Análisis integrado de proteómica transcriptómica y secretoma de células endoteliales estimuladas por hiperglucemia y cribado de compuestos objetivo

Summary

Este protocolo establece una cadena integrada de multi-ómica (transcriptoma y proteoma) combinada con cribado farmacológico en red para identificar los impulsores moleculares y los objetivos terapéuticos para la disfunción endotelial en complicaciones diabéticas.

Abstract

La disfunción endotelial es un factor clave de la enfermedad renal diabética (DKD), pero sus mecanismos moleculares sistémicos permanecen incompletamente descodificados. Planteamos la hipótesis de que el análisis multiómico integrado podría mapear el daño endotelial inducido por la hiperglucemia e identificar terapias reutilizables. Se aplicó una cadena computacional reutilizable para integrar perfiles transcriptómicos/secretomáticos de células endoteliales hiperglucémicas y riñones diabéticos. Esto identificó 534 genes/proteínas comúnmente regulados al alza. El enriquecimiento funcional reveló la activación de la remodelación de la matriz extracelular, la comunicación intercelular y las vías de inflamación. La validación entre bases de datos perfeccionó 278 mediadores de alta confianza y el análisis de redes de interacción proteína-proteína localizó diez genes centrales. Utilizando farmacología en red, seleccionamos una biblioteca de fármacos aprobados, identificando varios compuestos candidatos (por ejemplo, bruceantina, idelalisib) que podrían atacar esta red. Además, la regulación de factores de transcripción y simulaciones ejemplares de acoplamiento molecular (por ejemplo, idelalisib con CTCF/BRD4) proporcionaron hipótesis mecanicistas para validación experimental. En conclusión, este estudio establece un marco multiómico reutilizable que delimita los mecanismos patogénicos endoteliales en DKD y nomina candidatos a fármacos reutilizables, ofreciendo un enfoque estratégico para el descubrimiento mecanicista y terapéutico.

Introduction

La diabetes mellitus, como desafío global para la salud, afectó a 529 millones de personas en todo el mundo en 2021, con proyecciones que indican que afectará a 1.310 millones de personas para 2050^. Más allá del control glucémico, las complicaciones a largo plazo son la principal fuente de morbilidad, mortalidad y reducción de la calidad de vida. Estas incluyen complicaciones microvasculares (por ejemplo, enfermedad renal diabética (DKD), retinopatía, neuropatía) y complicaciones macrovasculares (por ejemplo, aterosclerosis acelerada). De forma crítica, la DKD afecta entre el 30% y el 40% de los pacientes diabéticos, representando la principal causa de enfermedad renal terminal (ESRD) a nivel^{mundial 2}. La profunda carga de estas complicaciones subraya una necesidad urgente y no satisfecha de nuevas terapias que actúen en sus mecanismos subyacentes.

Las células endoteliales (CE), que forman el revestimiento interno de todos los vasos sanguíneos, son guardianes fundamentales de la salud vascular. La disfunción endotelial inducida por la hiperglucemia actúa como un factor central de la vasculopatía diabética y el daño a^{órganos 3,4}. Los niveles altos de glucosa desencadenan una cascada de respuestas maladaptativas dentro de las EC, que incluyen biodisponibilidad desregulada del óxido nítrico (NO), aumento de la secreción de endotelina-1 (ET-1), expresión aumentada de moléculas de adhesión (por ejemplo, VCAM-1, ICAM-1), aumento del estrés oxidativo por generación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) (por ejemplo, a través de oxidasas de NADPH) e inflamación persistente de bajo^{grado 3,4}. En conjunto, estas alteraciones conducen a una vasodilatación deteriorada, aumento de la permeabilidad vascular, adhesión e infiltración leucocitaria, estados protrombóticos y, en última instancia, remodelación^{vascular 5}. Dentro de la microvasculatura renal, el daño endotelial glomerular altera la barrera de filtración, promueve la albúminuria y contribuye directamente a la acumulación de la matriz extracelular (CLE), la glomerulosclerosis y la fibrosis^{tubulointersticial 5,6}. La posterior activación de las células renales residentes, junto con la entrada de células inflamatorias, establece un círculo vicioso que amplifica la lesión renal ^5,7. De manera crucial, los estudios clínicos demuestran que los marcadores de disfunción endotelial sistémica se correlacionan fuertemente con el inicio y progresión de la albuminuria y la disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG) en pacientes ^{diabéticos 6,7,8}, subrayando su relevancia directa para los resultados de enfermedades humanas. A pesar de su reconocida centralidad, una comprensión integral a nivel sistémico de la reprogramación transcripcional y secretoria precisa inducida por la hiperglucemia crónica en las EC —especialmente las alteraciones que impulsan la remodelación de la TEC, clave para la fibrosis renal— sigue incompletamente caracterizada, limitando la identificación de nuevos objetivos terapéuticos mecanicistas para la DKD y otras complicaciones vasculares^{diabéticas 7,8}.

