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Artículo de investigación

El gránulo de Ganzhirong inhibe la gluconeogénesis hepática a través del eje SIRT3-MPC1-PC/PDH en la diabetes tipo 2

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DOI:

10.3791/69500

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12 de diciembre de 2025

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio investigó si el gránulo de Ganzhirong mejora la hiperglucemia en la diabetes tipo 2 al inhibir la gluconeogénesis hepática a través del eje SIRT3-MPC1-PC/PDH.

Resumen

La diabetes mellitus tipo 2 (DT2DM) es un trastorno metabólico global caracterizado por resistencia hepática a la insulina y gluconeogénesis excesiva. El Gránulo de Ganzhirong (GZRG), una fórmula de medicina tradicional china, ha demostrado potencial para gestionar la diabetes tipo 2, pero sus mecanismos subyacentes, especialmente en lo relativo a la gluconeogénesis hepática, siguen sin estar claros. Este estudio investigó si la GZRG mejora la hiperglucemia modulando la vía de señalización mediada por SIRT3. Los efectos antidiabéticos de la GZRG se evaluaron en ratones T2DM inducidos por dietas altas en grasas (HFD) y en células de HepG2 resistentes a la insulina inducidas por ácidos grasos libres (FFA). Se evaluaron parámetros metabólicos, tolerancia a glucosa y piruvato, sensibilidad a la insulina y perfiles lipídicos. Se exploraron mecanismos moleculares mediante la sobreexpresión y knockdown de SIRT3, examinando la expresión de proteínas clave (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 y G6Pase) en la vía gluconeogénica. El tratamiento con GZRG mejoró significativamente la hiperglucemia, aumentó la sensibilidad a la insulina y mejoró el metabolismo lipídico tanto en ratones con diabetes tipo 2 como en células HepG2 resistentes a la insulina (IR). Atenuó la esteatosis hepática y suprimió la gluconeogénesis. Mecánicamente, GZRG redujo la expresión de SIRT3, lo que llevó a reducciones concomitantes en los niveles de MPC1 y PC y a un aumento de PDH-E2. Este cambio en la expresión proteica desvió el metabolismo del piruvato lejos de la gluconeogénesis. La sobreexpresión de SIRT3 revirtió los efectos supresores de GZRG sobre la gluconeogénesis, mientras que el knockdown de SIRT3 sinergizó con GZRG. GZRG alivia la DT2DM inhibiendo la gluconeogénesis hepática a través del eje SIRT3-MPC1-PC/PDH. Estos hallazgos esclarecen un mecanismo molecular novedoso de la GZRG y destacan SIRT3 como un posible objetivo terapéutico para el manejo de la DM2.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) se ha convertido en uno de los trastornos metabólicos crónicos más prevalentes y debilitantes a nivel mundial, suponiendo una carga considerable para la salud pública y la economía 1,2. Caracterizada por resistencia a la insulina (RI) y disfunción progresiva de las células β pancreáticas, la DT2DM está principalmente impulsada por una homeostasis alterada de la glucosa ylos lípidos 3,4. Entre los múltiples órganos implicados en la regulación de la glucosa, el hígado desempeña un papel central al controlar la producción endógena de glucosa mediante glicogenólisis ygluconeogénesis 5. La gluconeogénesis hepática excesiva es un factor importante en la hiperglucemia en ayunas, una característica distintiva de la fisiopatología de la diabetes tipo 2, y representa un objetivo terapéutico crucial para restaurar el equilibrioglucérmico 6.

Los agentes hipoglucémicos actuales —incluyendometformina 7, tiazolidinediones8, agonistas del receptor GLP-19 e inhibidoresSGLT2 10— logran el control glucémico mediante mecanismos distintos, pero su uso a largo plazo suele estar limitado por efectos adversos, disminución de la eficacia o intolerancia al tratamiento. En consecuencia, existe un interés creciente en enfoques terapéuticos complementarios u alternativos que puedan atacar de forma segura y eficaz múltiples vías metabólicas. La medicina tradicional china (MTC), caracterizada por sus propiedades farmacológicas multicomponente y multi-objetivo, ofrece perspectivas prometedoras para el manejo de enfermedades metabólicas complejas como la DM2 11,12,13,14,15. Se ha reportado que varias formulaciones clásicas de la MTC mejoran la resistencia a la insulina, mejoran el metabolismo lipídico y suprimen la gluconeogénesis hepática mediante mecanismos reguladoresintegrados 16,17.

