Efectos antiinflamatorios de las lactonas sesquiterpenas de Eupatorium lindleyanum DC. en Modelos de Roedores

Resumen

Este estudio demuestra que las lactonas sesquiterpeñas proceden de Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) ejercen efectos antiinflamatorios significativos en los modelos de edema de oído de ratón inducido por xileno y en los modelos de edema de pata de rata inducido por carragenina, al aliviar el daño histopatológico, reducir la liberación de citocinas e inhibir la activación de la señalización de NF-κB.

Resumen

La inflamación aguda es un proceso patológico fundamental implicado en muchas enfermedades relacionadas con el sistema inmunológico. Eupatorium lindleyanum DC., una hierba medicinal tradicional, es rica en lactonas sesquiterpenas (SLEL), que se ha reportado que presentan actividad farmacológica; sin embargo, sus efectos antiinflamatorios y los cambios moleculares asociados siguen siendo incompletos y caracterizados. En este estudio, se indujeron respuestas inflamatorias agudas en un modelo de edema de oído de ratón inducido por xileno y en un modelo de edema de pata de rata inducido por carragenina. La lesión tisular y la infiltración inflamatoria se evaluaron mediante tinción de hematoxilina y eosina. Los niveles de citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) fueron cuantificados en suero mediante ELISA, y su expresión transcripcional en tejidos inflamados fue analizada mediante PCR cuantitativa (qPCR). Los cambios en proteínas asociadas a la vía NF-κB, incluyendo IκBα fosforilada y p65, fueron evaluados mediante western bloting. El tratamiento con SLEL redujo el edema de oído y pata y alivió características histopatológicas de inflamación aguda, incluyendo edema tisular, infiltración celular inflamatoria y congestión vascular. Paralelamente, la administración de SLEL se asoció con una disminución de los niveles séricos y la expresión de ARNm tisular de Tnf-α, Il-6 e Il-1β. El análisis de Western blot demostró una reducción de la fosforilación de IκBα y p65 en tejidos inflamados tras el tratamiento con SLEL, lo que indica la modulación de eventos de señalización relacionados con NF-κB. En conjunto, estos hallazgos demuestran un flujo de trabajo experimental para evaluar la actividad antiinflamatoria de la SLEL en modelos de inflamación aguda y sugieren que sus efectos están asociados con una reducción de la expresión de citocinas proinflamatorias y una señalización alterada relacionada con la vía NF-κB.

Introducción

La inflamación es una respuesta defensiva compleja desencadenada por invasión patogénica o lesión tisular y desempeña un papel fundamental en la limitación de infecciones, eliminación de estímulos dañinos y promoción de la reparación^{tisular 1}. Aunque las respuestas inflamatorias controladas son esenciales para mantener la homeostasis tisular, una inflamación excesiva o persistente puede provocar daños en los tejidos, disfunción de órganos y la progresión de enfermedades crónicas. Clínicamente, la inflamación se caracteriza por enrojecimiento, hinchazón, calor y dolor, y en casos graves puede provocar respuestas patológicas sistémicas. Cada vez hay más evidencia que ha relacionado la inflamación desregulada con el desarrollo de cáncer, enfermedades cardiovasculares y trastornos^{autoinmunes 2}˒³.

Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) son actualmente los agentes más utilizados para controlar la inflamación. A pesar de su efectividad en el alivio de los síntomas, el uso prolongado de AINEs se asocia frecuentemente con efectos adversos, incluyendo irritación gastrointestinal, reacciones de hipersensibilidad y^{hepatotoxicidad 4}, que limitan su aplicabilidad clínica. Como resultado, hay un interés creciente en identificar agentes antiinflamatorios alternativos con perfiles de seguridad mejorados. Se han explorado productos naturales, incluidas las medicinas herbales tradicionales, como posibles fuentes de compuestos bioactivos con propiedades inmunomoduladoras. Sin embargo, las afirmaciones generalizadas sobre baja toxicidad o funciones regulatorias sistémicas deben interpretarse con cautela y requieren validación experimental en modelos de enfermedad^{definidos 5}.

