Artículo de método

Un modelo animal de pulpitis basado en una cepa de ratones superados en la subproducción y su análisis histológico

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DOI:

10.3791/69786

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27 de febrero de 2026

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1Department of Operative Dentistry, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 2Dow Institute of Advanced Biological and Animal Research, Dow University of Health Sciences, 3Department of Pathology, Dow International Medical College, Dow University of Health Sciences, 4Department of Oral Pathology, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 5Qatar University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para crear un modelo de pulpitis en ratones NMRI (Instituto de Investigación Médica Naval). Además, se describen los pasos para fabricar un clip de retracción mandibular y preparar las diapositivas para histologia desde la mandíbula del animal. Siguiendo un protocolo estándar, se pueden evitar variaciones en la metodología y los resultados.

Resumen

No se ha informado previamente que ratones del Instituto de Investigación Médica Naval (NMRI) hayan creado un modelo de inflamación de la pulpa dental. En este protocolo, presentamos un modelo animal empleando ratones NMRI y proporcionamos procedimientos histológicos detallados para el modelo de pulpitis para asegurar su reproducibilidad. Incluimos 70 ratones con IRM asignados aleatoriamente a dos grupos: Grupo A (n=35), en el que la pulpitis fue inducida solo por la exposición a la pulpa, y Grupo B (n=35), que recibió exposición a la pulpa seguida de la aplicación de Zymosan. Tras la exposición a la pulpa del molar maxilar derecho, los animales fueron sacrificados en intervalos de tiempo designados (0, 6, 9, 12, 24, 48 y 72 horas). Se obtuvo la mandíbula maxilar para histologia y análisis histomorfológico cuantitativo. Se observó un aumento gradual y dependiente del tiempo en el análisis histológico para ambos grupos. Ambos modelos animales permitieron el estudio de la inflamación hasta 72 horas. La técnica presentada en este artículo es reproducible y ayudará a estandarizar el estudio histológico de la pulpitis.

Introducción

Se han utilizado varios modelos animales para estudiar la pulpitis 1,2,3,4. Entre ellos, los modelos de ratones basados en C57BL/6 y BALB/c se reportan exclusivamente en la investigación sobrepulpitis 5,6,7,8. Ambos son endogámicos y tienen requisitos estrictos para lacría 7,9. Los ratones NMRI utilizados en el protocolo actual son una cepa con mayor capacidad de producción, que ofrece múltiples ventajas sobre las cepas endogámicas. Tiene bajos costes de instalación y mantenimiento. Alta reproducción, mejor inmunidad y baja mortalidad resultan en una renovación más temprana y mayor de lascolonias 10. Por lo tanto, es más viable logística yfinancieramente 11. Además, nuestros resultados indican que el perfil de la inflamación pulpar producida en este modelo es similar al de los modelos previamente reportados en ratonesendogámicos 5,6,8. Además, los ratones NMRI pueden soportar la exposición de la pulpa a Zymosan hasta 72 horas, desarrollando un perfil de enfermedad observable. Esta es una alternativa viable a otras cepas endogámicas para estudiar pulpitis12.

El zimosano es un extracto de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae, y está compuesto principalmente por quitina, mananos, manoproteínas y ß-glucanos13. Zymosan y Candida albicans comparten una estructura de pared celular similar y son detectados por la inmunidad innata del huésped mediante un receptor de reconocimiento de patógenos tipo C, Dectin-1-14. Dectina-1 se expresa principalmente por células dendríticas y macrófagos. Detecta los glucanos ß en patógenos fúngicos y utiliza la vía Syk/CARD9 para la formación de mediadoresinflamatorios 15. Por lo tanto, Zymosan es una alternativa viable para estudiar el efecto de la exposición de C. albicans sobre la enfermedad pulpar en lugar de utilizar elorganismo 16. Esto está respaldado por nuestros resultados previamente publicados, que muestran una detección temprana de transcritos de Dectin-1 en pulpa expuesta a Zymosan. De manera similar, se observaron también macrófagos CD68+ve que expresan Dectin-1en 12.

Las técnicas histológicas descritas en publicaciones anteriores suelen ser insuficientes para que los investigadores novatos puedan reproducirse con confianza. En consecuencia, se produce un extenso proceso de prueba y error, lo que lleva a pérdidas innecesarias de animales durante la optimización de los procedimientos histológicos. El protocolo actual estandariza la técnica de preparación de portaobjetos y se ha aplicado con éxito también aratas 17. Aquí se describen en detalle todos los pasos esenciales del modelo de pulpitis, incluyendo un método reproducible para la retracción de la mandíbula, inducción de pulpitis por exposición de la pulpa, inducción de inflamación pulpar usando Zymosan y posterior análisis histológico.

