Artículo de investigación
Se trató con lansoprazol un modelo murino inducido por colagenonasa de hemorragia intracerebral (IC). El lansoprazol no solo alivió la lesión intestinal causada por la ICH y redujo los niveles de lipopolisacáridos (LPS) e IL-1β, sino que también inhibía la inflamación cerebral. Lansoprazol mejoró el aprendizaje y la memoria (función neurológica a largo plazo) en ratones con ICH.
La hemorragia intracerebral (IC) puede comprometer el tracto gastrointestinal y desencadenar daño intestinal, contribuyendo a malos resultados clínicos. Este estudio investigó los efectos del lansoprazol sobre la lesión intestinal y la función neurológica en ratones con PCI. Se inyectó estereotácticamente colagenasa a ratones para establecer un modelo de ICH. Se evaluaron la función neurológica, el contenido de agua cerebral, la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, la lesión intestinal y la permeabilidad intestinal. También se analizaron los niveles de LPS e IL-1β en sangre y cerebro. El tratamiento con lansoprazol se asoció con un alivio de la lesión intestinal, niveles reducidos de LPS e IL-1β en sangre y cerebro, disminución del contenido de agua cerebral e inhibición de la inflamación cerebral en ratones ICH. Aunque la administración de lansoprazol no mejoró el rendimiento en las pruebas de García, colocación de las extremidades anteriores ni rotatorias (función neurológica a corto plazo), mejoró significativamente el aprendizaje y la memoria (función neurológica a largo plazo). Estos hallazgos indicaron que el tratamiento con lansoprazol se asoció con una mejora en los resultados neurológicos a largo plazo y una reducción de la lesión intestinal en ratones de CHI.
El ictus hemorrágico tiene altas tasas de mortalidad e incapacidad. Recientemente, la prevalencia del ictus en China ha aumentado, convirtiéndolo en la principal causa de muerte1. Aunque es menos común, la hemorragia intracerebral (IC) es notablemente más letal que el ictus isquémico. Los estudios informan de una tasa de mortalidad del 40% en el plazo de un mes tras la ICH; Además, aproximadamente el 75% de los supervivientes no pueden vivir de forma independiente un año después2.
El cerebro se comunica con el tracto gastrointestinal a través de varias vías, incluyendo el nervio vago, el sistema nervioso entérico y el metabolismo microbiano intestinal. El eje cerebro-intestino es un sistema regulador bien reconocido y clínicamenterelevante 3. La mucosa intestinal regula la absorción de agua, electrolitos y nutrientes, al tiempo que previene la entrada de patógenos y toxinas en el torrente sanguíneo. La PCI puede comprometer esta barrera intestinal y desencadenar una lesión gastrointestinal. La disfunción de la barrera, a su vez, contribuye a la desnutrición, la inmunosupresión y a los malos resultadosclínicos 4. Los aumentos de permeabilidad intestinal inducidos por la CHI permiten que sustancias endógenas dañinas entren en el torrente sanguíneo, desencadenando respuestas inflamatorias sistémicas y síndrome de disfunción multiorgánica. El daño a la mucosa intestinal tras la ICH puede incluso permitir que las bacterias intestinales se transloquen al torrente sanguíneo, lo que puede provocar infeccionessistémicas 5. Muchos pacientes desarrollan dismotilidad intestinal, disbiosis microbiana, sangrado mucoso y sepsis. Un estudio previo mostró que la CHI provocaba la migración de patógenos intestinales y toxinas alcerebro 6.
El lansoprazol, un inhibidor de la bomba de protones (IBP), inhibe irreversiblemente la bomba de protones y, por tanto, reduce la secreción de ácido gástrico. Se utiliza en el tratamiento de úlceras gástricas y duodenales, esofagitis erosiva, enfermedad por reflujo gastroesofágico y úlceras gástricas asociadas a fármacos antiinflamatorios noesteroideos 7. Un estudio previo indicó que la profilaxis de los IBP afectaba negativamente a los resultados de los pacientes en el ictusisquémico 8. Otros estudios publicados sugirieron una asociación entre el consumo de IBP y el deterioro cognitivo. Un estudio epidemiológico mostró que los pacientes a los que se les administraban IBP tenían un mayor riesgo de desarrollar demencia y enfermedad deAlzheimer 9. Un estudio de cohorte prospectivo que comparó usuarios de IBP a largo plazo con no usuarios encontró que el uso de IBP se asociaba con un mayor riesgo de demencia, y los autores desaconsejaron el uso de IBP en pacientes en riesgo como medidapreventiva 10. El presente estudio se realizó para investigar los efectos del lansoprazol sobre la lesión intestinal, así como la función neurológica a corto y largo plazo (específicamente aprendizaje y memoria) en ratones con ICH. Planteamos la hipótesis de que el lansoprazol puede inhibir la permeación del LPS debido a sus efectos protectores de la barrera intestinal, aliviando la inflamación sistémica y neurológica, y por tanto mejorando la función neurológica en ratones con ICH.