El gránulo de ganzhirong (GZRG) es una fórmula estandarizada de MTC con historial de uso clínico en el manejo de trastornos metabólicos. GZRG es una formulación herbal compuesta por ocho hierbas medicinales. Basándose en nuestras investigaciones fitoquímicas y farmacológicas previas, se ha identificado una variedad de compuestos bioactivos en GZRG, incluyendo pero no limitándose a ácido salvianólico B, D-estaquiosa, proantocianidinas, ácido oxálico violeta, ácido salvianólico A, ácido salvianólico C, glucosa calicosina 7, 3′-metoxipuerarina, 3′-hidroxi puerarina, apigenina-7-o-beta-d-pirano, emodina-8-O-β-D-glucosa, crisófano-1-O-glucosido, crisofanol-8-O-glucósido, puerarina, ácido rosmarino, criptotansinona, catequina, Ft-niflavina, calicosina, Rin, guanosina, ácido oleico, emodina de aloe, formononetina, ácido palmítico, crisófano, d-triptófano, danshensu, ácido ferúlico, manitol, ácido galo y L-fenilalanina. Una ventaja fundamental de la medicina tradicional china (MTC) en el manejo de la diabetes tipo 2 radica en sus acciones sinérgicas multicomponentes y multi-objetivo. Las decenas de componentes activos contenidos en GZRG probablemente interactúen con múltiples procesos biológicos —como las vías de señalización de la insulina, el metabolismo del glucógeno y las respuestas inflamatorias— produciendo así un efecto de red integrado que no puede replicarse adecuadamente con ningún compuestopurificado 18. Investigaciones previas han demostrado que la GZRG ejerce efectos beneficiosos sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos en modelosdiabéticos 19; sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que subyacen a estos efectos siguen sin estar claros. En particular, aún no se ha aclarado si GZRG ejerce sus acciones antidiabéticas modulando la señalización gluconeogénica hepática.

La sirtuina 3 (SIRT3), una deacetilasa mitocondrial dependiente de NAD⁺, es un regulador fundamental de la homeostasis energéticacelular 20. Al desacetilar y activar enzimas metabólicas clave, SIRT3 influye en la fosforilación oxidativa mitocondrial, la oxidación de ácidos grasos y lagluconeogénesis 21. La expresión aberrante de SIRT3 ha sido implicada en la patogénesis de la resistencia a la insulina, hígado graso yDT2DM 22,23. La evidencia indica que la sobreexpresión hepática de SIRT3 aumenta el flujo gluconeogénico mediante la modulación de enzimas como el portador mitocondrial de piruvato 1 (MPC1)24, piruvato carboxilasa (PC)25, piruvato deshidrogenasa (PDH)26, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK1)27 y glucosa-6-fosfatasa (G6Pase)28. Así, el control mediado por SIRT3 del metabolismo del piruvato representa un nexo crítico que vincula la función mitocondrial y la producción hepática de glucosa, lo que convierte a SIRT3 en un objetivo atractivo para la intervención terapéutica en la DM2.

Dado los efectos metabólicos establecidos de los constituyentes bioactivos en el GZRG, junto con el papel central de SIRT3 en la homeostasis de la glucosa hepática, se planteó la hipótesis de que el GZRG mejora la hiperglucemia en el DMT T2 mediante la modulación de la vía gluconeogénica mediada por SIRT3. Para evaluar esta hipótesis, se evaluaron los efectos de la GZRG sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos en ratones T2DM inducidos por dietas altas en grasas (HFD) y en células HepG2 resistentes a la insulina inducidas por ácidos grasos libres (FFA). Investigaciones posteriores examinaron la implicación del eje de señalización SIRT3-MPC1-PC/PDH en la mediación del efecto supresor del GZRG sobre la gluconeogénesis hepática. Este estudio tiene como objetivo esclarecer los mecanismos moleculares que sustentan los beneficios metabólicos de la GZRG y proporcionar evidencia experimental que respalde su potencial terapéutico como modulador multi-diana para el manejo de la DMT T2.

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Protocolo

El protocolo de estudio animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Medicina China de Changchun (nº de aprobación 2024396). Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices nacionales y las leyes nacionales pertinentes sobre la protección animal.

Fármacos experimentales
El GZRG (número de lote 26210483) fue proporcionado por el Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Changchun (Jilin, China). Los principales constituyentes bioactivos y parámetros de control de calidad de GZRG fueron caracterizados en un estudioanterior 18.