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Protocolo

El estudio actual en animales fue diseñado de acuerdo con las directrices de ARRIVE. La Junta de Revisión Institucional para la Investigación y Ética Animal de la Universidad Dow de Ciencias de la Salud aprobó este estudio con animales (Carta nº AR. IRB-06/DUHS/Aprobación/2016/05). El protocolo incluía un total de 70 ratones con IRMN. Los animales se obtuvieron de la 'Central Animal House Facility' del Dow Institute for Advanced Biological and Animal Research. El tamaño de la muestra de este protocolo se basa en un estudioprevio 8.

1. Animales

NOTA: Los animales seleccionados para el estudio pesaban entre 26 y 30 g y se mantenían en jaulas estándar bajo las siguientes condiciones: temperatura de ±21 °C, humedad relativa del ±55% y una relación luz/oscuridad de 12 h con agua filtrada disponible libremente y alimento estándar (dieta normal para comida). Se monitorizaba regularmente cualquier signo de agresividad, incomodidad o irritación. Se utilizó diclofenaco sódico (200 μL subcutáneo, 25 mg/mL) en caso de dolor o molestia. Se les permitió aclimatarse durante dos semanas antes de cualquier experimentación. Diez animales cada uno se mantenían en jaulas debidamente etiquetadas. Para la identificación del animal, se colocaba un marcador en su cola.

  1. Divide los animales (n=70) aleatoriamente en dos grupos: Grupo A (n=35), Grupo B (n=35).
  2. En el Grupo A, inducir pulpitis solo por la exposición de la pulpa (véase el paso 4.1.1 al paso 4.1.9).
  3. Para animales del Grupo B, aplicar solución de Zymosan sobre la pulpa expuesta (véase el paso 4.2.1 al paso 4.2.3).

2. Solución de Zimosano

  1. Sigue un método previamente publicado para la preparación de la solución de Zymosan como se describe acontinuación 18.
  2. Utiliza solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución de 1 mg/mL a partir de 1 mL de Zymosan.
  3. Autoclave la solución a 121 °C durante 15 minutos.
  4. Deja que la solución se enfríe a temperatura ambiente durante 1 hora.
  5. Centrifuga la solución a 4 °C y 300 x g durante 10 minutos.
  6. Desechar el sobrenadante y lavar el pellet tres veces mediante una recentrifugación con PBS estéril helado.
  7. Guarda la solución a 4 °C hasta que se use más.
    NOTA: La solución debe utilizarse en un plazo de 30 días, tras lo cual puede descartarse.

3. Clip de retracción de la mandíbula

  1. Utiliza alambre ortodóntico de acero inoxidable de 0,7 mm para hacer un clip de retracción de mandíbula.
  2. Toma un alambre de 100 mm de longitud y haz un lazo de 5 mm de diámetro en su centro.
  3. Gira ambas partes del cable a 5 mm del lazo y 15 mm en total en ángulo recto sin curvas pronunciadas.
  4. A una distancia de 25 mm desde la curva, haz una muesca y gira el extremo restante hacia afuera. Utiliza la Figura 1A como guía.

4. Modelo animal

  1. Grupo A (n = 35)
    1. Anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal de 0,1 mL/20 g de cóctel de ketamina-xilazina (87,5 mg/kg de ketamina + 12,5 mg/kg de xilazina).
    2. Utiliza un estereoscópico de brazo largo inclinado 10 veces para todos los procedimientos (Figura 1B). Coloca el brazo inclinado de modo que haya una vista directa de los dientes maxilares retraídos del animal. (Figura 1C)
    3. Aprieta el clip y coloca la parte muescada entre los incisivos maxilar y mandibular a ambos lados del clip.
    4. Después de soltar el clip, asegura sus extremos con la ayuda de cinta adhesiva (Figura 1C).
    5. Utiliza una pinza dental para expandir las mejillas del animal con la mano que no funciona. (Figura 1D,E).
      NOTA: Evita la presión excesiva. La lesión causada por una pinza puede causar hemorragias fatales y la muerte del animal.
    6. Utiliza una fresa redonda de carburo #1/4 con una pieza de mano tipo E de baja velocidad en un micromotor eléctrico con aumento de 10 veces hasta la mitad de su profundidad en el centro del primer molar maxilar derecho para crear una cavidad de clase 1. En este momento puede verse sombra de pulpa (Figura 1D,E).
    7. Haz pasar la fresa suavemente a baja velocidad y con un movimiento amplio. Usa un motor eléctrico para controlar las revoluciones por minuto.
    8. Utiliza una lima endodóntica tipo K número 15 para exponer la pulpa (Figura 2B).
      NOTA: El uso de un instrumento endodóntico de mano #15 debe ser extremadamente delicado, de lo contrario se producirá una perforación de furcación, que solo será evidente una vez que se preparen las láminas histológicas. El diámetro de la fresa redonda de carburo #1/4 es de 0,25 mm, y una lima tipo #15K mide 0,15 mm de ancho. Por lo tanto, 0,15 mm será el tamaño de exposición en la pulpa (Figura 2C).
    9. Deja la pulpa expuesta abierta para inducir la pulpitis
  2. Grupo B (n = 35)
    1. Repite todos los pasos dados en el paso 4.1 con la adición de lo siguiente.
    2. Utiliza una micropipeta (0,2-2 μL) para colocar 0,2 μL de solución de Zymosano previamente preparada sobre la pulpa expuesta.
      NOTA: Se debe tener cuidado al dispensar la solución de Zymosan. El derrame involuntario de la solución en la cavidad oral puede causar la muerte del animal. Por lo tanto, se utiliza gasa para cubrir el diente y que el exceso de solución de Zymosano sea absorbido por la gasa (Figura 2D).
    3. Deja la pulpa tratada abierta para inducir la pulpitis con solución de Zymosan.

