Artículo de método

Modelado de enfermedades mitocondriales utilizando organoides cerebrales: un enfoque en la encefalomiopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares a accidentes cerebrovasculares

DOI:

10.3791/69303

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10 de octubre de 2025

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1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides cerebrales sirven como un modelo valioso para los estudios de encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), ofreciendo información sobre su fisiopatología subyacente y proporcionando una plataforma para la detección de fármacos. Los organoides derivados de líneas celulares con diferentes niveles de heteroplasmia de genes causantes de enfermedades exhiben diferencias fenotípicas significativas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La encefalomiopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares a un accidente cerebrovascular (MELAS) son trastornos mitocondriales causados con mayor frecuencia por una variante m.3243A>G en el ARNtleu mitocondrial. Para investigar la fisiopatología de MELAS, generamos organoides cerebrales a partir de múltiples líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de un paciente con MELAS portador de la variante m.3243A>G. Estas líneas comparten un fondo genético nuclear idéntico, pero difieren en sus niveles de heteroplasmia que involucran la variante m.3243A>G. Observamos diferencias significativas en el tamaño de los organoides, la morfología y la eficiencia de la inducción neural, que se correlacionaron con el grado de heteroplasmia. Las neuronas disociadas de los organoides se transfirieron a un sistema de cultivo 2D, que es conveniente y adecuado para la detección de fármacos de alto rendimiento. Los organoides también exhibieron diferencias significativas en la formación de redes neuronales, dependiendo de los niveles de heteroplasmia. Nuestros resultados sugieren que los modelos de organoides basados en iPSC derivados de pacientes representan una plataforma útil para estudiar los mecanismos MELAS y para el cribado de fármacos. Este video presenta métodos completos y fáciles de usar, incluidos protocolos para generar organoides y evaluar fenotipos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La miopatía mitocondrial, la encefalopatía, la acidosis láctica y los episodios similares a un accidente cerebrovascular (MELAS) son enfermedades mitocondriales que se caracterizan por disfunción neurológica, episodios similares a accidentes cerebrovasculares y diversos síntomas sistémicos. La causa más común es una variante m.3243A>G en el gen del ARNt de leucina mitocondrial, MT-TL11. Se cree que esta variante perjudica la modificación de la taurina en el anticodón, reduciendo así la eficiencia de traducción de la leucina y contribuyendo a la disfunción mitocondrial en MELAS 2,3,4. En particular, se han informado mejoras en los síntomas después de la administración de taurina en dosis altas 5,6. Sin embargo, la presencia de no respondedores sugiere que mecanismos fisiopatológicos adicionales, aún no identificados, pueden contribuir a la enfermedad en individuos que albergan la variante m.3243A>G.

Para dilucidar los mecanismos de la enfermedad causados por variantes genéticas, es ideal utilizar modelos experimentales en los que todas las variables sean idénticas excepto la variante causal, lo que permite realizar comparaciones fenotípicas precisas. Las líneas celulares editadas por el genoma y los modelos animales con variantes corregidas se utilizan a menudo como controles de los trastornos genéticos nucleares. Sin embargo, la reparación de las variantes de ADNmt sigue siendo un desafío técnico, incluso con tecnologías avanzadas de edición del genoma7. Por lo tanto, el establecimiento de modelos experimentales con antecedentes nucleares idénticos sigue siendo un desafío. Para abordar este problema, utilizamos dos líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas del mismo paciente con MELAS que difieren solo en sus niveles de heteroplasmia (es decir, la proporción de ADN mitocondrial que lleva la variante 8 de MT-TL1 m.3243A>G), y generamos organoides cerebrales como modelo de enfermedad. Aunque los niveles de heteroplasmia pueden fluctuar durante el paso o la diferenciación celular, lo que puede influir en los fenotipos y causar variabilidad de lote a lote en los resultados experimentales, las células derivadas de pacientes portadoras de variantes genéticas mitocondriales siguen siendo valiosas para investigar la patogénesis de la enfermedad.

