Mecanismos moleculares de DBNL en la insuficiencia cardíaca: desde el inmunometabolismo de los macrófagos hasta las implicaciones terapéuticas

Resumen

Presentamos un protocolo para integrar la randomización mendeliana multiómica, la transcriptómica unicelular y el cribado in silico basado en estructuras para delinear sistemáticamente el eje del macrófago tipo drebrino (DBNL) en la insuficiencia cardíaca. Sugerimos DBNL como un objetivo inmunometabólico farmacológico.

Resumen

La insuficiencia cardíaca (IC) sigue siendo un gran desafío sanitario global, con tratamientos eficaces limitados que actúan en sus mecanismos fisiopatológicos principales. En este estudio, se utilizó un enfoque multiómico integrado que combina aleatorización mendeliana (RM) y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para identificar biomarcadores potenciales y dianas terapéuticas para la IC. Utilizamos datos de estudios de asociación genómica a nivel genómico (GWASs), loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTLs), loci de rasgos cuantitativos de metilación (mQTLs) y loci de rasgos cuantitativos de proteínas (pQTLs) para investigar los mecanismos genéticos de la HF. Se realizó secuenciación de ARN unicelular para analizar la expresión génica en macrófagos cardíacos, y se empleó análisis de pseudotiempo para estudiar la regulación dinámica de DBNL durante la diferenciación de macrófagos. Las simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica identificaron ácido pirinítico (WY-14643; PubChem CID: 4594; Sinónimos: 50892-23-4; WY-14643) como posible regulador de DBNL. El análisis multiómico reveló que DBNL (similar a Drebrin) es un gen clave asociado al riesgo de IC. La secuenciación de ARN unicelular reveló que DBNL se expresa principalmente en macrófagos cardíacos y está regulada al alza bajo condiciones patológicas. La expresión de DBNL por macrófagos está asociada con el metabolismo inmunitario y las vías profibróticas, en particular las vías de señalización IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR y TGF-β. El análisis de pseudotiempo indicó que DBNL tiene un efecto regulador dinámico sobre la diferenciación de los macrófagos, especialmente en la inflamación crónica. El acoplamiento molecular y las simulaciones dinámicas han demostrado que el ácido piridinínico tiene un papel potencial en la regulación del DBNL. Este estudio aclara el papel de la DBNL en la progresión de la insuficiencia cardíaca y sugiere su potencial como objetivo terapéutico. Es importante destacar que la relevancia terapéutica se infiere a partir de predicciones computacionales. Estos hallazgos ofrecen novedosos conocimientos sobre el metabolismo inmunitario y la comunicación intercelular mediada por macrófagos, estableciendo una base teórica para futuras aplicaciones en la optimización de fármacos dirigidos a DBNL e investigación funcional. No obstante, se necesitan validaciones experimentales adicionales y estudios preclínicos para fundamentar la eficacia clínica de DBNL como objetivo terapéutico.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC) representa un desafío global significativo y creciente en la salud que afecta a millones de personas en todo el mundo y supone una considerable presión económica sobre los sistemas^{sanitarios 1}. Por ello, existe una necesidad urgente de intervenciones eficaces en el manejo de la insuficiencia cardíaca (IC).

La compleja fisiopatología de la insuficiencia cardíaca se origina en una contractilidad miocárdica alterada del ventrículo izquierdo, lo que conduce a una cascada de complicaciones sistémicas, como congestión pulmonar y^{periférica 2}. Sin embargo, abordar directamente los mecanismos fisiopatológicos fundamentales que subyacen a la progresión de la insuficiencia cardíaca, especialmente la remodelación adversa del miocardio, sigue siendo un desafío crítico y no cubierto³. En las últimas décadas, el ámbito de la investigación biomédica ha experimentado un cambio de paradigma sustancial, facilitado principalmente por la incorporación de tecnologías multiómicas y metodologías avanzadas de bioinformática. Estas herramientas ofrecen oportunidades excepcionales para identificar nuevos biomarcadores de enfermedades y objetivos terapéuticos. La aleatorización mendeliana (RM), un enfoque epidemiológico genético riguroso, utiliza polimorfismos de nucleótido único (SNPs) como variables instrumentales para inferir relaciones causales entre exposiciones genéticas y resultados^{clínicos 4}. Al adoptar el marco metodológico de los ensayos controlados aleatorizados, la aleatorización mendeliana (RM) aborda eficazmente los problemas de confusión y causalidad inversa para proporcionar evidencia sólida para la identificación y reutilización de objetivos farmacológicos. Paralelamente, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) revela una heterogeneidad tisular con una resolución sin precedentes, ofreciendo profundas perspectivas sobre la expresión génica específica de cada tipo celular y las redes de comunicación intercelular dentro de órganos complejos como el^{corazón 5}. El enfoque multiómico, que sintetiza datos genéticos, transcriptómicos y proteómicos, ofrece un potencial considerable para elucidar los mecanismos de la enfermedad e identificar vías terapéuticas.

