarizado de rata imita estrechamente los procedimientos clínicos TTT y ofrece un valioso sistema experimental para estudiar la mecanotransducción, angiogénesis y regeneración vascular en condiciones isquémicas de extremidades.

Introducción

Las enfermedades isquémicas de las extremidades inferiores, como la arteriosclerosis obliterante (ASO), tromboangiitis obliterante (TAO) y pie diabético (DF), se caracterizan por un flujo sanguíneo arterial restringido hacia las extremidades^{inferiores 1,2}. En las primeras fases, los pacientes suelen experimentar claudicación intermitente y dolor en reposo. A medida que la enfermedad avanza, la isquemia prolongada puede provocar necrosis tisular, infección y, en casos graves, amputación de^{extremidades 1}. Los tratamientos estándar actuales —incluyendo la terapia farmacológica, las intervenciones endovasculares y los procedimientos quirúrgicos abiertos— suelen ofrecer una eficacia limitada, especialmente en etapas avanzadas de la^{enfermedad 3}.

El transporte transverso de la corteza tibial (TTT) es una estrategia terapéutica innovadora para el tratamiento de diversas enfermedades isquémicas de la extremidad^inferior. Basada en el método de Ilizarov y la "regla tensión-estrés^"5,6, esta técnica consiste en crear un fragmento móvil de colgajo óseo cortical en la tibia mediante osteotomía. Se aplica entonces una fuerza de distracción continua, lenta y controlada para estimular la regeneración de huesos, vasos sanguíneos y tejidos blandos circundantes. Este proceso regenerativo facilita la restauración de la microcirculación y ayuda a restaurar el equilibrio del suministro de ogénio en la extremidad afectada. En última instancia, la TTT conduce a una mejor perfusión sanguínea y recuperación funcional en los tejidos^{isquémicos 7}.

Las técnicas convencionales de reconstrucción vascular para la isquemia de la extremidad inferior pueden restaurar el flujo sanguíneo en las arterias grandes de la pantorrilla, pero a menudo son ineficaces para revascularizar arterias más pequeñas del pie o promover la reparación y regeneración de microvasos dañados, limitando su capacidad para resolver completamente la^{isquemia 8}. La TTT aplica tracción continua al hueso y a los tejidos blandos circundantes, induciendo así la liberación robusta de factores quimiotácticos y^{citocinas 9}. Estos factores quimiotácticos regulan diversas funciones de las células madre y, en condiciones isquémicas, se secretan abundantemente en la circulación. Reclutan activamente células madre endógenas en los sitios de lesión, facilitando así la reparación y regeneración vascular sin necesidad de un trasplante directo de células madre. Gracias a estas ventajas, la TTT ha emergido como una estrategia terapéutica prometedora para la isquemia de las extremidades inferiores y se emplea cada vez más en el tratamiento de diversas condiciones isquémicas que afectan a las extremidades^{inferiores 7,9,10}.

Aunque los conejos y perros se utilizan comúnmente en la investigación fundamental de TTT, la falta de herramientas analíticas adecuadas para estas especies limita las investigaciones mecanicistas. En cambio, el modelo TTT de ratas ofrece una mayor compatibilidad con las técnicas moleculares y de imagen disponibles, manteniendo la practicidad y un coste menor, lo que lo convierte en una plataforma más accesible y reproducible para estudios mecanicistas. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha descrito o evaluado sistemáticamente la eficacia de la TTT en un modelo de ratas de isquemia de extremidades inferiores.

El modelo TTT de rata requiere habilidades microquirúrgicas refinadas debido al pequeño tamaño tibial y la corteza delgada, y su rango de distracción está limitado por el grosor cortical. Estas limitaciones prácticas deben tenerse en cuenta al evaluar la idoneidad del modelo para entornos de investigación específicos.

En este estudio, desarrollamos un modelo TTT específico para ratas replicando la estructura central y los principios operativos del aparato clínico de transporte transversal tibial. El procedimiento se perfeccionó a partir de protocolos clínicamente validados para garantizar la viabilidad y consistencia en animales pequeños. Nuestro objetivo es establecer y validar un modelo TTT estandarizado y reproducible en ratas, adecuado para investigar la angiogénesis y la mecanotransducción en la enfermedad isquémica de las extremidades.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangxi (aprobado nº 2025-E0642). Los machos de rata Sprague-Dawley (300-350 g) fueron alojados en el Centro de Investigación Animal de la Universidad Médica de Guangxi bajo condiciones estandarizadas. A las ratas se les proporcionó comida normal y agua potable limpia a plena voluntad, y se mantuvieron en un ciclo artificial de luz y oscuridad de 12 horas. La instalación animal se mantenía a una temperatura controlada de 20-26 °C con una humedad relativa del 40% al 70%. Todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaban completamente antes de su uso. La información detallada sobre todos los reactivos y materiales utilizados en este estudio se proporciona en la Tabla 1.

La eutanasia se realizó mediante la inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital sódico. La muerte se confirmó mediante la suspensión permanente del latido y la respiración, la dilatación pupilar y la ausencia de respuesta a estímulos nocivos. Todos los procedimientos fueron realizados por personal capacitado para minimizar el malestar animal, y el protocolo de eutanasia fue revisado y aprobado previamente por el Comité de Cuidado y Uso Institucional del Animal.