En este estudio, generamos organoides cerebrales a partir de iPSC derivadas de un paciente con MELAS e investigamos su fisiopatología para comprender mejor los mecanismos de la enfermedad. Utilizando dos líneas de iPSC con niveles altos y bajos de heteroplasmia, observamos diferencias significativas en la eficiencia de la inducción neural, que se correlacionaron con el grado de heteroplasmia. Nuestros hallazgos sugieren que los organoides cerebrales basados en iPSC derivados de pacientes proporcionan una plataforma valiosa para dilucidar los mecanismos subyacentes a MELAS y para facilitar la detección de fármacos.

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Protocolo

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Las dos líneas de iPSC (2-6 y 2-8) se derivaron de los fibroblastos del mismo paciente MELAS utilizando métodos bien establecidos8. Se diferencian solo en sus niveles de heteroplasmia. Se utilizó como control la línea 414C2 iPSC establecida a partir de un individuo sano. El protocolo utilizado en este estudio siguió las directrices del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kitasato (#G22-02).

1. Cultivo celular

  1. Descongelación de las existencias de células congeladas
    1. Prepare placas de 6 pocillos recubriendo con laminina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Caliente el medio de cultivo para iPSC sin alimentador que contengan 10 μM de inhibidor de ROCK a 37 °C.
    3. Recupere el vial de iPSC congelado del tanque de nitrógeno líquido (LqN2) y descongele rápidamente en un baño de agua a 37 °C.
    4. Transfiera la suspensión descongelada a 10 ml de medio precalentado. Centrifugar a 120 × g durante 5 min a temperatura ambiente (22 °C).
    5. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el gránulo golpeando el tubo. Agregue el medio fresco y las células de semilla en placas de 6 pocillos precubiertas con laminina. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
  2. Cambio medio
    1. Reemplace el medio (sin inhibidor de ROCK) cada 1-2 días.

2. Generación de organoides cerebrales

  1. Inicio de la diferenciación (Día 0)
    1. Retire el medio de las placas de cultivo iPSC (~70-80% confluente). Lave las células con PBS.
    2. Añadir la solución enzimática e incubar a 37 °C durante 5 min.
    3. Agregue medio para detener la reacción. Transfiera las células a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 190 × g durante 5 min a temperatura ambiente (22 °C).
    4. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio de diferenciación que contenga 30 μM de inhibidor de ROCK, 5 μM de SB431542 y 2,5 μM de IWP-2.
      NOTA: El medio básico es el mismo que el utilizado en el paso 1.1.2.
    5. Cuenta las células. Siembre 3 × 103 células en 100 μL por pocillo en placas en forma de U, de 96 pocillos y de baja adhesión. Incubar durante 6 días a 37 °C, 5% CO2.
  2. Cambio medio (Día 6)
    1. Transfiera los organoides (desde el paso 2.1.5) de una placa de 96 pocillos a un plato de 10 cm utilizando una pipeta de gran diámetro. Agregue 50 μL de medio (DMEM/F12 con 1% de N2, 1% de sustituto de glutamina 1% NEAA, 2,5 μM IWP-2, 5 μg/mL de sulfato de heparán y 1% de PS) a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos.
      NOTA: Utilice pipetas de gran calibre durante los experimentos al transferir organoides para evitar alterar su estructura 3D. Además, las pipetas de 8 canales son útiles para realizar experimentos de forma rápida y precisa.
    2. Recoja los organoides en tubos de 2 ml. Retirar con cuidado el medio para no aspirar los organoides y añadir 1,5 ml de DMEM/F12. Repita 3 veces para lavar los organoides.
    3. Retire el medio y agregue 500 μL de medio fresco a los tubos con organoides. Transfiera todos los organoides a un plato de 10 cm, luego agregue 5 ml de medio para que sea más fácil recoger cada organoide.
    4. Tome un solo organoide con una micropipeta ajustada a 50 μL y transfiéralo a un pocillo de placa de 96 pocillos. Repita hasta que todos los organoides se transfieran a la placa de 96 pocillos (volumen final de 100 μL). Incubar durante 3 días a 37 °C, 5% CO2.
  3. Cambio medio (Día 9)
    1. (Opcional) Transfiera los organoides a un plato de 10 cm cuando utilice pipetas de 8 canales. Omita el paso 2.3.1 cuando utilice micropipetas monocanal y continúe con el paso 2.3.2.
    2. Recoja los organoides en tubos de 2 ml. Lavar 3 veces con DMEM/F12 como paso 2.2.2.
    3. Resuspender en medio de diferenciación (1:1 DMEM/F12 y neurobasal) que contiene 1% de N2, 2% de B27 sin vitamina A, 100 μM de 2-mercaptoetanol (EM), 2,5 μg/mL de insulina, 1% de sustituto de glutamina, 0,5% de NEAA y 1% de extracto de membrana basal.
      NOTA: Prepare pequeñas alícuotas de extracto de membrana basal para un solo uso y guárdelas a -20 °C hasta que las necesite. Descongele el extracto a 4 °C sin dejar que supere los 8 °C, luego mézclelo con un medio frío y caliente el medio a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min.
    4. Transfiera ~ 10 organoides por pocillo a una placa de 6 pocillos. Ajuste el volumen final del medio para 1 pocillo a 2 ml. Cultivar estáticamente durante 6 días a 37 °C, 5% CO2.
  4. Cambio medio (Día 15)
    1. Recoja los organoides en tubos de 15 ml. Deje el tubo intacto hasta que todos los organoides se hayan asentado. Retire el sobrenadante y agregue un medio de diferenciación fresco (igual que el paso 2.3.3 pero con B27 + vitamina A).
      NOTA: Por lo general, los organoides se depositan en el fondo del tubo sin centrifugación. Sin embargo, los organoides pequeños derivados de las iPSC de los pacientes pueden no hundirse de manera eficiente. En ese caso, centrifugar los tubos a 120 × g durante 3 min a temperatura ambiente para recoger los organoides.
    2. Transfiera ~ 10 organoides por pocillo a una placa de 6 pocillos. Cultivo estático durante 15 días a 37 °C, 5% CO2.
    3. Reemplace el medio cada 5-7 días hasta el día 30.

