Aquí, presentamos un protocolo para definir claramente los pasos para anastomosar el ganglio linfático cervical profundo o su vaso linfático aferente con la vena facial posterior en la rata, para minimizar la influencia de otras variables y estandarizar la realización de investigaciones basadas en cirugía.
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Artículo de método
Protocolos quirúrgicos para la anastomosis linfovenosa cervical profunda en un modelo de rata: anastomosis de ganglios linfáticos y vasos linfáticos
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Resumen
Resumen
La anastomosis linfovenosa cervical profunda (dcLVA) se ha convertido en una estrategia de tratamiento prometedora para la enfermedad de Alzheimer (EA), que ofrece mejoras significativas en comparación con las limitadas opciones de tratamiento actuales. Sin embargo, el mecanismo subyacente de dcLVA sigue sin estar claro. Aunque los ensayos clínicos están en curso, los modelos animales que simulan dcLVA proporcionan una herramienta valiosa para explorar su mecanismo. Este estudio tiene como objetivo desarrollar un protocolo estandarizado para crear modelos de dcLVA en animales para facilitar la investigación básica y abordar los desafíos clínicos. Describimos los procedimientos quirúrgicos y los pasos clave para la anastomosis del ganglio linfático cervical profundo (dcLN) y su vaso linfático aferente (ALV) con la vena facial posterior (PFV), detallando estos dos métodos quirúrgicos distintos: anastomosis profunda de ganglios linfáticos cervicales y venas (dcLnVA) y anastomosis profunda de vasos linfáticos cervicales y venas (dcLaVA). Más allá de promover el drenaje linfático, la comparación de estos dos métodos quirúrgicos también nos ayuda a comprender y explorar el papel del ganglio linfático cervical profundo y el sistema linfático cervical profundo en la patogénesis de la EA. En general, la presentación completa y clara del procedimiento quirúrgico y los puntos de referencia anatómicos clave en la rata ayuda a estandarizar el protocolo quirúrgico. que puede minimizar los factores de confusión y reducir la variabilidad interexperimental, sentando así una base metodológica sólida para una comprensión más profunda de los mecanismos involucrados.
Introducción
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo gradualmente progresivo que a menudo resulta en deterioro cognitivo. Las características patológicas distintivas de la EA son placas de beta amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares, que están formados por proteínas tau anormalmente fosforiladas. Investigaciones recientes sobre el sistema linfático cerebral han abierto nuevas vías terapéuticas para tratar la EA. Este sistema facilita el drenaje de Aβ desde el líquido intersticial (ISF) hacia el líquido cefalorraquídeo (LCR) y, posteriormente, a los ganglios linfáticos cervicales profundos a través de los vasos linfáticos meníngeos (mLV)1. En 2024, el equipo del profesor Xie informó del primer caso de mejora cognitiva en un paciente con EA después de una anastomosis linfovenosa cervical profunda (dcLVA) y posteriormente inició un ensayo clínico (NCT06530732)2.
Aunque el dcLVA, como nuevo enfoque terapéutico para la EA, ofrece perspectivas prometedoras para los pacientes, los mecanismos precisos que subyacen a sus efectos terapéuticos requieren una mayor elucidación3. Los modelos animales proporcionan una plataforma indispensable para investigar estos mecanismos. Una comprensión integral de los mecanismos terapéuticos de la dcLVA no solo mejorará nuestra comprensión de la patogénesis de la EA, sino que también optimizará las técnicas quirúrgicas, aclarará las indicaciones de tratamiento y, en última instancia, brindará mayores beneficios clínicos a los pacientes.
El equipo del profesor Xie informó recientemente un modelo de dcLVA, que demuestra la viabilidad de conectar los afluentes de la vena yugular externa con el ganglio linfático cervical profundo4. Sin embargo, la descripción del modelo aún no es suficiente. En primer lugar, la descripción del ganglio linfático cervical profundo (dcLN) y su anatomía circundante es inadecuada. En segundo lugar, no existe una evaluación objetiva y cuantitativa de la permeabilidad postoperatoria. Más importante aún, faltan descripciones detalladas de los pasos para la anastomosis de dcLN y venas, así como imágenes y videos claros e intuitivos que sean convenientes para la enseñanza.