Reactivos y anticuerpos
Se utilizaron kits comerciales de ensayos para cuantificar glucosa, glucógeno, ácidos grasos no esterificados (NEFAs), triglicéridos (TG), colesterol total (TC), colesterol lipoproteico de alta densidad (HDL) y colesterol lipoproteico de baja densidad (LDL). También se obtuvieron comercialmente kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para hemoglobina e insulina glicosiladas. También se obtuvieron comercialmente kits ELISA para piruvato deshidrogenasa (PDH) y piruvato carboxilasa (PC). Para trabajos de ARN y ADNc, se adquirieron comercialmente el Kit de Tejido/Célula de ARN, el PreMix qPCR y el SuperMix RT de ADNg. La transfección se realizó utilizando un reactivo de transfección. Anticuerpos primarios contra SIRT3 (RRID: AB_2837621), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, glucosa-6-fosfatasa (G6Pase; RRID: AB_2845572), portador de piruvato mitocondrial 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; RRID: AB_2833041) se adquirieron a un proveedor comercial.

Ratones y tratamientos
Los ratones machos C57BL/6J (5-6 semanas) fueron obtenidos de Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. y mantenidos bajo condiciones estándar (22 ± 2 °C, 50%-60% de humedad, ciclo claro/oscuro de 12 horas) con libre acceso a alimentos y agua. Tras un periodo de aclimatación de una semana, seis ratones fueron designados aleatoriamente como grupo control (Con) y alimentados con una dieta estándar de comida. Los ratones restantes recibieron una dieta alta en grasas (HFD) durante 12 semanas para inducir obesidad y resistencia a la insulina.

En la semana 13, ratones con un nivel de glucosa en sangre a ayunas (GFA) ≥ 11,1 mmol/L fueron clasificados como modelos exitosos de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Estos ratones diabéticos se asignaron aleatoriamente en cinco grupos experimentales (n = 6 por grupo): el grupo modelo de HFD, el GZRG de baja dosis (L-GZRG, 3,2 g/kg/d), el GZRG de dosis media (M-GZRG, 6,4 g/kg/d), el GZRG de alta dosis (H-GZRG, 12,8 g/kg/d) y la metformina (Met, 0,2 g/kg/d). GZRG y Met se administraban diariamente por gavage oral durante 8 semanas. Los grupos modelo Con y HFD recibieron volúmenes equivalentes de agua destilada. Al finalizar el periodo de tratamiento, se recogieron muestras de sangre y tejido hepático de todos los ratones para su posterior análisis.

Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT), prueba de tolerancia a piruvato (PTT) y prueba de tolerancia a la insulina (ITT)
Se realizaron pruebas de tolerancia metabólica entre las 6 y 8 semanas después del inicio de los tratamientos farmacológicos. Para el IPGTT y el PTT, los ratones ayunaron durante la noche (aproximadamente 16 horas). Para el ITT, se implementó un periodo de ayuno más corto de 4 horas. Tras el ayuno, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de glucosa (2 g/kg para IPGTT), piruvato de sodio (2 g/kg para PTT) o insulina humana regular (1 U/kg para ITT). Los niveles de glucosa en sangre se midieron a partir de muestras de sangre de la vena caudal a 0 min, 30 min, 60 min, 90 min y 120 min tras la inyección utilizando un glucómetro calibrado.

Análisis bioquímico y ensayos de actividad enzimática
Se determinaron los niveles de glucosa en ayunas (FBG), hemoglobina A1c (HbA1c) e insulina (INS) utilizando kits comerciales de ensayo según las instrucciones del fabricante. La Evaluación del Modelo Homeostático de la Resistencia a la Insulina (HOMA-IR) se calculó utilizando la fórmula:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

Se cuantificaron los niveles circulantes de NEFAs, TG, TC, LDL-C, HDL-C y las actividades enzimáticas de PDH y PC en tejidos hepáticos utilizando los respectivos kits comerciales.

Análisis histopatológico de tejidos hepáticos
Los tejidos hepáticos frescos se fijaron en formalina tampón neutro al 10% durante 24 horas, seguido de un procesamiento estándar para la incrustación de parafina. Se cortaron secciones (5 μm de grosor) y se teñieron con hematoxilina y eosina (H&E) para una evaluación morfológica general. Para la visualización de lípidos, se incrustaron muestras hepáticas seleccionadas en un compuesto de Temperatura Óptima de Corte (OCT), se congelaron de inmediato, se criosecaron y se teñieron con Oil Red O.

