Artículo de método

Mapeo óptico de anomalías electrofisiológicas y de manipulación del calcio en un modelo de rata de pericarditis estéril

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DOI:

10.3791/69767

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27 de enero de 2026

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1Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Research Center of Ion Channelopathy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Institute of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Key Lab for Biological Targeted Therapy of Education Ministry, 5Hubei Provincial Engineering Research Center of Immunological Diagnosis and Therapy for Cardiovascular Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 6Department of Cardiology, Xuzhou Central Hospital, 7Institute of Cardiovascular Diseases & Department of Cardiology, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el mapeo óptico dual de los transitorios de voltaje y calcio en corazones de pericarditis estéril de rata para evaluar la remodelación auricular inducida por inflamación subyacente a la fibrilación auricular postoperatoria.

Resumen

La fibrilación auricular postoperatoria (POAF) aparece frecuentemente tras una cirugía cardíaca y está asociada con inflamación auricular y remodelación. El modelo de pericarditis estéril (SP) reproduce esta condición en ratas, proporcionando una plataforma valiosa para investigar la electrofisiología auricular inducida por inflamación. Este protocolo describe la preparación de corazones de rata perfundidos con Langendorff tras la inducción de SP y el uso simultáneo de mapeo óptico dual para registrar el voltaje transmembrana y los transitorios de calcio. Los corazones se tiñen con el tinte sensible al voltaje RH237 y el indicador de calcio Rhod-2 AM, mientras que la contractilidad se suprime mediante blebbistatina para minimizar los artefactos de movimiento. La imagen de alta velocidad permite el mapeo espaciotemporal de los potenciales de acción auricular y la dinámica del calcio durante protocolos de estimulación controlada. Los parámetros cuantitativos incluyen la duración del potencial de acción, la velocidad de conducción, la duración del transitorio de calcio, el tiempo hasta el pico y la magnitud de los alternantes. El método permite una evaluación precisa de la heterogeneidad de conducción auricular, el acoplamiento electrocalcio y la vulnerabilidad a arritmias bajo estrés inflamatorio. Este enfoque visualizado proporciona una plataforma reproducible y versátil para estudiar los mecanismos POAF y probar intervenciones farmacológicas o genéticas que actúan en la remodelación auricular.

Introducción

La fibrilación auricular postoperatoria (FAP) es una complicación común tras la cirugía cardiotorácica, caracterizada por episodios transitorios de fibrilación auricular (FA) que suelen alcanzar su pico entre 2 y 4 días tras la cirugía. Aunque la POAF suele ser autolimitada, se asocia a un mayor riesgo de ictus, estancias hospitalarias más largas y mayores costessanitarios 1. El estrés inflamatorio en el miocardio auricular se considera un factor clave en supatogénesis 2.

El modelo de pericarditis estéril (SP) es un modelo animal pequeño bien establecido para estudiar laPOAF 3,4. En este modelo, la aplicación epicárdica de talco induce inflamación pericárdica localizada que imita cambios postoperatorios. Estudios previos que han utilizado este modelo han demostrado remodelación estructural, expresión alterada de la unión gap y anomalías en el manejo del calcio que predisponen a la arritmogénesis 5,6,7. Sin embargo, las técnicas electrofisiológicas convencionales proporcionan información espaciotemporal limitada, lo que dificulta capturar la heterogeneidad de conducción y la dinámica de acoplamiento electrocalcio a lo largo de la superficie auricular intacta.

El mapeo óptico permite la imagen simultánea de alta resolución del voltaje transmembrana y los transitorios de calcio (CaT) a lo largo de la superficie auricular, lo que permite una visualización precisa de la conducción auricular, la repolarización y la señalización decalcio 8. En este protocolo, describimos el mapeo óptico dual en corazones de rata SP perfundidos por Langendorff. Este enfoque permite cuantificar la velocidad de conducción, la duración del potencial de acción (APD), las propiedades de CaT y los alternantes bajo protocolos de estimulación controlada. Al integrar la evaluación eléctrica y de manejo del calcio en una preparación auricular inflamada, el método proporciona una herramienta poderosa para estudiar la base mecanicista de la POAF y para probar intervenciones terapéuticas específicas.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) bajo el ID de aprobación [2024] IACUC Número 4241 y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. Durante todo el estudio, se mantuvo el estricto cumplimiento de las directrices de bienestar animal, con criterios humanos claramente definidos: ratas que presentaban letargo persistente, pérdida repentina de peso superior al 20%, dificultad respiratoria, incapacidad para comer o beber normalmente o complicaciones postoperatorias graves fueron inmediatamente eutanasiadas mediante una sobredosis de isoflurano (5% con flujo de oxígeno de 1 L/min) para minimizar el sufrimiento.