La profunda complejidad molecular que sustenta la disfunción endotelial en la diabetes representa un desafío formidable para los enfoques terapéuticos tradicionales de un solo objetivo. Aquí es donde la biología computacional y la bioinformática emergen como herramientas indispensables, permitiendo la integración y la minería de conjuntos de datos ómicos diversos y de alta dimensión para priorizar los centros causales dentro de redes patológicas e identificar estrategias terapéuticas^{multi-dirigimiento.} De forma crítica, los enfoques convencionales de modalidad única (por ejemplo, cribado solo transcriptoma/proteoma o farmacológico) a menudo pasan por alto la interacción crítica entre capas moleculares (por ejemplo, expresión génica, dinámica proteica, respuesta a fármacos), fallando en captar los factores sinérgicos o efectos fuera del objetivo^10,11. La cadena integrada de multi-ómica supera estas limitaciones al perfilar simultáneamente datos transcriptómicos, secretómicos y farmacológicos dentro del mismo sistema, proporcionando una visión holística del mecanismo de la enfermedad. La farmacología de redes, los algoritmos de predicción de ligandos/objetivos y el acoplamiento molecular in silico permiten la exploración sistemática de bibliotecas de fármacos aprobados, acelerando el reposicionamiento o descubrimiento de compuestos capaces de contrarrestar firmas complejas de enfermedades³. Este cambio de paradigma tiene un potencial particular para identificar terapias que actúen contra la desregulación endotelial y sus devastadoras consecuencias microvasculares, como la DKD, ofreciendo el potencial de una mejor eficacia y una reducción de perfiles de efectos secundarios. La integración de análisis transcriptómicos/secretómicos de células endoteliales expuestas a hiperglucemia identificó 534 moléculas comúnmente reguladas al alza. El enriquecimiento funcional implicó la remodelación de la matriz extracelular, el estrés oxidativo y la inflamación en la patogénesis temprana de la DKD. El análisis entre bases de datos priorizó 278 objetivos de alta confianza, refinados mediante redes de PPI de genes centrales. El cribado farmacológico en red de fármacos aprobados predijo 85 compuestos candidatos (incluyendo brefeldin-A, bruceantina, paracetamol e idelalisib) dirigidos a estos centros. La predicción y acoplamiento de factores de transcripción in silico exploraron mecanismos. Este trabajo delimita los impulsores endoteliales de la DKD, establece una cadena de descubrimiento computacional y proporciona candidatos terapéuticos para validación. En última instancia, se espera que esta canalización promueva programas de descubrimiento terapéutico para complicaciones diabéticas.

Protocol

Los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Investigación y Ética Animal del Instituto de Investigación Médica de Hebei Yiling (número de aprobación: N2024082). Consulta la Tabla de Materiales para conocer los materiales experimentales e instrumentos utilizados en este estudio. El personal debe llevar estrictamente el equipo de protección individual (EPP) adecuado al manipular reactivos peligrosos como TRIzol (irritante para la piel/ojos, que contiene fenol) y inhibidores de proteasas (posibles sensibilizadores respiratorios/cutáneos). Segregar los residuos biológicos/líquidos en bolsas autoclavables y los residuos químicos peligrosos en recipientes designados para su eliminación institucional de peligros. Descontamina los consumibles antes de desecharlos.