Dado que esta técnica implica una manipulación quirúrgica compleja y considerando las diferencias anatómicas entre ratas y humanos, las variaciones en los procedimientos quirúrgicos y los detalles técnicos en los modelos de ratas pueden conducir a discrepancias significativas en los resultados experimentales. Por lo tanto, es fundamental y urgente ilustrar claramente los puntos de referencia anatómicos relevantes en ratas y proporcionar descripciones técnicas detalladas del procedimiento de anastomosis. Tales esfuerzos son esenciales para mejorar la reproducibilidad y estandarización del protocolo quirúrgico, apoyando así una aplicación más amplia por parte de los investigadores y avanzando en las investigaciones científicas relacionadas. Además, dada la diversidad de técnicas quirúrgicas clínicas, como la anastomosis ganglionar a venosa y la anastomosis linfáticavenosa, y el potencial de resultados variables según el abordaje quirúrgico, se justifican estudios comparativos para evaluar su eficacia relativa. En respuesta a estos desafíos, presentamos dos métodos de dcLVA altamente reproducibles: anastomosis profunda de ganglios linfáticos cervicales a venas (dcLnVA) y anastomosis profunda de vasos linfáticos cervicales y venas (dcLaVA). Estos métodos tienen como objetivo estandarizar el proceso de creación de modelos y facilitar la investigación básica posterior.
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Protocolo
Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Harbin (Aprobación No. SYDW2025-037). Los sujetos eran ratas Sprague-Dawley (SD) macho, con un peso de 400-500 g y una edad de 12-14 semanas, proporcionadas por el centro de animales de la universidad. El centro mantiene una instalación libre de patógenos específicos (SPF) y cumple con los estándares nacionales de reproducción.
NOTA: Este estudio investiga principalmente dos métodos de anastomosis entre la linfa cervical profunda y las venas. Establecer una conexión quirúrgica entre el dcLN y la vena facial posterior (PFV); esta técnica se conoce como dcLnVA. Crear una conexión anatómica entre el vaso linfático cervical profundo (dcLaV) y el PFV; esta técnica se conoce como dcLaVA. Describimos ambos procedimientos microquirúrgicos en detalle, incluidas sus metodologías operativas y la evaluación posterior a la anastomosis.
1. Preparación preoperatoria
- Anestesiar a la rata mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Monitoree de cerca las respuestas de la rata. Proceda solo cuando el reflejo del pedal esté completamente ausente.
- Con una aguja de punta roma, administre lentamente la solución de azul de Evans (EB) (aproximadamente 60-100 μL / kg, 5%)5 en la mucosa nasal de una cavidad nasal unilateral. Coloque a la rata en una posición recostada semilateral, con el abdomen hacia arriba y la fosa nasal inyectada por EB hacia abajo. Asegure la cabeza para evitar que la EB ingrese a la fosa nasal contralateral o al tracto respiratorio.
- Afeite el pelo del cuello de la rata para asegurar un campo quirúrgico despejado. Aplique vaselina en ambos ojos para prevenir la sequedad o lesiones en la córnea durante la cirugía.
2. Incisión quirúrgica
- Desinfecte la línea media del cuello de la rata tres veces con tintura de yodo para asegurar un campo quirúrgico estéril.
- Haga una incisión en la línea media de aproximadamente 3 cm de longitud con unas tijeras quirúrgicas.
NOTA: Tenga cuidado de no dañar la glándula submaxilar (SMG) y los vasos sanguíneos durante la disección. - Retraiga la incisión quirúrgica para exponer el músculo esternotiroideo (STM), el músculo esternocleidomastoideo (SCM) y el músculo omohioideo (OHM).
3. Preparación del PFV
- Identifique el PFV, un afluente de la vena yugular externa (EJV), a lo largo del margen lateral del SCM.
- En la bifurcación entre el PFV y el EJV, ocluir el PFV con un clip microvascular.
- Continúe diseccionando sin rodeos el PFV para obtener la longitud suficiente y sujételo en el extremo distal. Asegúrese de que el segmento PFV permanezca lo más suelto posible para permitir la tracción posterior durante la anastomosis con el dcLN.
- Cree una incisión longitudinal paralela al eje del vaso con unas tijeras microvasculares.
NOTA: Asegúrese de que la incisión del PFV sea longitudinal, ya que la incisión transversal puede agrandarse y romperse por tracción. - Irrigar el segmento vascular aislado a fondo con solución salina heparinizada (heparina sódica al 0,1% en NaCl al 0,9%) hasta que los eritrocitos intravasculares estén completamente eliminados.