1. Preparación de soluciones y reactivos

  1. Preparar solución de tirodo modificado (en mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,3 CaCl2, 1,05 MgCl2, 1,19NaH 2PO4, 20NaHCO 3, 11,1 glucosa. Burbujea con 95% O2/5%CO2, ajusta el pH a 7,38-7,42 y calienta a 37 ± 1 °C.
  2. Blebbistatin: Disuelve en DMSO (5 mg/mL), guárdalo a -20°C y protegido de la luz. Úsalo a una concentración final de 10 μM.
  3. RH237 (colorante sensible al voltaje): Se disuelve en DMSO (2 mg/mL), se almacena a −20 °C, protegido por la luz. Úsalo a una concentración final de 2 μM.
  4. Rhod-2 AM (indicador de calcio): Disolver en DMSO (1 mg/mL); se almacena a −20 °C, protegido de la luz. Úsalo a 0,89 μM de concentración final.
  5. F-127 plurónico (tensioactivo): solución del 20% en DMSO (reactivos disponibles comercialmente).
  6. Pentobarbital sódico (1%): Disuelva 0,1 g en 10 mL de suero para anestesia (40 mg/kg, i.p.).
    NOTA: Manipular tintes y stocks de DMSO con el EPP adecuado; Protege la blebbistatina y los tintes de la luz. Sigue las normas de bioseguridad y seguridad química.

2. Equipamiento

  1. Sistema Langendorff con control de temperatura (37 ± 1 °C), depósito, columna de burbujas y bomba peristáltica (caudal 10-12 mL/min).
  2. Imagen: Cámara CMOS de alta velocidad (≥ 1 kHz de velocidad de fotogramas; ≥ 80 × 80 píxeles de campo de visión para el atrio), fuente de excitación LED (530 ± 25 nm), divisor de haz dicróico (~630 nm), filtros de emisión (Rhod-2 ~590 nm; RH237 >700 nm), objetivo con apertura ajustable, mesa óptica con aislamiento de vibraciones. Fuente de luz de excitación: láser LED con una corriente máxima de 5 A, luz verde con una potencia máxima de 2,2 W.
  3. Estimulación: Estimulador de voltaje constante, electrodos de estimulación bipolar.
  4. Fisiología: electrodos sumergibles de ECG; sonda termistor; sustrato de fondo negro (caucho) para reducir la contaminación por luz ventricular; instrumentos quirúrgicos finos; Ventilador para ratas. El inventario detallado está disponible en la Tabla de Materiales.

3. Inducción de pericarditis estéril (SP) en ratas

  1. Anestesiar ratas Sprague-Dawley machos (200-220 g) con pentobarbital sódico al 1% (40 mg/kg, i.p.). Confirma la profundidad de la anestesia (pérdida del reflejo pedal).
  2. Intuba a la rata usando una cánula de polietileno o metal bajo visualización directa. Avanza el tubo con cuidado hacia la tráquea, colocándolo justo encima de la carina, y fijalo para evitar el desplazamiento. Conéctate a un ventilador configurado a un volumen de marea de 2 mL/100 g, 55 respiraciones/min, I:E = 1:1. Confirma la ventilación efectiva observando la expansión simétrica del pecho y la respiración estable.
    NOTA: Evita colocaciones profundas o superficiales para evitar intubaciones bronquiales o extubaciones accidentales.
  3. Prepara el campo quirúrgico. Realiza una pequeña toracotomía paraesternal (segundo espacio intercostal cerca del esternón). Descubre suavemente el corazón.
  4. Levanta el timo para visualizar ambas aurículas. Abre cuidadosamente el pericardio sobre las superficies auriculares con pinzas finas.
  5. Aplica talco estéril de forma uniforme sobre las superficies auriculares izquierda y derecha usando una espátula fina (dosis de talco: 50 mg/100 g de peso corporal de rata). Evita derramar sobre grandes vasos o ventrículos. Reemplaza el timo sobre las aurículas para limitar la migración del talco.
  6. Reposiciona los músculos del pecho para cubrir la incisión quirúrgica intercostal. Tras la desinfección con povidona-yodo al 0,5%, sutura los músculos y la piel para cerrar la cavidad torácica y administra penicilina (160.000 U/100 g, i.p.) postoperatoriamente.
  7. Sham: Toracotomía sin pericardiotomía ni aplicación de talco.
    NOTA: Aplicar una capa fina y uniforme de talco solo en el epicardio auricular; Una contaminación excesiva por talco o ventricular aumenta la mortalidad y puede confundir las lecturas específicas del auricular. Estudios previos han confirmado que la cirugía de pericarditis aséptica en ratas causa miocarditis auricular grave con fibrosis marcada y factores inflamatorios elevados, incluyendo IL-6, IL-1β y TGF-β1 3,9.