Modelado de ratones de nefropatía diabética

Los ratones machos de db/db y db/m (12 semanas) se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) a 22 ± 2 °C y 56% ± 5% de humedad, con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas y acceso ad libitum a comida/agua. Tras un periodo de aclimatación de 1 semana, a los ratones se les asignaron identificadores numéricos aleatoriamente y se asignaron a grupos experimentales. A los ratones db/db se les dio una dieta alta en proteínas durante 6 semanas para establecer la DKD. El éxito de la modelización se confirmó mediante una relación albúmina-creatinina (UACR) urinaria significativamente elevada frente a controles db/m, siendo el UACR >30 mg/g el principal biomarcador funcional para la^{DKD 12} temprana.

Modelado de células endoteliales con alta glucosa

Las células endoteliales glomerulares renales humanas (HRGECs) se prepararon bajo condiciones estandarizadas. Los HRGEC se cultivaron en medio de glucosa normal (NG, 5,5 mM de D-glucosa) o de glucosa alta (HG, 30 mM de D-glucosa) y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de_CO2. Las células se expusieron sin interrupción a HG o se cultivaron en condiciones de control durante 24 horas antes de los análisis posteriores. Se debe incluir control osmótico (HM, que contiene 5,5 mM de D-glucosa con 24,5 mM manitol). Todas las condiciones deben cumplir criterios estrictos de aptitud celular: la viabilidad se mantuvo ≥85%, los niveles de apoptosis se mantuvieron por debajo del 15%, los aumentos ROS en HG en comparación con HM no superaron el 20% y la liberación de LDH se mantuvo por debajo del 10%, validando la integridad celular antes de los análisis posteriores.

Colección de medios condicionados

Se recogieron medios condicionados (MC) utilizando un protocolo estandarizado para el análisis del^{secretoma 13} con modificaciones. Tras 24 horas de estimulación con glucosa alta (30 mM D-glucosa), glucosa normal (5,5 mM D-glucosa) o control osmótico (5,5 mM de D-glucosa + 24,5 mM mannitol), los HRGEC se lavaron con solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las proteínas séricas residuales. Las células se repusieron con un medio endotelial basal rojo libre de suero y fenol y se incubaron durante 12 horas a 37 °C con un 5% de CO₂ para acumular factores secretados.

El CM se extraía utilizando tubos de centrifugación preenfriados. Secuencialmente, el procesamiento de muestras se realizó como se describe a continuación.

Aclaración principal: La CM se transfirió a tubos cónicos libres de RNasa/DNasa y se centrifugó a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Los restos en bolitas fueron descartados.

Inhibición de la proteasa: En menos de 2 minutos tras la clarificación primaria, se añadió un cóctel inhibidor de proteasas sin EDTA a una concentración final 1x (1:50) que contenía 1x inhibidores de fosfatasa.

Concentración: El sobrenadante se cargó inmediatamente en filtros centrífugos PBS preenjuagados (3 kDa MWCO) y centrifugado a 4.000 x g durante 90 minutos a 4 °C para alcanzar una concentración de 10x.

Aclaración secundaria: El concentrado se transfirió a tubos microcentrífugas preenfriados y centrifugado a 12.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Se recogió sobrenadante, evitando los agregados en pellets.

Almacenamiento: Se fabricaron alícuotas de volúmenes de 50 μL en crioviales estériles de baja unión a proteínas. Los frascos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido en menos de 30 minutos tras la finalización de la cosecha. Los viales se almacenaban a -80 °C (sin ciclos de congelación-descongelación).