A pesar de estos avances tecnológicos, persisten importantes lagunas de conocimiento sobre los mecanismos celulares y moleculares específicos que impulsan la inflamación cardíaca y la remodelación en la insuficiencia cardíaca. La evidencia acumulada sugiere que las células inmunitarias, especialmente los macrófagos, son cruciales para orquestar respuestas inflamatorias y la posterior remodelación tisular durante la lesión miocárdica y los procesos de insuficiencia cardíaca crónica, que a su vez son cruciales para la progresión de la^{enfermedad 6}. Las investigaciones previas se han centrado predominantemente en mediadores inflamatorios amplios o marcadores de superficie celular, lo que ha supuesto una brecha significativa en la exploración de objetivos reguladores intracelulares dentro de estas poblaciones cruciales de células inmunitarias. Además, aunque los estudios tradicionales de asociación genómica a nivel genómico (GWAS) han identificado numerosas asociaciones genéticas relacionadas con la insuficiencia cardíaca, con frecuencia encuentran dificultades para establecer relaciones causales definitivas, limitando así su aplicabilidad para la traducción terapéutica^directa. En consecuencia, la implementación de un marco integral multiómico de aleatorización mendeliana (MR), que incorpora variantes genéticas que influyen en la metilación del ADN (mQTLs), la expresión génica (eQTLs) y la abundancia de proteínas (pQTLs), es esencial para lograr inferencias causales más robustas a través de múltiples capas reguladoras biológicas. Este enfoque aborda las limitaciones inherentes asociadas a los estudios QTL de una sola capa. Cabe destacar que la proteína similar a la drebrin (DBNL) ha sido objeto de una extensa investigación en el contexto del desarrollo neuronal y la dinámica del^{citoesqueleto 8}; Sin embargo, su importancia funcional y su potencial terapéutico en enfermedades cardiovasculares, especialmente la insuficiencia cardíaca, siguen siendo en gran medida inexplorados. Esta importante laguna en nuestra comprensión dificulta la consideración de DBNL como un objetivo novedoso y potencialmente viable para el desarrollo de fármacos en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.

Para abordar estas carencias críticas de conocimiento, este estudio pretende identificar de forma robusta genes clave causalmente asociados con el riesgo de insuficiencia cardíaca mediante un marco integrado de RM multiómica que combina datos de eQTL, mQTL y pQTL. Este estudio presenta un enfoque novedoso que implica la integración de análisis de aleatorización multiómica mendeliana —incluyendo loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTLs), loci de rasgos cuantitativos de metilación (mQTLs) y loci de rasgos cuantitativos de proteínas (pQTLs)— con datos transcriptómicos de célula única de alta resolución (GSE161470) y datos transcriptómicos masivos (GSE161472) para identificar sistemáticamente el gen DBNL como un factor de riesgo causal crítico para la insuficiencia cardíaca. Estos hallazgos demuestran que DBNL se expresa predominantemente y específicamente en macrófagos cardíacos y que su expresión cambia dinámicamente a lo largo de su proceso de diferenciación. Además, los resultados de este estudio aclaran el papel fundamental de DBNL en la modulación del microambiente inmunitario cardíaco y en la orquestación de vías inmunometabólicas asociadas a insuficiencia cardíaca, como la cascada de señalización IL-6/JAK/STAT3, así como las vías de señalización profibrótica. Además, mediante el emple de técnicas de biología computacional, esta investigación predice que el ácido piridílico (WY-14643) es un ligando de alta afinidad para DBNL, proporcionando así un marco teórico integral y multidimensional que respalda la designación de DBNL como un nuevo objetivo terapéutico para la insuficiencia cardíaca y facilita el desarrollo de intervenciones farmacológicas específicas. Utilizando la secuenciación de ARN unicelular, caracterizamos las vías específicas de expresión celular y funcionales del gen clave DBNL identificado en el microambiente cardíaco, e investigamos el papel de DBNL en las vías inmunometabólicas y de señalización profibrótica, así como en la comunicación célula-célula entre tipos de células cardíacas. Se identificaron ligandos potenciales de moléculas pequeñas para DBNL mediante acoplamiento molecular computacional y simulaciones de dinámica molecular. Planteamos la hipótesis de que el DBNL, que se expresa principalmente en macrófagos cardíacos, ejerce un efecto causal en la progresión de la insuficiencia cardíaca al regular las vías inmunometabólicas y la diafonía intercelular. En resumen, al integrar la randomización mendeliana multiómica avanzada con análisis de célula única de alta resolución, hemos identificado y caracterizado sistemáticamente nuevos objetivos terapéuticos para la insuficiencia cardíaca y explorado posibles dianas moduladoras de pequeñas moléculas.