4. Aislamiento cardíaco y perfusión de Langendorff

  1. En el tercer día tras la cirugía, anestesiar a las ratas con isoflurano (2-3%) mediante un cono nasal y administrar heparina sistémica (250 U/Kg, i.p.) para evitar la formación de coágulos intravasculares que podrían obstruir la circulación coronaria y comprometer la perfusión de Langendorff. Este momento se seleccionó basándose en nuestros hallazgos previos in vivo de que la inducibilidad de la FA alcanza su pico 3-4 días después de la SP3, permitiendo capturar la fase arritmogénica aguda impulsada por la inflamación, evitando al mismo tiempo adherencias posteriores que interfieren con la carga de colorantes y los registros ópticos.
    NOTA: Antes de empezar, prepara fresco; equilibrar gas y temperatura. Alinea la óptica y confirma filtros/dicroicos. Configura el software de adquisición (1-2 kHz, exposición 1 ms) y realiza la calibración con una tarjeta fluorescente.
  2. Realiza una toracotomía mediana rápida para exponer la cavidad torácica. Extirpe el corazón en bloque con una parte del arco aórtico y sumérjalo inmediatamente en la solución de tirodo oxigenada y helada para detener el metabolismo y preservar la viabilidad del tejido. Disecciona cuidadosamente el tejido conectivo circundante manteniendo una longitud aórtica de 0,5 mm para la canulación. Fija la aorta a la cánula de Langendorff usando suturas de seda 4-0, asegurando un sellado hermético y que el borde inferior del catéter se alinee con el borde superior de la aurícula. Comenzar la perfusión retrógrada con tirodos oxigenados a un caudal constante de 10-12 mL/min, manteniendo la temperatura de perfusión en 37 ± 1 °C. Para la reproducibilidad, las especificaciones de la cánula aórtica de rata son las siguientes: diámetro exterior: 1,4 mm; diámetro interior: 1,0 mm; longitud total: 3-4 cm; profundidad de inserción: aproximadamente 0,5-1,0 cm en la raíz aórtica; Forma de la punta: ligeramente afilada; material: acero inoxidable o tubos metálicos romos. La cánula debe ser lo suficientemente rígida para soportar presiones de perfusión (normalmente 60-80 mmHg) sin doblarse, y la punta debe evitar obstruir la ostia coronaria.
  3. Observa el corazón para detectar efectos inmediatos de reperfusión. La perfusión exitosa se indica mediante una rápida y rápida eliminación de sangre residual del vaso coronario, restauración de un color miocárdico uniforme y rosa y reanudación de contracciones rítmicas espontáneas. Se requiere un edema miocárdico mínimo y una frecuencia cardíaca estable (normalmente 300-400 lpm) antes de realizar más experimentos. Graba simultáneamente el electrocardiograma del corazón. Deja que el corazón se equilibre al menos 20 minutos bajo perfusión constante antes de iniciar los protocolos de mapeo óptico.

5. Supresión de movimiento y ventilación

  1. Añade blebbistatina al perfusado (los últimos 10 μM). Perfundir durante ~10 minutos hasta que cesen las contracciones.
  2. Insertar un catéter hipotensivo en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar a través de la válvula mitral para descomprimir el ventrículo, reduciendo así la presión intracavaria y preservando la morfología auricular y la integridad de la señal. Para la reproducibilidad, las especificaciones del catéter son: diámetro exterior: 1,4 mm; diámetro interior: 1,0 mm; longitud total: 1,5 cm; Profundidad de inserción en el corazón: 1,0 cm. No abras las aurículas para preservar la geometría y las señales auriculares.