Los lotes de CM se sometieron a pruebas de endotoxinas (<0,25 EU/mL). El protocolo de incubación sin suero no mostró inducción de estrés (validado por inmunoblots HSP70/CHOP). El rendimiento de la proteína CM se normalizó en el recuento celular y contenido de ADN viable en la cosecha. Rigor de procesamiento mantenido: técnica estéril en todo momento; ≤30 minutos de la cosecha a la congelación; Equilibrio de temperatura del rotor confirmado.

Ensayo CCK-8 de células tubulares renales tratadas con medios condicionados

Para evaluar el impacto funcional del secretoma endotelial sobre la viabilidad de las células tubulares renales, se realizó un ensayo CCK-8 en la línea celular epitelial tubular proximal renal humana HK-2 tratada con MC derivada de células endoteliales glomerulares renales humanas (HRGEC), de acuerdo con los protocolos establecidos. Las células HK-2 se cultivaron en un medio DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Para el ensayo, las células se sembraron en placas de 96 pozos con una densidad de 5 x 10³ celdas por pozo. Se realizó inanición de suero de células durante 12 horas en un medio que contenía 0,5% de FBS inmediatamente antes del tratamiento con muco cervical.

Se aplicó CM con la misma masa proteica total normalizada. Las alicuotas de CM congeladas se descongelaron a 37 °C en un baño seco (<5 min) y se clarificaron por centrifugación a 10.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Las células HK-2 (100 μL/pozo) fueron tratadas con HG-CM, NG-CM o HM-CM, normalizadas a contenido de proteína/ADN compatible. Se prepararon un total de 3 réplicas biológicas por condición (con 3 réplicas técnicas cada una). Las muestras se incubaron a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 24 horas. La viabilidad celular se evaluó utilizando el Kit de Conteo Celular-8. Para ello, se añadieron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pozo e incubaron durante 1-4 horas a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas. La viabilidad se calculaba como:

Viabilidad (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

Detección de estrés oxidativo

Se cuantificaron los niveles celulares de malondialdehído (MDA), uno de los principales productos finales de la peroxidación lipídica de membrana, mediante el ensayo TBA. Los lisados celulares (1 x 10⁷ celdas) se clarificaron centrifugando a 10.000 x g durante 15 minutos, y luego se alicotó 0,02 mL de sobrenadante en tubos de muestra junto con 0,02 mL de estándares MDA. A la aliterota, se añadieron 0,02 mL de clarificante y 0,6 mL de reactivo ácido. Las muestras/estandartes se trataron con 0,2 mL del agente cromogénico (tubos de control: se añadió 0,2 mL de ácido acético al 50%). Tras sellar, mezclar e incubar a 100 °C durante 40 minutos, las muestras se enfriaron y luego centrifugaron a 9569 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a microplacas a 250 μL para la medición OD₅₃₂.

Perfilado transcriptómico

El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol siguiendo el protocolo del fabricante. La cantidad y pureza del ARN se evaluaron con un espectrofotómetro y un analizador de fragmentos, respectivamente. Solo se utilizaron muestras de ARN de alta calidad con Número de Integridad de ARN (RIN) > 7.0 para la construcción de la biblioteca de secuenciación.

El ARNm poliadenilado (poli(A)+) se enriqueció mediante dos rondas de selección basada en perlas magnéticas oligo(dT). El ARNm purificado se fragmentó en 200-300 nucleótidos utilizando un kit de fragmentación a base de magnesio a 94 °C durante 5-7 minutos. La síntesis de ADNc de primera cadena se realizó con transcriptasa inversa, seguida de síntesis de ADNc de segunda cadena usando la polimerasa de ADN I y RNasa H de E. coli en presencia de dUTP (para facilitar la especificidad de la cadena). Los pasos posteriores incluyeron reparación de extremos, a-tailing, ligación de adaptadores y selección de tamaño mediante esferas magnéticas. Antes de la amplificación por PCR, la segunda cadena incorporada por dUTP se digiría con la enzima UDG.