Protocolo

Descarga de datos
Datos de expresión génica
Los datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) utilizados en el presente estudio procedieron del repositorio Gene Expression Omnibus (GEO) mantenido por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), específicamente del conjunto de datos con número^{de acceso 9} GSE161470 (tejido cardíaco humano compuesto por cuatro muestras de control y una muestra patológica). Este conjunto de datos fue publicado originalmente por Zhang et al. en 2022¹⁰. El objetivo principal de la investigación original fue examinar la heterogeneidad celular y los mecanismos regulatorios moleculares en el tejido cardíaco humano bajo condiciones de insuficiencia cardíaca. Para el análisis actual, se seleccionaron cinco muestras de este conjunto de datos, cada una con perfiles completos de expresión unicelular derivados de tejido cardíaco humano. El otro conjunto de datos utilizado en este estudio también se obtuvo del repositorio público NCBI GEO, específicamente del Archivo de Matriz de Serie correspondiente al número de acceso GSE161472, acompañado del archivo de anotaciones GPL11154. El perfil de expresión comprende un total de 84 muestras, incluyendo 37 muestras de control y 47 muestras de enfermedades. Esta investigación abarca un análisis integrativo de multiómica, con todas las investigaciones realizadas utilizando datos accesibles públicamente.

Datos eQTL
Los datos de eQTL, obtenidos del consorcio eQTLGen, se centran en esclarecer el marco genético de la expresión génica en sangre y los factores genéticos que influyen en los rasgos^{complejos 3}. Actualmente, el consorcio está en la segunda fase de su extenso proyecto, realizando metaanálisis de datos genómicos a escala relativa a la expresión génica en sangre.

Datos de exposición - mQTLs
Los datos mQTL se obtuvieron de un metaanálisis publicado de la cohorte europea (EUR), que examina la metilación del ADN en sangre entera dentro del marco genético de 3.701 muestras de poblaciones de ascendencia europea¹¹. El conjunto de datos incluyó información sobre 426.636 rasgos mQTL.

Datos de exposición-pQTL
Los datos de pQTL plasmático se adquirieron de la base de datos deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)⁴. Este estudio utilizó la publicación de datos de 2021 del conjunto de datos deCODE pQTL, que abarcaba un estudio de asociación genómica (GWAS) de niveles de proteínas plasmáticas medidos utilizando 4.907 áptanos en una cohorte de 35.559 individuos de ascendencia europea.

Datos de resultados
Las estadísticas resumen de insuficiencia cardíaca se obtuvieron de un estudio de asociación genómica a gran escala (GWAS) que involucró principalmente a participantes de ascendencia europea, accedido a través de la base de datos del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) (GCST90162626). El conjunto de datos de insuficiencia cardíaca incluyó 115.150 casos y 1.550.331 controles. El Catálogo GWAS, que abarca publicaciones, asociaciones líderes y estadísticas resumidas detalladas, ofrece actualmente datos mapeados al Genome Assembly y a la compilación dbSNP.