6. Carga de tintes

  1. Perfusión cardíaca: Tras un paro cardíaco, perfunde el corazón a temperatura ambiente con un caudal constante de 10-12 mL/min.
  2. Tinción indicadora de calcio: Añadir Rhod-2 AM (concentración final 0,89 μM) y 20 μL de F-127 plurónico al 20% a 100 mL de solución de perfusión. Perfundir el corazón con esta solución durante aproximadamente 30 minutos, hasta que las aurículas y ventrículos muestren una fluorescencia roja uniforme.
  3. Tinción con colorante sensible al voltaje: Añadir RH237 (concentración final 2 μM) a 100 mL de solución de perfusión. Perfunde el corazón durante ~5 minutos hasta que las aurículas y ventrículos se vean rosados.
  4. Recalentamiento y lavado: Transfiere el corazón de nuevo al sistema de perfusión original. Calienta a temperatura fisiológica y perfunde durante 5-10 minutos para eliminar el tinte no absorbido.
    NOTA: Las señales débiles de CaT a menudo reflejan una carga insuficiente de Rhod-2; extiende la carga 10-15 minutos y confirma que Pluronic está fresco. Si el movimiento persiste, confirma la potencia de la blebbistatina y la protección ligera.

7. Geometría de imagen y aislamiento de señales

  1. Coloca el corazón en un baño de imagen a 37 °C. Orienta el atrio izquierdo (LA) hacia la cámara. Alinea las fuentes de luz LED primaria y secundaria hacia Los Ángeles.
  2. Apoyar el corazón para evitar la deriva; Extiende suavemente la aurícula y sujeciónala con agujas de acupuntura para una visualización óptima. Cubre los ventrículos con láminas de goma negra para minimizar la contaminación lumínica ventricular.
  3. Colocar electrodos de estimulación bipolar en la aurícula derecha (AR). Coloque electrodos ECG cerca de las aurículas para captar grandes ondas P.

8. Protocolos de adquisición y ritmo

  1. Lanza el software de mapeo (software OMapRecord4.0). Ajusta la tasa de fotogramas a 1-2 kHz; ajustar la carga LED a 3-4 A; campo de visión que abarca toda la LA. Ajusta la ganancia/exposición para evitar saturación en cualquiera de los canales. Optimiza la ganancia y exposición de la cámara para evitar la saturación y maximizar la relación señal-ruido. Parámetros de imagen: exposición 1 ms; frecuencia máxima de cámara 30 kHz; tasa de muestreo 12,5 kHz; resolución 2048 × 2048 píxeles; ROI de velocidad de frames de hasta 3,5 kHz; resolución espacial 70 μm. Estos ajustes garantizan grabaciones de AP y CaT de alta fidelidad.
  2. Estimulación S1S1 (línea base): Estimulación de la AR a 7 Hz (ancho de pulso 2-4 ms; umbral diastólico doble). Adquiere ≥ vídeos de 5 s para la duración de APD/CaT (CaD), el tiempo hasta el pico y la velocidad de conducción.
  3. Protocolo S1S2 (refractariedad/AF): Entregar 30 tiempos S1 a 7 Hz, luego un solo S2; disminuir el intervalo S1-S2 de 140 ms en pasos (10/5/1 ms) a la refractaridad. Registrar la recuperación de CaT (A2/A1), el periodo refractario efectivo (ERP), la inducibilidad/duración de la FA.
  4. Ritmo incremental (alternans): Aumenta el ritmo de la AR de 8 a 18 Hz en pasos de 1-2 Hz. Registrar ≥ 5 s a cada tasa para cuantificar Ca-ALT, APD-ALT y DIS-ALT. Guarda películas simultáneas de doble canal y trazas sincronizadas de ECG/estimulación para su análisis.
    NOTA: Mantener la temperatura y la perfusión constantes durante todo el ritmo; La hipotermia reduce la conducción y exagera los artefactos de Alternans.