3. Disociación de organoides cerebrales para cultivo 2D (Día 30)

  1. Placas de recubrimiento con poli-L-ornitina (PO)
    1. Preparar la solución madre PO disolviendo 10 mg de PO en 66,7 ml de H2O y hacer pequeñas alícuotas para un solo uso. Guárdelos a -20 °C hasta su uso.
    2. Diluir la solución madre PO 1:5 con H2O y recubrir las placas de cultivo con la solución diluida. Incubar durante la noche a 37 °C.
  2. Recubrimiento de laminina
    1. Retire los PO y lave bien 3 x 5 min con PBS.
    2. Añadir laminina (1:1.000 en PBS) e incubar a 37 °C durante 3 h o toda la noche.
      NOTA: La solución madre de laminina es de 1 mg/ml. Preparar pequeñas alícuotas y almacenar a -80 °C hasta que se necesiten.
  3. Disociación en neuronas individuales
    1. Descongele la solución de disociación a 4 °C durante 1 h antes de su uso.
    2. Transfiera los organoides a un tubo de 15 ml y déjelo intacto hasta que todos los organoides se hayan asentado. Retire el sobrenadante y agregue 5 ml de PBS para enjuagar los organoides.
    3. Después de retirar el PBS, añadir 1 ml de solución enzimática y pipetear suavemente 1-2 veces. Incubar a 37 °C durante 5 min; pipeta varias veces. Si es necesario, incube durante 2-3 min más. Pipetear nuevamente para una disociación completa.
    4. Centrifugar a 200 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante, agregue 1 ml de solución de dispersión y pipete.
    5. Capa de solución aislante debajo y centrifugar a 200 × g durante 5 min.
    6. Agregue 1 ml de medio neuronal (neurobasal con 1% de B27, 0,25% de sustituto de glutamina, 1% de PS) y mezcle. Pase la suspensión a través de un filtro de 70 μm en un tubo de 50 ml.
    7. Cuenta las células. Células de semillas a 1 × 105 células/cm2 en placas recubiertas de PO/laminina. Reemplace el medio cada 4-7 días hasta el día 60.