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Los experimentos se realizaron según la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Publicación NIH nº 8023, revisada en 1978). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Yantai (Aprobación nº YTDX20240526). Los materiales peligrosos se eliminaban según los protocolos institucionales de residuos químicos. La Figura 1 ilustra un diagrama esquemático del diseño experimental. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Detalles de animales
Los ratones machos CD-1 que pesaban entre 22 y 25 g se alojaban en una sala con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas. Los animales eran libres para conseguir comida y agua.
2. Preparación del modelo de ratón ICH
El modelo murino de ICH se estableció según un informeanterior 11. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (90 mg/kg), y luego colocados en un marco estereotáxico. Se perforó un pequeño orificio de reborde en la sutura coronal derecha (2,2 mm lateral a la línea media, 0,2 mm posterior al bregma). Se insertó una microjeringa en el hemisferio derecho a una profundidad de 3,5 mm desde la superficie del cráneo. Utilizando una bomba de microinfusión, se infundió colagnasa bacteriana (0,075 U en 0,5 μL de solución salina tamponada con fosfato [PBS]) a una dosis de 0,15 μL/min. La aguja se retiró suavemente después de 5 minutos. Los ratones del grupo simulado recibieron un volumen equivalente de PBS en lugar de colagenonasa. Sellé el orificio de la rebarba con cera ósea y se suturó la incisión del cuero cabelludo. La temperatura corporal de los animales se mantenía en 37°C hasta el despertar.
3. Diseño experimental
Los ratones machos CD-1 fueron asignados aleatoriamente a tres grupos: simulado, modelo y lansoprazol. El modelo ICH se estableció como se describió anteriormente. Treinta minutos después de la inducción de la ICH, los ratones del grupo con lansoprazol recibieron lansoprazol a una dosis de 30 mg/kg (la dosis de lansoprazol fue seleccionada según un informeanterior 12), administrada una vez al día durante tres días consecutivos. Los ratones en los grupos simulado y modelo recibieron inyecciones intraperitoneales de PBS. A los 3 días posteriores a la ICH, se evaluó la función neurológica a corto plazo utilizando la prueba de García, la prueba de colocación de la extremidad anterior y la prueba de rotodo. Al día 29 tras la inducción de la ICH, se realizaron las novedosas pruebas de reconocimiento de objetos y de laberinto acuático para evaluar la función neurológica a largo plazo.
4. Prueba de García
Dos investigadores, cegados ante el grupo, realizaron la prueba de García según un protocolo13 previamente reportado. La función neurológica se evaluó mediante un sistema de puntuación que va de 0 a 21. La evaluación consta de siete subpruebas, cada una puntuada de 0 a 3 (0 = peor, 3 = mejor).
5. Prueba de colocación de las extremidades anteriores
Tras la prueba de Garcia, la prueba de colocación de la extremidad anterior se realizó según un método14 previamente descrito. Los ratones se mantenían en posición vertical, paralela a la mesa, permitiendo que sus vibrisas rozaran la superficie. Se observó la colocación de las extremidades anteriores en 10 ensayos consecutivos. El porcentaje de colocación de la extremidad anterior izquierda se calculó como: Colocación de la extremidad anterior izquierda / (Colocación de la extremidad anterior izquierda + Colocación de la extremidad anteriora derecha) × 100%.
6. Prueba rotatoria
Tras la prueba de colocación de la extremidad anterior, los ratones se colocaron sobre una varilla giratoria a 5 rpm durante 3 minutos para entrenamiento. La varilla se aceleró de 5 rpm a 30 rpm durante 4 minutos. La duración que cada ratón permaneció en la varilla se registró durante un periodo de 5 minutos, y la latencia de escape fuede 15.