Cultivo celular y tratamiento
La línea celular de hepatoma humana HepG2 fue obtenida de la Colección de Cultivo Tipo de la Academia China de Ciencias (China). Las células se cultivaron en Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% deCO2.

Para establecer un modelo in vitro de resistencia a la insulina (IR), se trataron células con confluencia del 70%-80% durante 24 horas con una mezcla de ácidos grasos libres (FFA) que comprendía ácido oleico y ácido palmítico en una proporción molar de 2:1, basada en un método previamente reportado con modificacionesmenores 29. Tras la inducción con FFA, el medio de cultivo fue reemplazado por un MEM fresco que contenía la misma mezcla FFA junto con varias concentraciones de GZRG para una incubación adicional de 24 horas.

Ensayo de viabilidad celular (CCK-8)
Las células HepG2 en fase de crecimiento logarítmico fueron recolectadas y sembradas en placas de 96 pozos con una densidad de 1 x 104 células por pozo. Los pozos periféricos se llenaron con 100 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para minimizar la evaporación. Tras una incubación nocturna para asegurar la adherencia, las células se trataron según el diseño experimental. Tras el tratamiento, se añadieron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pozo, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C. La absorbancia a 450 nm se medía usando un lector de microplacas. La viabilidad celular se calculó como:

[(Como - Lab) / (Ac - Lab)] x 100%

donde As es la absorbancia de la muestra, Ac es la absorbancia de la célula de control (células sin tratar), y Ab es la absorbancia del vacío (pozos sin celdas).

Transfección de plásmidos en células de HepG2
El plásmido de sobreexpresión de SIRT3 (OV-SIRT3) y tres plásmidos de ARN interferentes pequeños y distintos dirigidos a SIRT3 (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), junto con un siRNA control negativo (si-NC), fueron construidos por un fabricante. Las transfecciones se realizaron utilizando un reactivo de transfección cuando las células alcanzaron una confluencia del 50%-60%. El complejo de transfección se preparó en condiciones estériles de la siguiente manera: la solución A se generó diluyendo 1 μg de ADN plasmídico en 250 μL de medio sérico reducido con mezcla suave. La solución B se preparó diluyendo 2-3 μL de reactivo de transfección en 250 μL de medio sérico reducido, seguida de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos sin vórtice. Las dos soluciones se combinaron, mezclaron suavemente mediante pipeteo e incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para formar complejos ADN-lípidos. Para la transfección, 1 hora antes del procedimiento, se aspiró el medio de cultivo celular, se lavaron las células con PBS y se añadió 1 mL de medio sérico reducido (sin suero ni antibióticos). Luego, se añadieron 500 μL del complejo de transfección gota a gota a cada pozo, y la placa de cultivo se giró suavemente para asegurar la homogeneidad. Las células se incubaron a 37 °C durante 4-6 horas, tras lo cual el medio se sustituyó por medio completo para mitigar la citotoxicidad. Posteriormente, se cultivaron células durante 24-48 horas adicionales antes de un análisis adicional. La eficiencia de la transfección se evaluó mediante PCR cuantitativa (qPCR). El ARN total se extrajo, se transcribe inversamente en ADNc y se amplificaba utilizando cebadores específicos de SIRT3 con 18S rRNA como control interno. Se determinaron los niveles relativos de expresión mediante el método ΔΔCt, y se seleccionó el constructo de siRNA más eficaz para experimentos posteriores basándose en estos resultados.

Tinción en rojo O de aceite para acumulación intracelular de lípidos
Las células HepG2 en fase de crecimiento logarítmico se siembraron en placas de 24 pozos a una densidad de 2 x 105 células por pozo e indujeron con un medio lipídico alto que contenía 250 μM ácido oleico y 250 μM ácido palmítico durante 48 horas para establecer el modelo de acumulación lipídica. Tras los tratamientos, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 10% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras un enjuague con agua destilada y una breve inmersión en isopropanol al 60%, las células se teñieron con una solución de trabajo de Aceite Red O recién preparada (obtenida mezclando los componentes A1 y A2 en una proporción 3:2) durante 10-15 minutos. El exceso de colorante se eliminaba lavándolo con isopropanol al 60%, seguido de agua destilada. Los núcleos se contra-tintuvieron con hematoxilina de Mayer (1,0 g/L) durante 1-2 minutos. Tras un lavado final, se montaron células con gelatina de glicerol y se capturaron imágenes con un microscopio óptico a una magnificación de 200x para la evaluación cualitativa de las gotas lipídicas.