1. Fijador externo para TTT

1. Utilice una versión reducida y diseñada a medida del fijador externo clínico de transporte transversal de la corteza tibial (TTT-EF), que consta de una unidad de tracción de fragmentos óseos y un marco de fijación externo.
2. Permitir la movilización vertical de ambos componentes incorporando un mecanismo interno de rosca roscada (Figura 1).
3. Perfora dos agujeros a cada lado de las secciones transversales tanto de la unidad de tracción como del bastidor de fijación para permitir la inserción de cables Kirschner.
4. Introduce los cables Kirschner por los orificios designados y fijalos lateralmente usando tornillos hexagonales para asegurar la estabilización.
5. Conecta el componente de tracción del TTT-EF al fragmento óseo usando cables Kirschner de 0,8 mm.
6. Ancla el componente de fijación a los extremos proximal y distal de la tibia usando alambres Kirschner de 1,0 mm.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Realizar el procedimiento TTT en ratas machos Sprague-Dawley (SD) de 8 semanas. Anestesiar a las ratas mediante inyección intraperitoneal de 0,35 mg/kg de pentobarbital sódico y 0,3 mg/kg de cloral hidrato.
2. Evalúa el efecto anestésico probando el reflejo de retirada del pedal y el reflejo corneal. Controla continuamente los signos vitales y la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento. Aplica pomada oftálmica en los ojos de la rata antes de la cirugía para proteger la córnea, siguiendo las Directrices para el Uso de Animales de Laboratorio.
3. Afeitar la zona quirúrgica y administrar lidocaína al 0,5% para minimizar el dolor postoperatorio.
4. Haz una incisión cutánea de 10 mm en la región inguinal derecha usando un bisturí nº 11.
5. Disecciona la fascia de forma directa para exponer la arteria femoral superficial.
6. Aislar la arteria entre el nervio femoral y la vena femoral superficial usando pinzas oftálmicas. Liga y transecta ambos extremos de la arteria.
7. Sutura la incisión usando sutura absorbible 4-0.
8. Realiza una incisión vertical de 15 mm en la tibia superior medial usando un bisturí nº 11.
9. Separa cuidadosamente el tejido subcutáneo y el músculo subyacente para evitar lesiones periósticas. Diseca suavemente el tejido blando para exponer completamente la superficie tibial medial.
10. Contornea el área de fragmentos óseos (8 mm × 4 mm) en la superficie tibial medial usando una cuchilla quirúrgica. Perforar perforaciones muy próximas a lo largo del límite marcado usando una broca de 0,6 mm. Crear un fragmento óseo de ventana (8 mm × 4 mm) en la tibia medial superior.
11. Implantar dos cables Kirschner roscados de 0,8 mm en el fragmento óseo, separados por 0,5 mm, para facilitar el transporte. Conecta los cables Kirschner al TTT-EF y fijalos.
12. Insertar dos hilos Kirschner de 1,0 mm a cada lado del fragmento, penetrando la corteza posterior de la tibia.
13. Montar e instalar el TTT-EF.
14. Realiza la osteotomía siguiendo las líneas marcadas con tijeras oftálmicas.
15. Eleva suavemente el fragmento óseo para permitir la movilidad vertical, evitando lesiones en la médula.
16. Irrigar el lugar quirúrgico con 10% de povidona-yodo seguido de solución salina estéril.
17. Sutura la incisión en capas usando sutura absorbible 4-0.
18. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía. Continúa dosificando cada 12 horas durante hasta 3 días para asegurar una analgesia eficaz.

3. Monitorización postoperatoria

1. Vigila de cerca a los animales tras la cirugía para garantizar una recuperación adecuada y detectar posibles complicaciones a tiempo. Examina a los animales cada 6-8 horas durante las primeras 48 horas postoperatorias. Evalúa la actividad general, la postura, el comportamiento de aseo, la ingesta de alimentos y agua, y la condición de la incisión quirúrgica.
2. Realiza monitorización al menos una vez al día desde el tercer día postoperatorio hasta las fases de distracción y consolidación. Confirma una recuperación adecuada verificando la marcha normal, el peso corporal estable, la ingesta constante de comida y agua, y la ausencia de secreción de heridas, hinchazón excesiva o signos de dolor conductual.
3. Continuar con la analgesia según sea necesario de acuerdo con las directrices institucionales.
4. Tratar las infecciones de la herida (por ejemplo, eritema, hinchazón, secreción purulenta) con cuidados locales de la herida y antibióticos sistémicos, siguiendo las recomendaciones veterinarias.
5. Corregir cualquier aflojamiento o desplazamiento del fijador externo inmediatamente bajo anestesia breve para mantener la alineación y permitir una distracción precisa.
6. Evalúa y gestiona rápidamente cualquier posible complicación. Evalúa animales con complicaciones graves que afecten la movilidad, la alimentación o la cicatrización de heridas en consulta con el personal veterinario.
7. Eutanasiar a los animales de forma humana si cumplen los criterios humanos predefinidos para el desenlace.