Análisis de aleatorización mendeliana de mQTLs, eQTLs y pQTLs
Para investigar sistemáticamente las posibles relaciones causales entre la expresión génica, la abundancia de proteínas, los niveles de metilación del ADN y el riesgo de insuficiencia cardíaca, se realizaron análisis de aleatorización mendeliana (RM) utilizando loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTLs), loci cuantitativos de rasgos de proteínas (pQTLs) y conjuntos de datos de loci de rasgos cuantitativos de metilación (mQTLs). Durante la fase de preprocesamiento de datos de exposición, se extrajeron polimorfismos de nucleótido único (SNPs) asociados a cada variable de exposición (gen, proteína o sitio de metilación) de las respectivas bases de datos con un umbral de significancia genómica de P < 1 × 10⁻⁵ para servir como variables instrumentales (IVs) candidatas iniciales. Posteriormente, se realizó agrupación por desequilibrio de ligamiento (LD) para los IVs de cada factor de exposición utilizando un tamaño de ventana de 10.000 kilobases (kb) y un umbral LD R² de 0,001 para asegurar la independencia entre los instrumentos. Estas vías seleccionadas se armonizaron luego con estadísticas resumidas de un estudio de asociación genómica global de insuficiencia cardíaca (GWAS; ID: GCST90162626) empleando la función read_outcome_data, reteniendo solo aquellos SNPs que presenten un valor de asociación P inferior a 5×10⁻⁵ en el conjunto de datos de resultados. Para mitigar el sesgo débil del instrumento, la estadística F para cada IV se calculó como F = (β_exposure/SE_exposure)², y solo se incluyeron instrumentos con F > 10 en análisis posteriores. Para la estimación del efecto causal, la alineación de alelos entre los conjuntos de datos de exposición y resultados se realizó utilizando la función harmonize_data del paquete TwoSampleMR. Posteriormente se realizaron análisis de RM empleando cuatro enfoques estadísticos complementarios: (1) el método ponderado por la varianza inversa (IVW), que proporciona metaanálisis de estimaciones de la razón de Wald entre SNPs; (2) regresión MR-Egger, que tiene en cuenta la pleiotropía direccional incorporando un término de intercepción bajo la suposición Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE); (3) el método de la mediana ponderada, que proporciona estimaciones causales consistentes incluso si hasta el 50% de los instrumentos son inválidos; y (4) el método del modo ponderado, que identifica el clúster de estimaciones de efectos causales más frecuente, ofreciendo un mayor poder estadístico y reducción del error tipo I en relación con MR-Egger. En casos en los que solo había una variable instrumental disponible, se aplicaba exclusivamente el método de la proporción de Wald. Para evaluar la robustez de los hallazgos, se realizaron análisis de sensibilidad integrales, incluyendo pruebas de heterogeneidad mediante la función mr_heterogeneity, evaluación de pleiotropía usando mr_pleiotropy_test y análisis leave-one-out implementados mediante la función mr_leaveoneout, que excluye iterativamente cada SNP para determinar la influencia de variantes individuales en los resultados generales. Se visualizaron asociaciones significativas utilizando herramientas gráficas como mr_scatter_plot y mr_forest_plot. Esta cadena analítica se aplicó de forma uniforme a los conjuntos de datos eQTL, pQTL y mQTL para mantener la consistencia metodológica a lo largo del estudio.

Análisis de colocalización
Se realizó un análisis de colocalización mediante el método Coloc, datos resumen eQTL y un GWAS de insuficiencia^{cardíaca 5}. El polimorfismo de nucleótido único índice (SNP) se utilizó para calcular la probabilidad posterior dentro de una ventana de agrupamiento de 100 kb. En el análisis de colocalización (coloc), la Hipótesis H3 denota la probabilidad posterior de que los dos rasgos, es decir, la expresión génica y la insuficiencia cardíaca, estén correlacionados pero posean variantes causales distintas. Por el contrario, la Hipótesis H4 indica la probabilidad posterior de que la asociación entre ambos rasgos sea atribuible a una única variante causal compartida. Un umbral del SNP. PP. Se utilizó H4 superior a 0,90 para determinar la colocalización.