4. Recolección de células y organoides para análisis celular y molecular

  1. Fijación de organoides para inmunofluorescencia (Día 30)
    1. Cosecha los organoides (paso 2.4.3) en microtubos.
    2. Retire el medio con cuidado para no aspirar los organoides y agregue 1 ml de PBS para enjuagar los organoides.
    3. Retire el PBS con cuidado para no aspirar los organoides y agregue paraformaldehído (PFA) al 4% para fijar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    4. Lavar 3 veces con PBS.
    5. Conservar a 4 °C hasta su uso.
  2. Recogida de organoides para RT-qPCR (día 30)
    1. Transfiera los organoides (paso 2.4.3) a microtubos. Lavar con PBS como se describe en el paso 4.1.2.
    2. Agregue tampón de lisis y congele rápidamente en nitrógeno líquido (LqN2). Almacenar a -80 °C hasta su uso.
  3. Fijación celular para inmunofluorescencia (Día 60)
    1. Retire el medio de cultivo y agregue PBS a las células de lavado.
    2. Fijar en PFA al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
    3. Retire el PFA y agregue PBS a las células de lavado. Repita este paso 3 veces.
    4. Conservar a 4 °C hasta su uso.

5. RT-qPCR

  1. Extraiga el ARN total de los organoides de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit.
  2. Sintetice ADNc a partir de 1 μg de ARN total preparado en el Paso 5.1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit en un volumen total de reacción de 20 μL.
  3. Realice PCR cuantitativa utilizando los siguientes cebadores: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Configure la concentración final para cada reacción de la siguiente manera: 1x mezcla maestra fluorescente, cebador directo de 0,25 μM, cebador inverso de 0,25 μM. El volumen total de reacción es de 15 μL, incluidos 0,2 μL de ADNc del Paso 5.2. Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s.
  4. Normalice la expresión de FOXG1 a ACTB como control interno.

6. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Incubar organoides (día 30) en sacarosa al 10% durante 1 h a 4 °C, luego sacarosa al 30% durante ≥3 h a 4 °C.
  2. Monte los organoides en el medio de inclusión y prepare la criosección (10 μm) con criostato. Guarde las secciones en vasos deslizantes a -20 °C hasta su uso.
  3. Retire el medio de inclusión con el lavado PBS (2 x 5 min).
  4. Permeabilizar en PBST al 0,3% durante 10 min. Lavar con PBS.
  5. Bloquear en suero de cabra normal al 10% en PBST al 0,1% durante 1 h. Incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). Lavar 3 veces con PBS.
  6. Incubar con anticuerpo secundario (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) durante 1 h. Lavar 3 veces con PBS.
  7. Monta y observa bajo un microscopio confocal.

7. Análisis de heteroplasmia

  1. Coseche iPSC utilizando raspadores celulares y transfiéralos a microtubos. Añadir 0,5 mL de PBS y centrifugar a 100 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y continúe con el paso 7.2.
  2. Extraiga el ADN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit.
  3. Configure la concentración final para cada reacción de PCR: 1x mezcla maestra fluorescente, cebador directo de 0,25 μM, cebador inverso de 0,25 μM. El volumen total de reacción es de 15 μL, incluidos 50 ng de ADN total del Paso 7.2. Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s. Las secuencias de cebadores son las siguientes: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ reenvío: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ reverso: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Utilice los valores del ciclo umbral para calcular el número de copias de ADN mitocondrial (mutante frente a tipo salvaje).
  5. Normalizar al número de copias del gen nuclear FBXO15 .