Inducción de resistencia a la insulina y cuantificación de glucosa en células HepG2
Las células de HepG2 se cultivaron en placas de 24 pozos con una densidad de siembra de 2 x 105 células por pozo para establecer un modelo in vitro de resistencia a la insulina. Tras 24 horas de tratamiento, se recogió el sobrenadante del cultivo para su análisis posterior. Para la medición intracelular de glucosa, las suspensiones celulares se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartaba y la pastilla celular se lavaba una o dos veces con un tampón isotónico, seguida de centrifugación bajo las mismas condiciones. El pellet se homogeneizó entonces en 0,2 a 0,3 mL de medio de homogeneización y se sometió a una interrupción ultrasónica en un baño de agua con hielo usando una sonda de 300 W, con pulsos de 3-5 s seguidos de intervalos de 30 s, repetidos 3 a 5 veces. El homogeneado resultante se ensayó directamente sin centrifugación adicional. Los niveles de glucosa tanto en el sobrenadante de cultivo como en el homogenato celular se midieron utilizando un kit estandarizado de análisis de glucosa según las instrucciones del fabricante, para asegurar una evaluación precisa y reproducible de las respuestas metabólicas.

Medición del contenido de triglicéridos celulares
Las células de HepG2 se recogían por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos, y el sobrenadante se descartaba. El pastillo celular se lavó 1 o 2 veces con un tampón de fosfato isotónico (0,1 M, pH 7,0-7,4), seguido de centrifugación bajo las mismas condiciones. Tras la retirada del sobrenadante, el pellet fue resuspendido y homogeneizado con 0,2-0,3 mL de etanol absoluto. El homogeneado fue sometido a una interrupción ultrasónica sobre hielo (300 W, 3-5 s por ráfaga, intervalos de 30 s, repetidos 3-5 veces). El homogeneado resultante se utilizó directamente para análisis posteriores sin centrifugación adicional. Se montó una placa de 96 pozos con pozos en blanco, estándar y de muestra. Tras una mezcla exhaustiva, la placa se incubó a 37 °C durante 10 minutos, y la absorbancia se midió a 500 nm usando un lector de microplacas. El contenido de triglicéridos en las muestras celulares se calculó a partir de una curva estándar derivada de diluciones seriadas de estándares de glicerol.

Medición del contenido total de colesterol
Las células HepG2 (5 x 106) se lisaron en 1 mL de tampón de extracción mediante interrupción ultrasónica sobre hielo. El homogenado se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se recogió para su análisis inmediato. Se preparó una solución estándar de colesterol (50 μmol/mL) y se diluyó en serie para generar una curva estándar (0,3125 a 10 μmol/mL). Se preparó una solución cromogénica funcional mezclando los reactivos uno, dos y tres proporcionados en el kit de análisis de colesterol, y se precalentó a 37 °C. Se mezclaron muestras o estándares con la solución de trabajo, incubaron a 37 °C durante 30 minutos y la absorbancia se midió a 500 nm. El contenido de colesterol se calculó según la curva estándar.

Tinción por inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubiertas se enjuagaron con PBS bien frío y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras los lavados con PBS, las células se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos y se bloquearon con 5% de BSA a 4 °C durante la noche. Las células se incubaron con un anticuerpo anti-SIRT3 primario (dilución 1:500) a 4 °C durante la noche. Tras los lavados de PBS, las células fueron incubadas con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia (dilución 1:2000) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se teñieron con DAPI (0,5 μg/mL) durante 10 minutos. Las cubiertas se montaban sobre portaobjetos de vidrio usando un medio de montaje anti-desvanecimiento y se visualizaban bajo un microscopio de fluorescencia.

Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
El ARN total se extrajo de las células utilizando el Kit de Tejido de ARN/Células. Se extrajo ADN genómico y se sintetizó el cDNA usando el kit RT de gDNA. La PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit qPCR en un sistema de detección de PCR en tiempo real. Las secuencias cebadoras específicas de genes se proporcionan en la Tabla 1.