Infiltración inmune
El método CIBERSORT es una técnica ampliamente adoptada para evaluar los tipos de células inmunitarias dentro del microambiente¹². Utilizando los principios de regresión de vectores de soporte, se puede realizar un análisis de deconvolución de la matriz de expresión de subtipos de células inmunitarias. Incorporando 547 biomarcadores, CIBERSORT puede diferenciar 22 fenotipos de células inmunitarias humanas, incluyendo células T, células B, células plasmáticas y diversas subpoblaciones de células mieloides. Utilizando el conjunto de datos GSE161472, se realizó un análisis empleando el algoritmo CIBERSORT junto con su matriz integrada de firma LM22, que caracteriza los perfiles de expresión génica de 22 tipos distintos de células inmunitarias humanas. Los niveles de infiltración de estas 22 poblaciones de células inmunitarias se cuantificaron para cada muestra individual. Posteriormente, se aplicó la función cor.test para evaluar las correlaciones entre la expresión de genes clave y los correspondientes niveles de infiltración de células inmunitarias.

Procesamiento de datos y control de calidad de secuenciación de ARN de célula única
Los datos del perfil de expresión de célula única se procesaron usando el encapsulado Seurat (V4.3.0) en el entorno R (V4.3.0^{) 6}. Este estudio utilizó un flujo de trabajo convencional para el análisis de datos de secuenciación de ARN unicelular. Inicialmente, los perfiles de expresión se importaban utilizando el paquete Seurat. Las células fueron filtradas en base a varias métricas de calidad, incluyendo el recuento total de UMI de cada célula, el número de genes expresados, la proporción de lecturas mitocondriales y la proporción de lecturas ribosómicas. Se identificaron valores atípicos como valores que se desvían de la mediana en más de tres desviaciones absolutas medianas (MAD). Los umbrales específicos de filtrado aplicados fueron los siguientes: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 y nCount_RNA ≤ 5194,27. Normalmente, las células con recuentos totales excesivamente altos de UMI y números de genes expresados se clasificaban como dobletes, mientras que las células con porcentajes elevados de lecturas mitocondriales o ribosómicas se consideraban de baja calidad, potencialmente sufriendo apoptosis o fragmentación. Siguiendo estos pasos de filtrado, se empleó DoubletFinder (versión 2.0.4) para identificar y eliminar dobletes de cada muestra individualmente, completando el proceso de control de calidad de las celdas. Inicialmente, la normalización de datos se realizó utilizando la función normalizeData. El estado del ciclo celular fue evaluado posteriormente mediante la función CellCycleScoring, y se identificaron genes altamente variables mediante el método FindVariableFeatures. El conjunto de datos se escaló posteriormente utilizando ScaleData para estandarizar los datos y mitigar la influencia de genes mitocondriales, genes ribosómicos y efectos del ciclo celular en los análisis posteriores. La reducción lineal de la dimensionalidad se realizó mediante análisis de componentes principales (PCA) mediante la función RunPCA, seleccionando componentes principales significativos para análisis posteriores. Para abordar los efectos por lotes entre diferentes muestras, se empleó el algoritmo Harmony (versión 1.1.0). Este enfoque agrupa iterativamente células similares de lotes distintos dentro del espacio PCA, manteniendo la diversidad de lotes dentro de los conglomerados. Dado el relativamente leve efecto por lotes observado en el conjunto de datos, se aplicaron parámetros predeterminados (θ = 2). Posteriormente se realizó una reducción no lineal de dimensionalidad utilizando RunUMAP, seguida de la construcción de un grafo de vecindad de celdas mediante FindNeighbors y el agrupamiento de celdas mediante FindClusters. Para la anotación de tipos celulares, se implementó un marco jerárquico de anotación: la anotación manual primaria se basaba en patrones característicos de expresión génica informados por la base de datos CellMarker y la literatura pertinente; esto se complementaba con resultados de anotaciones automatizadas obtenidos del software SingleR como referencia. Para aumentar aún más la precisión y exhaustividad de la identificación de tipos celulares, se consultaron múltiples bases de datos autorizadas, incluyendo el Atlas Celular Humano Primaria (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell y NovershternHaematopoietic. La anotación de celdas se realizaba consultando la base de datos CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) y revisando la literatura, con la ayuda del soporte automatizado de anotación proporcionado por el software SingleR (V2.4.0^{) 13}. Su objetivo es identificar los tipos celulares presentes en el tejido correspondiente y sus genes marcadores^{asociados 14}.