7. Ensayo de permeabilidad intestinal y edema cerebral
Tras la prueba rotatoria, se seleccionaron al azar seis ratones de cada grupo. Según el métodoanterior 16, el FITC-dextrán se administró intragásticamente a una dosis de 300 mg/kg. Tres horas después, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se recogió sangre del plexo venoso retroorbitario, centrifugada a 4 °C y 11.000 × g durante 5 minutos. El contenido de FITC-dextrán se analizó utilizando un lector de placas de fluorescencia a 485 nm de excitación y 528 nm de emisión. Luego se decapitaba a los animales y se recogía y pesaba el hemisferio derecho del cerebro para obtener el peso húmedo. El tejido se secó a 100 °C durante 24 horas para determinar el peso seco. El contenido de agua cerebral (%) se calculó como: [(Peso húmedo − Peso seco) / Peso húmedo] × 100%.
8. Evaluación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB)
Tras la prueba de rotodo, se seleccionaron al azar seis ratones de cada grupo para evaluar la permeabilidad a la BBB. Se administró intraperitonealmente una solución de azul de Evans al 2% a 4 mL/kg. Tres horas después, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se realizó perfusión transcárdica usando PBS. El hemisferio derecho del cerebro se homogeneizó en un 50% de ácido tricloroacético en una proporción de 3:1 (tejido cerebral: ácido tricloroacético). El homogenado se centrifugó a 15.000 × g y 4 °C durante 20 minutos. Luego, se mezclaron 500 μL del sobrenadante con 500 μL de etanol al 70% y se incubaron durante la noche a 4 °C en la oscuridad. La concentración de azul de Evans se midió en 610 nm y se cuantificó usando una curva estándar. Los datos se presentan como μg de azul de Evans por mg de tejido cerebral.
9. Examen histopatológico del intestino y el cerebro
Tras la prueba rotatoria, se seleccionaron al azar tres ratones de cada grupo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano. El yeyuno, el íleon y el cerebro se recogieron y fijaron en un 10% de formaldehído. Los tejidos se seccionaron con un grosor de 5 μm y se realizó una tinción de hematoxilina-eosina (HE). El examen histopatológico del intestino y el cerebro fue realizado mediante un microscopio por dos experimentadores que estaban ciegos ante las tareas grupales. El número de microglías que rodean el hematoma se contó en secciones representativas. Se realizaron recuentos celulares en cinco campos visuales arbitrarios distribuidos en tres secciones por animal.
10. Medición de LPS e IL-1β
Tras la prueba rotatoria, se seleccionaron al azar seis ratones de cada grupo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se recogió sangre. Se centrifugaron muestras de sangre a 5.000 × g y 4 °C durante 10 minutos, y se recogió suero. Se extrajo el hemisferio derecho del cerebro y se prepararon homogeneados cerebrales en una proporción de 1:3 (peso cerebral en gramos respecto al volumen PBS en mililitros). Los homogeneados se centrifugaron a 12.000 × g y 4 °C durante 10 minutos. Las concentraciones de proteínas en el sobrenadante se determinaron mediante un kit de BCA. Los niveles de LPS e IL-1β tanto en el suero como en el homogeneado cerebral se midieron utilizando kits ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante.
11. Microscopía electrónica de transmisión
Para el examen microscópico electrónico, tres animales de cada grupo fueron seleccionados aleatoriamente tras la prueba rotodo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y sometidos a perfusión transcardíaca con glutaraldehído al 2% y 2,5% de paraformaldehído en PBS de 0,1 M (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados). El cerebro, el yeyuno y el íleon se extrajeron y se colocaron en glutaraldehído al 2% en un tampón de cacodilato de 0,1 M (pH 7,4) a 4 °C durante la noche. Las muestras se transfirieron posteriormente a tetróxido de osmio al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los tejidos se cortaron en secciones ultrafinas (50 nm). Tras la deshidratación, las secciones se teñían con acetato de uranilo y citrato de plomo para su observación bajo un microscopio electrónico de transmisión. Todas las secciones fueron evaluadas de forma ciega y fotografiadas con un microscopio electrónico de transmisión.