Se construyó una biblioteca específica para cada fibra con un tamaño medio de inserción de 400 ± 50 pb usando PCR bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 1 minuto; 14 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s; y una extensión final a 72 °C durante 5 minutos. La secuenciación de extremos emparejados a 150 pb se realizó en una plataforma Illumina, con una profundidad de secuenciación de ≥40 millones de lecturas por muestra (Q30 > 85%).

Análisis bioinformático de datos transcriptómicos

La comprobación de calidad de las lecturas en bruto se realizó usando FastQC (v0.11.8), y se realizó la alineación con el genoma de referencia GRCh38.p13 con HISAT2 (v2.2.1). La cuantificación de transcripciones y el ensamblaje de transcripciones por muestra se realizaron usando StringTie (v2.1.6) con parámetros predeterminados. Todos los transcriptomas ensamblados se fusionaron a partir de muestras individuales para reconstruir un transcriptoma completo usando el software gffcompare (v0.12.6; gffcompare es una herramienta independiente, no parte de StringTie, y su versión se corrige a la versión estable común). El análisis diferencial de expresión se realizó con DESeq2 (v1.38.3) utilizando umbrales de |log2 fold change (FC)| > 1 y tasa de falsos descubrimientos (FDR) < 0,05. Los efectos por lotes se corrigieron mediante el paquete variancePartition.

Análisis proteómico del secretoma

La CM se recogió de HRGECs cultivados bajo condiciones de control NG, HG o HM utilizando un método¹³ previamente descrito con modificaciones para el análisis del secretoma. Las células se lavaron con PBS tras la estimulación e incubaron en un medio sin suero durante 12 horas. Se recogió CM y centrifugó a 3.000 x g durante 10 minutos (4 °C).

Se mezclaron cantidades iguales de péptido de cada muestra, se diluyeron con el disolvente A (5% ACN, pH 9,8) e inyectaron en la columna. La fraccionación de la mezcla peptídica se realizó utilizando una columna de 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 en el Sistema de Separación Rápida Binaria. La elución por gradiente se realizó a un caudal de 0,3 mL/min: del 5% al 21% del disolvente B (97% ACN, pH 9,8) en 38 minutos, del 21,5% al 40% del disolvente B en 20 minutos, del 40% al 90% del disolvente B en 2 minutos, del 90% disolvente B durante 3 minutos y el disolvente B al 5% equilibrado durante 10 minutos. Se monitorizaron los picos de elución a 214 millas náuticas y se recogieron fracciones cada minuto. Las fracciones se combinaron según cromatogramas de los picos de elución. Se recogieron un total de 10 fracciones, que luego se secaron por liofilización.

Se prepararon las fases móviles A (100% agua, 0,1% ácido fórmico) y B (80% acetonitrilo), y las muestras secas de péptidos se reconstituyeron con 0,1% de ácido fórmico y centrifugaron a 20.000 x g durante 10 minutos. La separación se realizó mediante un sistema de fase líquida UHPLC. Las muestras se alimentaron en una columna HPLC ES906 (150 mm) con un gradiente de 8 minutos a 2,5 μL/min, y se separaron con el siguiente gradiente efectivo: 0-4 minutos, fase B móvil al 4% aumentando linealmente hasta el 25%; 4-6,9 min, fase B móvil aumentando linealmente del 25% al 35%; 6,9-7,3 min, fase B móvil sube linealmente del 35% al 99%; 7,3-8,0 min, mantuvo la fase móvil B al 99%. Los péptidos separados en fase líquida se transfirieron a un espectrómetro de masas para la adquisición del modo DIA. Los parámetros principales se establecieron de la siguiente manera: energía de colisión normalizada 25%, estado de carga por defecto 2, resolución 240.000, escaneo cada 0,6 s, rango de escaneo 380-980 m/z, espectrometría de masas AGC 500%. Los escaneos de fragmentación de iones se registraron con un tiempo máximo de exploración de 3 ms y utilizaron 300 ventanas de escaneo 2-Th, que iban de 380 a 980 m/z.

El DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, versión 1.9.1) se utilizó para analizar los datos del DIA mediante un método libre de biblioteca. Los datos de EM/EM se buscaron con secuencias de proteínas, que se descargaron de la base de datos Uniprot con los siguientes ajustes: enzima: Tripsina/P; Máximo de escotes fallidos: 2; modificación fija: carbamidometil (C); modificaciones variables: oxidación (M) y acetilo (proteína N-term); Tolerancia de masa precursora: 20 ppm; tolerancia a masas de fragmentos: 0,05Da. Los resultados se filtraron con un 1% de FDR, y solo se utilizaron los grupos proteicos que cumplieron este criterio de filtro en el análisis posterior.

Análisis de enriquecimiento funcional de Omics (GO, KEGG y GSEA)

Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional en conjuntos filtrados de genes expresados diferencialmente (transcriptómica) y proteínas (proteómica del secretoma), siguiendo las canaletas de bioinformática establecidas. Los identificadores se mapeaban usando Org.Hs.eg.db. El enriquecimiento GO (procesos biológicos, funciones moleculares, componentes celulares) se ejecutaba mediante clusterProfiler. Benjamini-Hochberg ajustó el valor p < 0,05, y se aplicó reducción de similitud semántica (corte = 0,7) para condensar los términos. El análisis de vías KEGG se realizó utilizando KEGG REST API (has, versión de 2023). Se utilizaron pruebas hipergeométricas con la corrección de Yekutieli FDR. La visualización de la topología de las vías se realizó con Pathview. GSEA se aplicó mediante un enfoque basado en rangos con la clasificación de genes señal-ruido. Se realizó un enriquecimiento de pruebas contra colecciones de MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) y firmas endoteliales diabéticas curadas. La significancia se evaluó tras 1000 permutaciones fenotípicas (FDR < 25%).

Análisis de redes de interacción proteína-proteína

Para identificar reguladores moleculares centrales dentro del grupo de candidatos patógenos, se realizaron la construcción de redes de PPI y el análisis topológico utilizando un flujo de trabajo computacional integrado. Los 278 genes candidatos fueron enviados a la base de datos STRING (v12.0; Homo sapiens; Las fuentes de evidencia incluían bases de datos experimentales, de coexpresión y curadas; un umbral de confianza en interacción (puntuación combinada) >0,7 para ventajas de alta confianza; y no hay inflación interactor adicional. Los resultados se importaron a Cytoscape (v3.9.1) y se realizó el análisis de topología de red utilizando los plugins MCODE (v1.5.2) y CytoHubba (v0.4.1). Posteriormente, la red se optimizó visualmente según el grado de conexión de los nodos, de modo que los nodos con alta conectividad son de color más oscuro, de mayor tamaño y más prominentes en etiqueta.

Desarrollo de un conjunto de genes objetivo para la enfermedad renal diabética

Los criterios para los ARNm/proteínas co-regulados por encima se definieron de la siguiente manera: transcriptoma (FDR < 0,05 y |log2FC| > 1) y secretoma (FDR < 0,01 y |log2FC| > 1,5). Los nombres de proteínas y genes se normalizaron usando UniProt y se convirtieron a un formato unificado (Símbolo Genético). Se construyó un conjunto de genes objetivo para la enfermedad renal diabética integrando genes asociados a la enfermedad de múltiples bases de datos públicas, incluyendo GeneCards (Versión 5.25, término de consulta: Nefropatías diabéticas, fecha consultada julio de 2025), la Base de Datos Comparativa de Toxicogenómica (CTD; https://ctdbase.org/, término de consulta: Nefropatías Diabéticas, fecha de consulta julio de 2025) y Plataforma de Objetivos Abiertos (https://platform.opentargets.org/, Versión 0.13.8, término de consulta: Nefropatías diabéticas, fecha de consulta julio de 2025)^{13, 14, 15}. Este fue designado como el conjunto completo de referencia para la enfermedad diabética renal. La intersección entre ARNm/proteínas co-regulados al alza y este conjunto génico se identificó para análisis posteriores.