Análisis de las interacciones ligando-receptor
En este estudio, CellCall (versión 1.0.7) se utilizó para realizar un análisis exhaustivo de las redes de comunicación^{intercelular 15}. Utilizando anotaciones de tipo celular derivadas de Seurat junto con la matriz de recuento en bruto, se construyó un objeto de análisis normalizado con parámetros configurados para el genoma humano. La función TransCommuProfile se aplicó para cuantificar la intensidad de las interacciones célula-célula mediante un algoritmo ponderado, implementando un umbral de significancia de un valor p < 0,05 para identificar pares ligando-receptor fiables. Los pares de interacción significativos fueron posteriormente sometidos a un análisis de enriquecimiento de vías KEGG mediante la función getHyperPathway, y las relaciones entre tipos celulares y vías se ilustraron mediante diagramas de burbujas. La red de comunicación general se visualizó finalmente mediante un gráfico circular, en el que ocho colores distintos indicaban diferentes tipos de células. La intensidad de la interacción y la direccionalidad se representaban mediante características de flechas, proporcionando una caracterización detallada de la dinámica de la señalización intercelular.

Análisis del pseudotiempo
Para investigar la regulación transcripcional dinámica de los macrófagos a lo largo de la progresión de la insuficiencia cardíaca, este estudio utilizó el algoritmo Monocle para realizar análisis de pseudotiempo en subpoblaciones de macrófagos. La matriz de expresión génica correspondiente a las subpoblaciones celulares objetivo fue extraída para construir objetos de análisis de trayectoria de una sola célula, seleccionando genes altamente variables como características de orden. Mediante el empleo de la técnica de reducción de dimensionalidad DDRTree, las células se mapearon en un espacio bidimensional para reconstruir la trayectoria de diferenciación. Se realizaron análisis de visualización para determinar la distribución de las células a lo largo del eje del pseudotiempo e identificar genes cuya expresión cambió significativamente a lo largo del pseudotiempo. Los análisis posteriores se centraron en el gen clave DBNL y caracterizaron su dinámica de expresión a lo largo de la trayectoria celular, esclareciendo los mecanismos de reprogramación transcripcional de los macrófagos durante la progresión de la insuficiencia^{cardíaca 16}.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos (GSEA)
En este estudio, se utilizó un enfoque GSEA para dilucidar los mecanismos reguladores asociados a genes clave implicados en la insuficiencia cardíaca. Utilizando genes clave previamente identificados, las muestras se estratificaron en cohortes de alta y baja expresión en función del valor mediano de expresión. Se realizó un análisis diferencial de expresión utilizando el paquete limma, generando una lista de genes ordenada según el cambio de pliegue log (logFC). El análisis posterior de enriquecimiento de vías KEGG se realizó utilizando la herramienta clusterProfer, utilizando conjuntos de genes procedentes de la base de datos MsigDB como base de referencia de fondo. El algoritmo GSEA se aplicó entonces para identificar vías de señalización significativamente enriquecidas entre los dos grupos de expresión, y se utilizó un umbral ajustado de valor p inferior a 0,05 para determinar la significancia estadística. Para ilustrar las funciones reguladoras de los genes centrales dentro de las vías críticas, se utilizaron diversas técnicas de visualización, incluyendo gráficos GSEA multivía y diagramas de redes circulares.

Análisis de variación de conjuntos génicos (GSVA)
GSVA es un enfoque no paramétrico y no supervisado utilizado para evaluar el enriquecimiento de conjuntos génicos dentro de datos transcriptómicos. Este método transforma variaciones a nivel de gen en variaciones a nivel de vía calculando puntuaciones compuestas para conjuntos genéticos específicos, facilitando la evaluación de cambios funcionales biológicos en diversas muestras. En el presente estudio, los conjuntos génicos se obtuvieron de la Molecular Signatures Database. El algoritmo GSVA se empleó para calcular puntuaciones compuestas para cada conjunto génico, permitiendo evaluar posibles alteraciones funcionales biológicas en diferentes muestras. Los resultados del análisis de enriquecimiento GSVA se proporcionan en el material suplementario (Tabla Suplementaria 1).