4. Protocolo de transporte de fragmentos óseos

1. Utiliza el fijador externo de transporte transversal de la corteza tibial (TTT-EF) para realizar el transporte postoperatorio de fragmentos óseos.
2. Designa el Día 1 tras la cirugía como periodo de latencia.
   NOTA: No manipules el fragmento óseo durante este periodo.
3. Inicia la fase de transporte ascendente en el Día 2. Avanzar el fragmento óseo a una velocidad de 0,5 mm cada 12 horas durante 5 días consecutivos (Día 2-Día 6). Pausar el proceso de transporte en el día 7 para permitir la estabilización.
4. Inicia la fase de transporte descendente en el día 8.
5. Retrae el fragmento óseo a la misma velocidad de 0,5 mm cada 12 horas durante 5 días (Día 8-Día 12). Asegúrate de que el fragmento óseo vuelva a su posición original antes de que termine el Día 12.
6. Continuar con una fase de consolidación de 2 días (días 13-14), sin más traslados.
7. Retira el fijador externo al final de la fase de consolidación.
   NOTA: Consulte la Figura 2 para una cronología visual del procedimiento de transporte TTT y el calendario de evaluación.

5. Evaluación

NOTA: Utilice técnicas de imagen para evaluar tanto la posición del fragmento óseo como la restauración del flujo sanguíneo.

1. Realizar radiografías de las extremidades inferiores en los días 1, 7 y 12 para monitorizar la progresión y posición final del fragmento óseo transportado.
   1. Anestesiar ratas en los momentos de imagen designados usando un 2,0% de isoflurano en oxígeno.
   2. Coloque a cada rata en una plataforma de imagen con temperatura mantenida equipada con una almohadilla térmica para evitar hipotermia durante el procedimiento.
   3. Monitoriza la profundidad anestésica evaluando la frecuencia respiratoria y el reflejo pedal para asegurar una inmovilización estable.
   4. Colocar las extremidades y el fijador externo en una orientación estandarizada en todos los animales para minimizar la variabilidad en la adquisición de rayos X.
   5. Obtener imágenes de rayos X para confirmar el desplazamiento y reposicionamiento de fragmentos óseos.
2. Realizar imágenes por perfusión vascular el día 19 postoperatorio para evaluar la microperfusión en la extremidad inferior.
   1. Eutanasia a las ratas y perfunde el agente de contraste a través de la arteria femoral para visualizar la vasculatura.
   2. Coloca a las ratas eutanasiadas en una posición estandarizada en posición supina para una configuración de imágenes consistente.
   3. Permitir el relleno vascular completo perfundiendo el agente de contraste a través de la arteria femoral bajo condiciones estables a temperatura ambiente.
   4. Realizar imágenes vasculares para evaluar la arquitectura y perfusión microvascular. Asegurarse de que todas las muestras estén alineadas de forma consistente con la misma orientación de las extremidades y del fijador para favorecer la reproducibilidad en las sesiones de imagen.
   5. Utiliza las imágenes resultantes para evaluar la restauración del flujo sanguíneo y la arquitectura vascular en las extremidades inferiores.

Resultados

La Figura 3 ilustra el procedimiento para construir un modelo animal de isquemia de extremidad inferior tratado con TTT. En nuestras manos, el procedimiento demostró una tasa de éxito quirúrgico de aproximadamente el 90%. El número limitado de fallos se debió en gran medida a problemas técnicos como el aflojamiento del fijador externo o la fractura intraoperatoria de fragmentos óseos, que hicieron inviable la distracción posterior. El modelo se estableció exp...

Discusión

Todos los procedimientos que implicaron anestesia y cirugía se realizaron con especial atención a la seguridad animal y a las directrices institucionales de cuidado animal. La profundidad de la anestesia se confirmó antes de la incisión mediante pruebas de retirada del pedal o reflejo corneal y se monitorizó regularmente durante todo el procedimiento. Se proporcionó soporte térmico adecuado (como una almohadilla térmica) para prevenir la hipotermia, y se aplicó ungüento oftálmico para pr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Separador microtransversal	Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd	A61B17/66	Realizar tracción de fragmentos óseos
Pequeño Taladro Ortopédico	Yancheng Ruiao Technology Co. LTD	RA-II	Para osteotomía de perforación tibial
Broca de acero inoxidable de 0,6 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para osteotomía de perforación tibial
Hilo Kirschner tipo rosca de 0,8 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para la fijación de colgajos óseos y separador
Hilo Kirschner de rosca de 1,0 mm	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para fijación de un retractor
Pentobarbital sódico	Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd	-	Para anestesiar animales
Llave Allen	Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd	-	Para fijar tornillos
Buprenorfina	Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd		Para animales analgesiosos
MICROFIL	Flow Tech, Inc Co., Ltd		Angiografía de animales
Isoflurano	Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd.		Para inducción y mantenimiento de anestesia inhalada
Lidocaína clorhidrato (0,5%)	Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd.		Se utiliza para la infiltración local con el fin de reducir el dolor postoperatorio y minimizar la irritación tisular durante procedimientos quirúrgicos