Análisis de Western blot
Para la extracción de proteínas de los tejidos hepáticos, se pesaban aproximadamente entre 50 y 200 mg de tejido, se picaban en una placa de Petri y se transferían a un homogeneizador. Se añadió un tampón de lisis preenfriado (tampón RIPA) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa para evitar la degradación de proteínas. La homogeneización se realizó minuciosamente sobre hielo para asegurar una completa disrupción del tejido, y el homogenado se transfirió a un tubo de centrífuga e incubó sobre hielo durante 30 minutos para facilitar la solubilización de proteínas. Posteriormente, el homogenado se centrifugó a 4 °C a 12.000 x g durante 10-30 minutos, y el sobrenadante se recogió cuidadosamente como extracto proteico total, evitando la contaminación del pellet. Para la extracción de proteínas celulares, se añadió un tampón de lisis preenfriado (tampón RIPA que contiene 1% de Tritón X-100 e inhibidores de proteasas) a las células, seguido de incubación sobre hielo durante 15-30 minutos para lograr la lisis completa. La alteración de las celdas se aseguraba mediante raspados repetidos con un raspador de celda o pipeteo vigoroso. El lisato se transfirió a un tubo de centrífuga y se centrifugó a 4 °C a 14.000 x g durante 30 minutos, y el sobrenadante se recogió como extracto total de proteína. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando un kit de análisis de proteínas BCA, y las alicuotas se almacenaron a -80 °C para futuras analíticas de Western blot o se utilizaron directamente para la preparación de la muestra. Las muestras de proteína se desnaturalizaron en el tampón de Laemmli a 100 °C durante 10 minutos, se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron con anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 °C. Tras el lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia (ECL) mejorada. Se capturaron las señales quimioluminiscentes y las intensidades de banda se cuantificaron mediante análisis densitométrico usando el software ImageJ. Las manchas occidentales en bruto se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como la media ± el error estándar de la media (SEM). Se realizaron comparaciones estadísticas entre dos grupos utilizando una prueba t de Student no emparejada. Para comparaciones entre tres o más grupos, se aplicó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (Versión 9.5.0). Se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05.

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Resultados

El GZRG mejoró la resistencia a la insulina y la gluconeogénesis en ratones T2DM inducidos por DCF
El modelo murino de diabetes mellitus tipo 2 (DT2) inducido por HFD, caracterizado por resistencia a la insulina, hiperglucemia y dislipidemia, se emplea ampliamente para investigar la patogénesis de la enfermedad y evaluar intervenciones terapéuticas30. En el presente estudio, se estableció un modelo de T2DM inducido por DCF en ratones C57BL/6J para evaluar la eficacia y los meca...

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Discusión

El presente estudio demuestra que la GZRG ejerce efectos antihiperglucémicos y sensibilizadores a la insulina significativos tanto en modelos in vivo como in vitro de la diabetes tipo 2, principalmente mediante la supresión de la gluconeogénesis hepática mediante la modulación del eje SIRT3-MPC1-PC/PDH. Los datos experimentales indican que la administración de GZRG atenuó la hiperglucemia en ayunas, mejoró la tolerancia a la glucosa y la insulina, restauró la homeostasi...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Plan de Desarrollo Científico y Tecnológico de la provincia de Jilin, subvención número 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FastKing gDNA disipando RT SuperMix & nbsp;    Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). KR118-02
Anticuerpo de glucosa-6-fosfatasa (G6Pase)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-12610
Anticuerpo gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-T-0004
Kits ELISA de hemoglobina glicosilada      Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0159M2
GZRGHospital afiliado de la Universidad de Medicina China de Changchun (Jilin, China)26210483
Kits de ensayo de colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL)Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)A112-1-1
Kits ELISA de insulinaJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0579M2
Lipofectamina2000 Invitrogen, EE. UU.11668-019
Kits de análisis de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL)Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)A113-1-1
Medir kits de ensayo de glucosaInstituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)F006-1-1
Portador de piruvato mitocondrial 1 (MPC1) AnticuerpoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-3852
Kits de ensayo de ácidos grasos no esterificados (NEFAs)Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)A042-2-1
Anticuerpo PCWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-4364
Anticuerpo PDH-E2Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-14046
Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1) AnticuerpoWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-6770
kits de piruvato carboxilasa (PC) ELISA & nbsp;Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160408H
Kits de piruvato deshidrogenasa (PDH)ELISA & nbsp;  Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160300H
Kit de tejido/célula ARN Easy Fast & nbsp;  Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). DP451
Anticuerpo SIRT3Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-A-5135
Talento SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). FP209-02
Kits de análisis de colesterol total (TC)Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)A110-1-1
Kits de ensayo de triglicéridos (TG)Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nankín (China)A111-1-1

Referencias

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