Predicción de fármacos para la DTC
El gen objetivo (DBNL) se introdujo en el campo de búsqueda de la Base de Datos Comparativa de Toxicogenómica (CTD), se seleccionó la categoría de enfermedad "enfermedad cardiovascular" y se ejecutó la consulta para obtener datos de predicción de fármacos asociados a la condición "insuficiencia cardíaca". Los resultados de predicción obtenidos se importaron posteriormente al software de Cytoscape para facilitar la visualización de datos y permitir la construcción de un mapa de red de interacción génicoquímica.

Métodos de acoplamiento molecular
Debido a la estructura cristalina tridimensional no resuelta de la proteína DBNL humana (UniProt ID: Q9UJU6), este estudio predijo la estructura tridimensional de DBNL basándose en AlphaFold3¹⁷. El ácido pirínixo (WY-14643) está disponible para descargar en la base de datos PubChem (PubChem CID: 5694). Posteriormente, la estructura de la proteína se preprocesó utilizando el software MGLTools (versión 1.5.7)¹⁸, incluyendo pasos como la adición de átomos de hidrógeno. Al mismo tiempo, las proteínas y moléculas pequeñas se convirtieron en el formato PDBQT necesario para el acoplamiento. El software AutoDock Vina (versión 1.1.2)¹⁹ se utilizó para el acoplamiento molecular global (exogeniidad=16, num_modes=30) para explorar posibles modos de unión. Al completar los cálculos de acoplamiento, la conformación compleja con mayor afinidad, indicada por la menor energía libre de enlace, debe seleccionarse como estructura inicial para simulaciones posteriores de dinámica molecular.

Método de simulación de dinámica molecular
Para investigar sistemáticamente la estabilidad de unión y los mecanismos de interacción entre compuestos candidatos y proteínas, se realizaron simulaciones convencionales de dinámica molecular (MD) utilizando el paquete de software GROMACS (versión 2024.03)²⁰. Los parámetros de la proteína se generaron utilizando el campo de fuerza Amber14SB²¹, el modelo de moléculas de agua se generó usando el modelo²² de TIP3P, y los parámetros de topología del ligando se generaron utilizando la herramienta Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), que se basa en el General Amber Force Field (GAFF). El sistema complejo ligando-proteína se situó posteriormente dentro de una caja octaédrica periódica de límite llena de moléculas de agua TIP3P. Se introdujeron iones de sodio (Na⁺) y cloruro (Cl⁻) para lograr una concentración de 0,15 mol/L y neutralizar la carga total del sistema. Al finalizar la construcción del sistema, el primer paso consistía en minimizar la energía utilizando el método de descenso más pronunciado durante 50.000 escalones, con el objetivo de eliminar cualquier conformación potencialmente irrazonable dentro de la estructura. Posteriormente se realizaron dos etapas de equilibrio del sistema: una simulación NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) de 100 ps seguida de una simulación NPT (número constante de partículas, presión y temperatura) de 100 ps. Durante estas simulaciones, se aplicaron restricciones de posición a los átomos pesados de la columna vertebral de la proteína para preservar la integridad estructural de la proteína. La temperatura se mantenía en 300 K usando el termostato de reescala en V, y la presión se regulaba en 1 bar empleando el barostato de Parrinello-Rahman para el acoplamiento de presión. Al completar la fase de equilibrio, se realizó una simulación de la fase de producción que duró 100 nanosegundos, durante la cual se eliminan todas las restricciones posicionales. La trayectoria se integró mediante un paso de tiempo de 2 femtosegundos, y se empleó el método de malla de partículas (PME) para gestionar con precisión interacciones electrostáticas a larga distancia. La trayectoria se guardaba cada 10 ps, y se generaban un total de 10.000 fotogramas para análisis posteriores. Además, se extrajeron trayectorias estables en el intervalo de 90-100 ns de la simulación, y la energía libre de unión de los complejos proteicos de ligandos se calculó utilizando la herramienta^{MMPBSA 23} de GMX.