9. Procesamiento y cuantificación de datos

  1. Analizar señales ópticas usando el software OMapScope 4.0. Se aplicó un filtro espacial gaussiano 3×3 para reducir el ruido mientras se preserva la morfología de la señal promediando cada píxel con sus vecinos. Los tiempos de activación se definen como el punto de máxima dF/dt durante la carrera ascendente, desde donde se calcula la velocidad de conducción dividiendo la distancia lineal entre los sitios de activación más antiguo y el más reciente por la diferencia de tiempo de activación correspondiente. APD70/90 se definió como el tiempo desde el máximo dF/dT del potencial de acción hasta el 70% o 90% de repolarización de la amplitud AP. El CaD70/90 se definía como el tiempo desde el pico del transitorio de calcio (Ca²⁺) hasta el 70% o 90% de desintegración. Los alternanos se cuantificaron de la siguiente manera: Ca-ALT se calculó como 1 menos la relación entre la amplitud media de CaT menor y mayor, APD-ALT como la diferencia entre los valores APD80 más largos y cortos, y DIS-ALT como alternantes espacialmente desfasadas separadas por líneas nodales. La razón de recuperación RyR se calculó como la razón de dos picos consecutivos de CaT (menor/mayor).

10. Parámetros críticos y criterios de aceptación

  1. Perfusión: 10-12 mL/min, 37 ± 1 °C; seno parasal estable o ritmo acelerado; Los Ángeles bien perfundidos.
  2. SNR: Subida dF/F ≥ 3 para ambos canales; Fotoblanqueo mínimo durante la ventana de adquisición.
  3. Movimiento: Movimiento residual insignificante tras la blebbistatin; Registro estable de imágenes entre fotogramas.
  4. Temperatura: Monitorización continua; excluir conjuntos de datos con < de baño de 36 °C o > 38 °C durante la adquisición.

11. Análisis estadísticos

  1. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9. Los datos se presentan como media ± SEM. La normalidad de la distribución de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Para los datos con distribución normal, las diferencias entre ambos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student bicolar no emparejada; para datos no distribuidos normalmente se aplicó la prueba Mann-Whitney U. Las variables categóricas se analizaron mediante la prueba χ2 . Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

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Resultados

Inducibilidad AF
La actividad ectópica y la reentrada son mecanismos esenciales que contribuyen a la iniciación y perpetuación dePOAF 2, La longitud de onda de reentrada (λ) está determinada por el producto de ERP y velocidad de conducción (CV), es decir, λ = ERP × CV. En corazones simulados, el estimulación S1S2 provocó respuestas auriculares estables sin arritmia (Figura 2A). En cambio, los corazones tratados con parálise del sueño mostraron frec...

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Discusión

Este protocolo describe el mapeo óptico dual de APs y CaTs en corazones de rata aislados tras la parálise del sueño, un modelo de POAF impulsado por inflamación. La grabación simultánea de alta resolución de señales Vm y Ca2+ a lo largo de la superficie auricular intacta bajo pacing programable permite evaluar APD, tiempo hasta el pico, velocidad de conducción, heterogeneidad espacial de la repolarización, CaD, amplitud CaT, tiempo CaT hasta pico y variabilidad regional en el ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82470328, 82170326 a Y.D.; No. 82300350 a J.L.). Queremos expresar nuestro agradecimiento a los doctores Guoliang Hao y Gongxin Wang (Instituto de Electrofisiología, Academia de Ciencias Médicas de Henan, Zhengzhou, China) por su excelente ayuda en el mapeo óptico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BlebbistatinaAbcamab120425
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cámara CMOSMappingLabOMS-PCIE-2002
Sistema ECGChengdu TechmanBL-420F
FE32 - MedidorMettler Toledo30254108
Filtros/espejos dicróicosMappingLabRH237 >700 millas náuticas;
CaT 590 nm
GlucosaSigma-Aldrich921-60-8
Baño de imgasMappingLabN/A
KClSigma-Aldrich7447-40-7
Sistema de perfusión de LangendorffRadnoti / CustomN/A
Fuente LED (530 y más de 25 nm)MappingLabN/A
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
NaH2PO4Sigma-Aldrich10049-21-5
NaHCO3Sigma-Aldrich144-55-8
Software OMapRecord4.0MappingLabN/A
Software OMapScope4.0MappingLabN/A
Bomba peristálticaCole-ParmerMasterflex® L/S®
Pluronic F-127InvitrogenP3000MP
RH237 (tinte de voltaje)Thermo Fisher / InvitrogenS1109
Rhod-2 AM (indicador CA)Thermo Fisher / InvitrogenR1245MP
Ventiladores para pequeños animalesYUYANBIOV-100
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichP3761
Ratas de Sprague-Dawley (200 y trazo; 220 g, masculino)Proveedor local certificadoN/A
Polvo de talco estérilSigma-AldrichT1586
EstimuladorMappingLabLEDC-2002
Baños maria (con temperatura controlada)Ningbo XinzhiSC-15

Referencias

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