Detección de proteínas CCL2

Para cuantificar CCL2, se recubrió una placa de 96 pozos con anticuerpo de captura (100 μL/pozo) e incubó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó con 2 veces con buffer y se bloqueó con diluyente ELISA (200 μL/pozo) durante 1 hora en RT. Se preparó una curva estándar de 7 puntos mediante diluciones en serie de 2 veces del estándar S1, luego se añadieron las muestras (100 μL/pozo) e incubaron durante 2 horas a 400 rpm. Tras lavar 5 veces, se añadió y incubó el anticuerpo de detección (100 μL/pozo) durante 1 hora a 400 rpm, seguido de adición e incubación en solución enzimática (100 μL/pozo) durante 30 minutos a 400 rpm. Las muestras se desarrollaron con sustrato de TMB (15-30 min, RT). La reacción se detuvo con ácido (100 μL/pozo), y la absorbancia se leyó en 450 nm (620 nm de referencia opcional). Los pasos clave incluyen lavados rigurosos, incubaciones programadas y diluciones estandarizadas para garantizar la reproducibilidad.

Reposicionamiento de fármacos

Los compuestos terapéuticos se predijeron utilizando la siguiente plataforma: LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Esta plataforma emplea el método MODZ y el análisis de direcciones características para identificar pequeñas moléculas o combinaciones de compuestos capaces de invertir o imitar firmas de expresión génica^{de entrada 16}. Se identificaron fármacos candidatos como aquellos que revierten la desregulación de genes renales expresados diferencialmente utilizando esta plataforma. Los compuestos se clasificaron según sus puntuaciones de reversión en líneas celulares renales por un riñón seleccionado en la columna de tejido, y los candidatos mejor clasificados fueron sometidos a acoplamiento molecular para evaluar sus afinidades de unión a los objetivos proteicos clave.

Cribado de factores de transcripción co-reguladores

Se consultó la base de datos hTFtarget para detectar la unión de TFs coreguladoras al conjunto génico. La base de datos hTFtarget se analizó para identificar relaciones génicas-objetivo entre factor de transcripción humano (TF) mediante el análisis computacional de conjuntos de datos ChIP-Seq a gran escala en diversas células, tejidos y condiciones. La cadena integrativa combinó señales de pico ChIP-Seq con contexto epigenético para localizar la unión de TF en promotores/potenciadores, teniendo explícitamente en cuenta la dinámica reguladora espaciotemporal. Como demostraron Zhang et al., sirvió como una plataforma multidimensional que permitió la exploración de objetivos TF o reguladores génicos, la visualización de datos de ChIP-Seq, la investigación de la cooperatividade TF y la predicción de los sitios de unión¹⁷.