4. Anastomosis ganglionar-venosa
- Explorar y exponer completamente dcLN y su vaso linfático aferente (ALV) en el medio del STM y SCM4.
- Diseccionar el dcLN gradualmente usando una técnica contundente. Haga una incisión cuidadosa en la fascia entre el dcLN y los tejidos circundantes, evitando dañar tanto el dcLN como su ALV.
NOTA: Asegúrese de que PFV y dcLN estén cerca uno del otro para minimizar la tensión después de la anastomosis. - Haga una incisión en el extremo distal del dcLN. Asegúrese de que el ancho de la incisión sea menor o similar al diámetro del PFV, para que el flujo sanguíneo del PFV no se vea afectado significativamente.
- Con una sutura de nailon 12-0, anastomosar el extremo proximal de la incisión del PFV hasta el extremo proximal de la incisión de dcLN.
- Continúe expandiendo la longitud de la incisión del PFV hasta el extremo distal para que sea un poco más grande que la longitud de la incisión dcLN.
- Pase la aguja secuencialmente a través del borde exterior de la transección de dcLN y el borde interno de la incisión del PFV, tirando así de la transección de dcLN hacia la luz del PFV.
- Realice una sutura continua desde el borde inferior hasta el superior de la transección dcLN. Administre heparina sódica una vez más justo antes de completar la sutura final para evitar la formación de trombos dentro de la luz del PFV. Mantenga la tensión adecuada en la sutura durante el cierre continuo para garantizar un cierre seguro y evitar fugas posteriores.
- Coloque las suturas interrumpidas donde la anastomosis continua esté suelta.
5. Anastomosis de vasos linfáticos y venas
- Seccionar el ALV y preservar el tejido circundante para que sirva como punto de anclaje de sutura.
- Con una aguja de sutura 12-0, insértela unos 2 mm proximal a la incisión del PFV y avanzen para salir por la abertura de la incisión del PFV.
- Ingrese el tejido cerca del muñón de ALV con la aguja de sutura para atrapar el ALV.
- Pase la aguja dentro de la incisión del PFV y salga a través de su borde proximal, luego ate la sutura para fijar el muñón de ALV dentro de la luz del PFV.
NOTA: Inserte completamente el muñón de ALV en la luz del PFV, orientándolo hacia la dirección proximal para mantener el drenaje fisiológico. - Sutura el tejido circundante cerca del muñón de ALV hasta el borde interno de la incisión del PFV para proporcionar una fijación externa. Administre heparina sódica antes del último punto para mantener la luz del PFV libre de coágulos.
6. Sutura y cuidados postoperatorios
- Realizar suturas continuas para la fascia subcutánea y suturas interrumpidas para la epidermis.
- Desinfecte el área quirúrgica con tintura de yodo. Luego aplique ungüento de eritromicina uniformemente alrededor de la incisión para prevenir infecciones.
- En el postoperatorio, administre penicilina sódica (800.000 unidades/kg) mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante cinco días consecutivos para reducir el riesgo de infección.
7. Validación de la anastomosis
- Identificar y diseccionar la vena facial anterior (AFV), un afluente del EJV, lateral al PFV.
- Verifique el éxito de la anastomosis observando una tinción significativamente más intensa en el PFV en comparación con el AFV adyacente.
- Cuantifique los cambios de color de forma objetiva utilizando el espacio de color estandarizado CIE LAB. Defina y extraiga regiones de interés (ROI) en Fiji para obtener los valores medios de CIE L * a * b *, luego calcule el ángulo de tono (h °) en grados usando la fórmula:
h° = atan2(b, a) × (180/π)6,7.
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Resultados
Los procedimientos quirúrgicos y los resultados postoperatorios de dcLnVA y dcLaVA se ilustran con un caso representativo cada uno. En el caso de dcLnVA, se identificó PFV (2 mm de diámetro) y se disoció del borde lateral del SCM (Figura 1A, Figura S1A). En el espacio entre el SCM y el STM, aproximadamente 4 mm medial al PFV, se encontró un dcLN ovalado largo (5 mm × 4 mm × 2 mm) y se separó finamente (Figur...