5. Preparación de muestras

  1. Sacrificar cinco animales de cada grupo a 0, 6, 9, 12, 24, 48 y 72 h por inhalación de dióxido decarbono 19.
  2. Usa una cámara de eutanasia de 7,25 L.
  3. No precargues la cámara con CO2.
  4. Coloca a los animales directamente en la cámara.
  5. Añade 100% deCO2 a una tasa de llenado entre el 30 y el 70% del volumen de la cámara por minuto.
  6. Mantén el caudal deCO2 en 5 L/min.
  7. Calienta elCO2 y déjalo mezclarse con el aire presente en la cámara.
  8. Observa a los animales en busca de signos de inconsciencia en un plazo de 23 minutos.
  9. Vigila a los animales para evitar que la respiración se ponga gris y los ojos.
  10. Mantén el flujo deCO2 durante al menos un minuto después de cesar la respiración.
  11. Confirma la muerte de los animales antes de sacarlos de la cámara. Asegúrate de que no haya respiración y que los ojos parezcan pálidos.
  12. Separa las cabezas de los animales inmediatamente después de la eutanasia.
  13. Utiliza el primer molar maxilar no tratado del lado izquierdo del animal sacrificado a 0 h como control.
  14. Utiliza formalina amortiguada al 10% en tubos cónicos de 15 mL correctamente etiquetados para almacenar las mandíbulas maxilares durante 2 días.

6. Histología

  1. Descalcifica las mandíbulas fijas con ácido fórmico al 10% durante 3 días.
    NOTA: Después del tercer día, comprueba si una cuchilla quirúrgica puede cortar la mandíbula. Si aún no está lo suficientemente blando, sumergiértelo de nuevo en ácido fórmico al 10% y comprueba diariamente hasta que pueda cortarse con una cuchilla quirúrgica.
  2. Corta la mandíbula con una hoja nº 22. Haz el corte paralelo al plano oclusal, a lo largo del plano sagital, manteniendo la hoja inmediatamente en el lado palatino de las cúspides palatinas de los molares maxilares (Figura 3A).
  3. Marca la superficie oclusal de todos los dientes con tinta india.
    NOTA: Esta marcada ayudará a reconocer la superficie oclusal durante la sección (Figura 3B).
  4. Incrusta la mandíbula seccionada en cera de parafina en una base de acero inoxidable colocada plana contra la base del molde con la superficie cortada orientada hacia la base.
    NOTA: Incrustar de esta manera asegura que la superficie cortada entre primero en el microtomo, que la orientación de la muestra sea correcta y que las secciones sagitales se produzcan como se muestra en la Figura 3E.
  5. Retira el casete de incrustación que contiene la mandíbula incrustada del molde base y colócalo en un microtomo.
  6. Haz secciones sagitales de 3 μm de grosor y colócalas sobre una lámina de microscopio limpia y cargada (Figura 3C).
  7. Observa las láminas sin teñir bajo un microscopio compuesto.
    NOTA: Sigue observando las secciones cortadas hasta que la cavidad sea visible en la superficie oclusal. Si las secciones se forman correctamente a lo largo del plano sagital a lo largo del eje largo del primer molar maxilar, se observará que todo el espacio pulpar muestra una o dos raíces y una cámara pulpar (Figura 3E). A partir de este punto, teóricamente se pueden hacer 50 diapositivas a partir de una sección, ya que el tamaño de la exposición es de 0,15 mm. (3 μm = 0,003 mm, 0,003 x 50 = 0,15)
  8. Realizar los pasos estándar de los procedimientos de tinción por hematoxilina y eosina para las láminas seleccionadas mostrando una o dos raíces, junto con toda la cámara pulpar.
  9. Observa las láminas teñidas bajo un microscopio compuesto.
  10. Selecciona cinco mejores portaobjetos por intervalo de tiempo que permitan observar el máximo espacio de pulpa.

7. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando software estadístico estándar.
    NOTA: Para el análisis histomorfológico cuantitativo, las diapositivas observadas de cada intervalo de tiempo se puntuaron según un criterio previamente publicado (Tabla 1)8. Se utilizó la prueba H de Kruskal-Wallis con corrección de Bonferroni en p=0,0018 para comparar puntuaciones de diferentes intervalos de tiempo. La prueba Mann-Whitney U se utilizó en p ≤ 0,05 para comparar los grupos A y B. Todas las comparaciones se realizaron utilizando software estadístico estándar.

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Resultados

En este protocolo, presentamos un procedimiento detallado paso a paso para dos modelos animales de inflamación de la pulpa dental en ratones con IRMN, junto con sus métodos histológicos correspondientes. El uso de equipos adecuados es esencial para el éxito del protocolo. En este sentido, el estereomicroscopio de brazo largo inclinado 10x es el equipo más crucial. La preparación de cavidades de clase 1 se realizó utilizando un micromotor eléctrico a aproximadamente un tercio de su veloci...

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Discusión

El protocolo actual presenta por primera vez en la literatura reportada el desarrollo de un modelo de lesión dental tipo 3 (pulpitis irreversible) en ratones con IRMN. También detalla el análisis histológico de la inflamación pulpar inducida por Zymosano y proporciona un método reproducible para preparar láminas histológicas de mandíbulas de animales.

Siguiendo este protocolo, se produjo un modelo de lesión dental tipo 3 en ratones con IRMN. Investigaciones pr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

El estudio fue autofinanciado. Los autores reconocen la ayuda del Sr. Muhammad Adeel, del Departamento de Histología de la Universidad Dow de Ciencias de la Salud, para la Histología.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mode baseLaboratorios Histo-line, ItaliaR4166C2:D23Para incrustar la muestra en parafina
Carburo bur #1/4 rondaMedio Oeste, Wichita Falls, Texas389101
Microscopio compuesto Motic BA310Motic Inc. Co. Ltd, Hong Konghttps://moticmicroscopes.com/products/ba310e
Diclofenaco sódico 25mg/mLIndus Pharma (DYCLO)https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/200 y micro; L subcutánea
Pieza de mano de velocidad lenta tipo E Rose201-M4Siendo Foshan, Chinahttps://www.beingfoshan.com/en/h-pd-353.html
Incrustación de casetes Laboratorios Histo-line, ItaliaR4004
Cámara de EutanasiaConductScience, Illinois EE. UU.CS-EUTH2ACapacidad de 7,25 litros, para ratones y ratas [hasta 500g]
Tubos Falcon 15 mlNest188271
Formalin Sigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, Estados Unidos158127buffered 
Ácido fórmico y nbsp;Suministros de laboratorio BDH Poole, Inglaterra  2842810%
Homogeneizador Omni Mixer Homogeneizer, Omni International, Georgia EE. UU.https://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th
Tinta IndiaSigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, Estados Unidos198285
Archivo endodóntico tipo K número 15Mani, Japónhttps://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html
Cóctel de ketamina y xilazinaBrookes Pharma Pvt Ltd / Mylab (Pvt.) Ltd.87,5 mg/kg de ketamina + 12,5 mg/kg de xilazina
Microtomo HM 315 RMicrom, Alemania901100
Maratón de Micro-motor-IIIBT-Marathon, Saeyang Microtech Co., Ltd. Coreahttps://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111Uso a 1/3 de la velocidad máxima
Micropipeta 0.2-2 y micro; L Gilson, Franciahttps://www.gilson.com/default/
pipetman-p2-0-2-2-micro-l-metal
-ejector.html?srsltid=AfmBOoobE
0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI
0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS		0.2-2 & micro; L 
Solución salina tamponada con fosfato  Sigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, Estados UnidosP4417
Paquete Estadístico para las Ciencias SocialesIBM, Armonk, Nueva YorkSPSS para Mac versión 23.0 y nbsp;  
Estereomicroscopio BMK-3 LEDTechno Meiji, Japónhttps://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/
Cuchilla quirúrgica nº 22Feather Surgical Blade, Feather Safety Razor Co Ltd., Osaka, JapónFB. 12
Zymosan ASigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, Estados UnidosNúmero de cat. Z42501 mg/mL de 1 mL de Zymosan

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