Pipeline computacional y análisis para acoplamiento molécula-proteína pequeña

AutoDock Vina 1.2.0¹⁸ se utilizó para realizar análisis de acoplamiento molecular de las interacciones de unión entre los ingredientes activos y los factores de transcripción BRD4, CTCF, EP300 y SPI1. Las estructuras cristalinas de BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) y SPI1 (PDB ID: 8E3K) se obtuvieron del Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)^19,20. Las estructuras de moléculas pequeñas en formato SDF se descargaron de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ²¹), se convirtieron al formato MOL2 usando Open Babel 2.4.1 y se minimizaron la energía con PyRx 0.8. El preprocesamiento de proteínas se realizaba eliminando moléculas de agua, añadiendo átomos de hidrógeno, calculando cargas de Gasteiger y convirtiéndolas al formato PDBQT (necesario para AutoDock Vina). Se empleó una estrategia de acoplamiento semi-flexible, definiendo la posición y dimensiones de la rejilla de acoplamiento en función de los sitios de unión de ligandos cocristalizados en cada proteína. MA9-086 sirve como ligando de control positivo para BRD4 y XDM-CBP para EP300. Para CTCF y SPI1 (sin ligandos positivos conocidos), se identificaron bolsas potenciales de unión mediante análisis estructural utilizando la plataforma online Proteins Plus (https://proteins.plus/). Los parámetros de la rejilla de acoplamiento se establecieron de la siguiente manera (coordenadas y dimensiones en Å a lo largo de los ejes x, y y z): BRD4 centrado en (-11.907, -8.617, -3.973) con un tamaño de caja de (18.387, 18.387, 18.387); centro CTCF en (15.165, 4.854, 6.388) y tamaño de caja (17.25, 20.25, 9.75); centro EP300 en (39.781, 5.326, 9.998) y tamaño de caja (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 centro en (3,155, -3,853, 0,668) y tamaño de caja (17,25, 25,5, 10,5). Durante el acoplamiento, el rango de energía se estableció en 3, el parámetro de exhaustividad en 8 y el espaciado de la rejilla en 0,375 Å. La estabilidad de unión se evaluó a partir de la energía de unión, donde valores más bajos indican conformaciones más estables y mayor probabilidad de interacción, con un umbral de <-5 kcal/mol definido como una actividad de unión^{fuerte 22,23}. Finalmente, se identificaron modos de interacción entre compuestos y receptores usando PyMOL.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SEM. Se seleccionaron pruebas estadísticas basándose en la normalidad (Shapiro-Wilk) y la homogeneidad de varianzas (prueba de Levene). Se utilizaron pruebas t no emparejadas (dos grupos) o ANOVA unidireccional con pruebas post hoc de LSD (≥3 grupos) para comparaciones entre grupos. Un p < 0,05 se definió como un umbral de significación. Los gráficos se generaban con GraphPad Prism 9.0.

Results

Demostración del impacto patogénico del secretoma endotelial hiperglucémico sobre los túbulos renales

Este estudio comenzó con la validación del efecto patógeno del secretoma endotelial hiperglucémico. El medio acondicionado de células endoteliales glomerulares humanas hiperglucémicas (HG-CM) afectó significativamente la viabilidad de las células epiteliales del túbulo proximal humano (HK-2) en comparación con l...

Discussion

Este estudio establece la disfunción del secretoma endotelial inducida por hiperglucemia como un factor crítico de la lesión renal diabética mediante enfoques integrados de multiómica y computación. Demostración de que la citotoxicidad mediada por secretoma hacia los túbulos renales coincide con una desregulación sistemática de 534 factores derivados de endotelios que convergen en la remodelación matricial, el estrés oxidativo y las vías del núcleo de inflamación en la patogénesis de la ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit CCL2 ELISA	Thermo Fisher Scientific	#88-7399-88
Inhibidor de CCR2	Merck Millipore	#227016
Kit de ensayo de viabilidad celular	Siete Biotecnología	CCK-8, SC119-01
Secuenciador de ADN	Illumina	NovaSeq 6000
Sistema de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento	Thermo Fisher Scientific	UltiMate 3000 Binary RSLC
Medio de Cultura HRGEC	Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.	1001
Células endoteliales glomerulares renales humanas (HRGECs)	Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotecnología	PRI-H-00038
Medio Completo de Células Epiteliales Tubulares Renales Humanas	Procell	CM-H193
Células epiteliales tubulares renales humanas (HK2)	Procell	CP-H193
Ratones machos de db/db y db/m (4 semanas)	Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd.	SCXK 20190004
Espectrómetro de masas	Thermo Fisher Scientific	Astral
Lector de Absorbancia de Microplacas	Dispositivos moleculares	SpectraMax iD5
Cóctel inhibidor de proteasas (libre de EDTA)	Roche	cOmplete, #5056489001
Reactivo de extracción de ARN	Thermo Fisher Scientific	TRIzol, #15596026
Analizador de Calidad de ARN	Agilent Technologies	Analizador de fragmentos 5300, M5311AA
Instrumento de Cuantificación de ARN	Thermo Fisher Scientific	Qubit 3.0, Q33216
Kit de detección ROS	Thermo Fisher Scientific	#EEA019
Dispositivos centrífugos de ultrafiltración (MWCO de 3 kDa)	Merck Millipore	Amicon Ultra-4