Análisis estadístico
La validez de este análisis de aleatorización mendeliana (RM) depende de tres supuestos fundamentales. (1) Relevancia: Las variables instrumentales (IVs) deben mostrar una fuerte asociación con la exposición. (2) Independencia: Los IVs deben ser independientes de cualquier factor de fusión que afecte tanto a la exposición como al resultado. (3) Restricción de exclusión: Las IVs deben influir exclusivamente en el resultado a través de su impacto en la exposición. Una ruptura de esta suposición, cuando una vía intravenosa afecta el resultado a través de vías que no implican la exposición, se denomina pleiotropía horizontal. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión 4.3.0 de R, con pruebas de dos caras, y un valor p inferior a 0,05 se consideró generalmente indicativo de significación estadística.

Resultados

Identificación de DBNL como un gen asociado al riesgo de insuficiencia cardíaca mediante análisis de aleatorización y colocalización mendeliana
El identificador de resultados para muestras relacionadas con insuficiencia cardíaca, GCST90162626, se obtuvo del conjunto de datos estadístico resumen. Se determinaron relaciones causales entre 1.247 pares de loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTLs) y resultados utilizando las funciones extract_instruments y extract_outcome_data (Tabla Suplem...

Discusión

Aunque la inflamación constituye un aspecto fundamental de la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca (IC), investigaciones previas se han centrado predominantemente en mediadores inflamatorios generalizados y marcadores de la superficie^celular 17,18,24. Este enfoque ha limitado la elucidación de los mecanismos celulares específicos implicados. Para superar estas limitaciones, utilizamos un ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Base de Datos CellMarker	Universidad Médica de Harbin (CellMarker 2.0)	http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/	Base de Datos CellMarker; Para consultar genes marcadores de tisul/tipo celular durante la anotación de células individuales
Base de Datos de Toxicogenómica Comparativa (CTD)	CTD (Universidad de Duke y otros)	http://ctdbase.org/	Base de datos CTD; Para recuperar interacciones entre químicos, genes, fenotipos y enfermedades, utilizado para la predicción de fármacos
Conjunto de datos pQTL de plasma deCODE (2021, 4.907 áptanos, 35.559 muestras europeas)	Genética deCODE	https://www.decode.com/summarydata/	Publicación de datos pQTL de 2021; Utilizado como datos de exposición pQTL para análisis de RM
eQTLGen Whole Blood eQTL Data	Consorcio eQTLGen	https://www.eqtlgen.org/	eQTLGen fase I/II (versión específica según su uso); Utilizado como datos de exposición eQTL para análisis de RM y localización
Conjunto de datos GEO Single-cell RNA-seq GSE161470 (Tejido Cardíaco Humano: 4 muestras de control + 1 de análisis patológico)	Omnibus de Expresión Génica NCBI (GEO)	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470	GSE161470; Obtener datos de secuenciación de ARN unicelular del tejido cardíaco humano para análisis posteriores
Catálogo GWAS	NHGRI– EBI	https://www.ebi.ac.uk/gwas/	Catálogo de GSA; Recuperar información, anotaciones y análisis auxiliares relacionados con HF
Estadísticas resumen GWAS de insuficiencia cardíaca (GCST90162626)	NHGRI– Catálogo EBI GWAS	https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626	Acceso al estudio: GCST90162626; Se utiliza como datos de resultados para análisis de RM y colocalización
Base de Datos de Firmas Moleculares (MSigDB) v7.0	Instituto Broad	https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb	MSigDB v7.0; Para conjuntos de genes de fondo GSEA / GSVA y anotaciones de vías
Datos estructurales del ácido piríníxico (WY-14643) (PubChem)	NCBI PubChem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694	PubChem CID: 5694; Utilizado para obtener estructura 3D de ligandos para acoplamiento molecular y simulación dinámica
Base de Datos de Proteínas UniProt (DBNL, ID UniProt: Q9UJU6)	Consorcio UniProt	https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6	UniProt: Q9UJU6; Utilizado para obtener la secuencia de aminoácidos de DBNL para la predicción de estructuras y acoplamiento
Metaanálisis mQTL de sangre entera (Ref 11, 3.701 muestras europeas, 426.636 rasgos mQTL)	Autores / Consorcio (según tu referencia 11)	Autor pendiente para añadir la URL original de la base de datos / DOI	DOI de referencia o ID de conjunto de datos; Utilizado como datos de exposición mQTL para análisis de RM