8. Evaluación del tamaño y la forma de los organoides

  1. Capture imágenes de organoides utilizando un microscopio con formato TIFF.
  2. Mida el tamaño y la circularidad utilizando un software de análisis de imágenes de código abierto. Abra los archivos TIFF guardados en el paso 8.1 haciendo clic en Archivo | Abra y seleccione el archivo. Elija Selecciones a mano alzada y trace el organoide. Luego haga clic en Analizar | Medir. Los valores de Área y Circularidad en los resultados se utilizaron para el análisis en el Paso 8.3.
  3. Analice los datos realizando una prueba t para evaluar si existen diferencias significativas en comparación con las líneas de control utilizando software estadístico.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generamos organoides cerebrales y realizamos cultivos neuronales 2D utilizando un protocolo relativamente simple con modificaciones menores basadas en Nakamura et al.9 (Figura 1). En el protocolo anterior, se utilizaron placas de 96 pocillos en forma de V, mientras que en este estudio, utilizamos placas de baja adherencia de 96 pocillos en forma de U para permitir que las células se agreguen naturalmente en el centro de cada pocillo. ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides inducidos a partir de células madre embrionarias humanas (ESC)/iPSC representan modelos de enfermedades prometedoras para enfermedades raras intratables, mientras que la generación de organoides cerebrales generalmente requiere períodos de cultivo prolongados que duran varios meses10 y el uso de equipos costosos, como un recipiente diseñado que agita continuamente el medio de cultivo y mantiene condiciones estables para el cultivo celular 3D a largo...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las iPSC 414C2 se obtuvieron de RIKEN BRC. El apoyo financiero fue proporcionado por JSPS KAKENHI (24H00648 a MF, 23K08971 a CS) y el Programa de la Red de Investigación Traslacional AMED (25yf0126001j002 a MF). Este trabajo fue apoyado por una beca del Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) a F.B.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
plato de cultivo celular de 10 cmCorning353003
Superficie de sujeción ultra baja de placa de 6 pozosCorning3471
70 y mu; Colador de células MCorning352350
AccutaseNacalai Tesque12679-54enzimas utilizadas para disociar iPSCs
Suplemento de B27Thermofischer Scientific17504001
Suplemento de B27 sin vitamina AThermofischer Scientific12587010
β-mercaptoetanol (2-ME)sigmaM3148Desecha según las normas de la institución.
Cultivo Celular con 6 pozos multiplacaCorning353046
Punta de Cell SaverBMBio ECOBMT-200WPunta de pipetto de gran diámetro
Raspadores de celdaSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Microscopio confocalZeissLSM710
CriostatoLeicaCM3050
Laminina 1 de ratón de cultivoR& D3400-010-02Utilizado para recubrir placas de cultivos 2D de neuronas disociadas
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Medio de montaje de fluorescenciaDAKOS302380-2Medio de montaje
Anticuerpo FOXG1ABCAMab196868
GlutamaxThermofischer Scientific35050061
Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado contra IgG de cabra (H+L), Alexa Fluor Plus 488Thermofischer ScientificA32723
Anti-IgG anticonejo de cabra (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor Plus 555Thermofischer ScientificA32732
Sulfato de Heparán (HS)sigmaH7640
Kit de ARN a ADNc de alta capacidadThermofischer Scientific4387406Usado para sintetizar ADNc a partir de ARN
Hoechst 33258Thermofischer ScientificH3569
ImageJVersión 1.52AUtilizado para medir el tamaño y la circularidad de organoides
Seda iMatrix-511Takara Bio Inc.892021recubrimiento para placas para cultivo iPSC
insulinaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810utilizado para capturar imágenes para la Figura 3A
LSM710Carl Zeiss AGMicroscopio confocal
LSM980Carl Zeiss AGMicroscopio confocal
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
Suplemento N2Thermofischer Scientific17502001
Medio neurobasalThermofischer Scientific21103049
Solución de disociación neuronal  FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
aminoácidos no esenciales (NEAA)Nacalai Tesque06344-56
Suero normal para cabraJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Pozo, Microplaca Tratada con Esfera Nunclon, Fondo en UThermofischer Scientific174929
Paraformaldehído (PFA)Nacalai Tesque09154-85Desecha según las normas de la institución.
PBSNacalai Tesque14249-24
PBSNacalai Tesque27575-31
penicilina/estreptomicina (PS)Nacalai Tesque26253-84
Poli-L-ornitina (PO)sigmaP3655
Éter octilfenólico polioxietileno(10)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadVersión 9.5.0
QIAamp Mini Kit de ADN  QIAGEN51304Usado para extraer ADN total
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Utilizado para extraer ARN total
SB-431542Cayman Chemical13031
Gafas deslizantesMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nmedio utilizado para la cultura de iPSCs indiferenciados y desde la diferenciación del Día 0 al Día 6
SacarosaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Medio de criopreservación
Anticuerpo TUBB3PromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021Inhibidor de ROCK
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (edición negra)software para analizar las imágenes tomadas   con microscopio confocal (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (edición azul)software para analizar las imágenes tomadas   con microscopio confocal (LSM980)

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
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