12. Reconocimiento de objetos novedosos
A los 29 días de la modelización del ICH, se realizó la novedosa prueba de reconocimiento de objetos para evaluar la función de aprendizaje y memoria de los ratones. El primer día, no se colocaron objetos en el aparato (longitud: 40 cm, ancho: 40 cm, altura: 40 cm), lo que permitió a los ratones explorar libremente durante 5 minutos. El segundo día, se colocaron dos objetos idénticos en el aparato y se permitió a los ratones explorarlos durante 5 minutos. Veinticuatro horas después, uno de los objetos fue reemplazado por uno nuevo. Los ratones exploraron los dos objetos durante 5 minutos de nuevo. El tiempo de exploración se registraba cuando la nariz del ratón tocaba un objeto o cuando su cabeza estaba orientada hacia el objeto a menos de 1 cm. El tiempo dedicado a explorar el objeto novedoso fue medido y calculado. Un tiempo de exploración más largo del objeto novedoso indica una mejor capacidad de aprendizaje y memoria.
13. Laberinto acuático Morris
A los 32 días de la modelización del ICH, se evaluaron las funciones de aprendizaje y memoria utilizando el laberinto acuático Morris. El aparato consistía en una piscina circular (diámetro: 100 cm, altura: 40 cm) llena de agua (profundidad: 25 cm) mantenida a 22 °C ± 1 °C. Una plataforma de escape (diámetro: 9 cm) estaba sumergida a 1 cm bajo la superficie del agua. En la prueba de navegación, los ratones se sometieron a cuatro pruebas al día. El tiempo que tardó en encontrar la plataforma se registró como la latencia de escape. Los ratones que no localizaban la plataforma en menos de 60 segundos eran guiados suavemente hacia ella. Al quinto día, se realizó una prueba de sonda de 60 segundos. La función de memoria se evaluaba registrando la latencia de escape, el número de cruces de la plataforma y el tiempo pasado en el cuadrante objetivo. Los datos se analizaron utilizando software de seguimiento de vídeo.
14. Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 7.0. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar si los datos de cada grupo seguían una distribución normal. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey. Para comparaciones no paramétricas, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis seguida por la prueba de Dunn. Se consideró estadísticamente significativo un valor p de <0,05.
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Efectos del lansoprazol en la función neurológica a corto plazo en ratones con ICH
En comparación con el grupo simulado, los ratones del grupo ICH mostraron puntuaciones significativamente más bajas en la prueba de García (p < 0,01). Sin embargo, los ratones del grupo de lansoprazol no mostraron mejores puntuaciones de Garcia en comparación con el grupo de ICH (p > 0,05) (
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La lesión intestinal es una complicación común en pacientes con PCI. El daño intestinal inducido por la CHIC puede provocar desnutrición, hospitalización prolongada, malos resultados e inclusomortalidad 17. Utilizando un modelo animal de PCI, este estudio demostró por primera vez que el lansoprazol atenúa la lesión intestinal en ratones de ICH. Aunque el lansoprazol no mostró efectos beneficiosos sobre la función neurológica a corto plazo, mejoró significativament...
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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.
Agradecemos a Angela Morben de Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn/) por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito. El presente estudio fue financiado por subvenciones del Proyecto de Financiación de Becarios Taishan de la provincia de Shandong.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipación BCA | Beyotime Biotecnología | P0009 | |
| Colagenasa | Sigma-Aldrich | 128M4107v | |
| Tinte azul Evans | Sigma-Aldrich | MKCG7507 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| GraphPad Prism 7.0 | Software estadístico GraphPad, Boston, MA, EE.UU., www.graphpad.com | Prism 7.0 | |
| Lansoprazol y nbsp; | Shandong Yuxin pharmaceutical Co., Ltd. | 524093053 | |
| Kit LPS ELISA | Cusabio biotech Co., Ltd. | M25036407 | |
| Ratones | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK20220006 | |
| Bomba de microinfusión | Instrumentos de Precisión Mundial | Micro 3 | |
| Microjeringa | Compañía Hamilton | SYR 10 y mu; L | |
| Microscopio Olympus | Olympus Co., Ltd. | IX-70 | |
| Rotarod | Panlab Co., Ltd. | LE8205 | |
| Marco estereotáxico | Kopf Instruments | Modelo 902-A | |
| TNF-& alfa; Kit ELISA | Beyotime Biotecnología | PI301 | |
| Microscopio electrónico de transmisión | JEOL Ltd. | JEM-100SX | |
| Software de seguimiento de vídeo & nbsp; | Panlab Co., Ltd. | Smart 3.0 |
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