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Discusión
En 2012, ILif et al. describieron por primera vez el sistema glinfático8. En 2015, Louveau et al. identificaron agregados de células T en la luz de los vasos linfáticos y denominaron a estas estructuras linfáticas meníngeas. Además, demostraron que los ganglios linfáticos meníngeos están conectados tanto con el sistema glinfático como con el dcLN. En resumen, bajo la regulación del sistema linfático cerebral, incluido el sistema linfático y los linfáticos meníngeo...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82173384 y 81773161), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Heilongjiang (2023ZX06C11) y el Proyecto del Fondo de Investigación Científica Médica de Genertec (TYYLKYJJ-2024-043).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina estéril al 0,9% | Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd. | R9824041307 | |
| Ungüento de eritromicina | Sanqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H34020307 | |
| Tinte azul Evans 5% (50mL) | LEAGENE | DK0053 | |
| Solución de heparina sódica 0,1% | BIOSCO | BAC006 | |
| Micropinzas | ANLIXIN | AT-15 | |
| Pinza microvascular | Tigergene | TG-AC-18-Z | |
| Penicilina sódica | Hebei Yuanzheng Hemu Pharmaceutical Co., Ltd | JFT230602 | |
| Vaselina blanca | Tiancheng y Tiancheng; | 20250202 |
Referencias
- Formolo, D. A., et al. Leveraging the glymphatic and meningeal lymphatic systems as therapeutic strategies in Alzheimer's disease: an updated overview of nonpharmacological therapies. Mol Neurodegener. 18 (1), 26(2023).
- Li, X., et al. Promising outcomes 5 weeks after a surgical cervical shunting procedure to unclog cerebral lymphatic systems in a patient with Alzheimer's disease. Gen Psychiatr. 37 (3), e101641(2024).
- Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).
- Fang, R., et al. A novel microsurgical model of cervical lymph node-to-vein anastomosis (LNVA) for studying brain lymphatic outflow. J Craniofac Surg. 36 (6), 2160-2163 (2025).
- Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
- Mazur, F., Han, Z., Tjandra, A. D., Chandrawati, R. Digitalization of colorimetric sensor technologies for food safety. Adv Mater. 36 (42), e2404274(2024).
- Karamucki, T., Rybarczyk, A., Jakubowska, M., Sulerzycka, A. A comparison of two methods of determining colour change in the assessment of the quality of pork. Acta Sci Pol Technol Aliment. 16 (3), 321-329 (2017).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Wang, M., et al. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 15 (1), 1453(2024).
- Proulx, S. T. Cerebrospinal fluid outflow: a review of the historical and contemporary evidence for arachnoid villi, perineural routes, and dural lymphatics. Cell Mol Life Sci. 78 (6), 2429-2457 (2021).
- Yoon, J. H., et al. Nasopharyngeal lymphatic plexus is a hub for cerebrospinal fluid drainage. Nature. 625 (7996), 768-777 (2024).
- Zhou, Y., et al. Impaired peri-olfactory cerebrospinal fluid clearance is associated with ageing, cognitive decline and dyssomnia. EBioMedicine. 86, 104381(2022).
- Papadopoulos, Z., et al. Differential impact of lymphatic outflow pathways on cerebrospinal fluid homeostasis. J Exp Med. 222 (2), e20241752(2025).
- Mehta, N. H., et al. The brain-nose interface: a potential cerebrospinal fluid clearance site in humans. Front Physiol. 12, 769948(2021).
- Norwood, J. N., et al. Anatomical basis and physiological role of cerebrospinal fluid transport through the murine cribriform plate. Elife. 8, e44278(2019).
- Fan, F., Zhao, N., Guo, M. Lymphatic-venous anastomosis: cracking the code of Alzheimer's disease treatment. Neural Regen Res. , (2025).
- Hong, J. P., Chen, W. F., Nguyen, D. H., Xie, Q. A proposed role for lymphatic supermicrosurgery in the management of Alzheimer's disease: a primer for reconstructive microsurgeons. Arch Plast Surg. 52 (2), 96-103 (2025).
- Nguyen, L., et al. Role of sigma-1 receptors in neurodegenerative diseases. J Pharmacol Sci. 127 (1), 17-29 (2015).
- Pierre, K., et al. Chronic traumatic encephalopathy: diagnostic updates and advances. AIMS Neurosci. 9 (4), 519-535 (2022).
- Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).
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