Eupatorium lindleyanum DC. es una planta medicinal tradicional cuyos fitoquímicos característicos incluyen lactonas sesquiterpenas, principalmente compuestos tipo guaianolido y eudesmanolido, junto con germacranolidos y^{xantanolidos 6}. Extractos de Eupatorium lindleyanum DC. se ha reportado que presenta actividades reductoras de lípidos, antiateroscleróticas, antitumorales y antiinflamatorias en diversos entornos^{experimentales 6}. En particular, extractos de etanol de Eupatorium lindleyanum DC. han mostrado efectos protectores en modelos de lesión pulmonar aguda inducida por lipopolisacáridos (^{LPS) 7}. Sin embargo, la actividad antiinflamatoria del SLEL y sus efectos en los modelos clásicos de inflamación aguda siguen siendo insuficientemente caracterizados.

Para abordar esta carencia, empleamos dos modelos complementarios de inflamación aguda: edema auditivo inducido por xileno en ratones, que captura respuestas inflamatorias rápidas neurogénicas y vasculares, y edema de pata inducido por carragena en ratas, un modelo bien establecido que refleja inflamación aguda dependiente del tiempo que implica la producción de citocinas e infiltración celular. No se seleccionaron modelos alternativos, como la inflamación sistémica inducida por LPS, debido a su énfasis en la activación inmunitaria sistémica en lugar del edema tisular localizado y su limitada idoneidad para análisis histológicos y moleculares a nivel de tejido^{emparejados 8}.

Utilizando esta estrategia combinada de modelos, las respuestas inflamatorias se evaluaron mediante mediciones cuantitativas de edema, evaluación histopatológica mediante tinción de hematoxilina y eosina (H&E), perfilado de citocinas séricas, análisis transcripcional a nivel tisular y cambios proteicos asociados a NF-κB. Este protocolo es especialmente adecuado para el cribado de la actividad antiinflamatoria en inflamación aguda, donde la formación de edemas, la expresión de citocinas y las lecturas moleculares asociadas a las vías son de interés. No obstante, deben reconocerse las limitaciones de los modelos agudos, incluyendo la extrapolación restringida a enfermedades inflamatorias crónicas y los límites interpretativos al inferir causalidad a partir de cambios de señalización a nivel tisular.

En conjunto, este estudio destaca un enfoque basado en protocolos que integra modelos complementarios de inflamación aguda con análisis histológicos y moleculares emparejados, proporcionando un marco reproducible para evaluar el potencial antiinflamatorio de compuestos derivados de plantas medicinales.

Protocolo

El protocolo del estudio con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Chongqing (IACUC-CQMU-2025-10073).

Preparación de fracción enriquecida con lactona sesquiterpeno (SLEL)

Materiales medicinales secos de Eupatorium lindleyanum DC. fueron pulverizados y sometidos a extracción por reflujo dos veces con etanol al 70% (v/v) bajo presión reducida. Cada extracción se realizó con una proporción disolvente-material de 10:1 (v/w) durante 2 horas. Los extractos combinados se filtraron, se concentraron a presión reducida a ≤60 °C y posteriormente se liofilizaron al vacío para obtener el polvo de extracto de etanol crudo.

El extracto seco se disolvió completamente en agua destilada (concentración final: 100 mg/mL) y se sometió secuencialmente a cromatografía de resina de poliamida, seguida de cromatografía con resina de adsorción macroporosa D101 para enriquecer lactonas sesquiterpenas. Tras alcanzar el equilibrio de adsorción, la resina D101 se lavaba con agua destilada para eliminar impurezas polares y luego se eluía con etanol anhidro. Tras la elución por etanol, la fracción recolectada se concentraba a presión reducida y se liofilizaba para producir la fracción SLEL, que se almacenaba a −20 °C hasta su uso.

La separación se logró en una plataforma UPLC que empleaba un sistema binario de fase móvil de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua. El programa de gradiente consistía en una retención isocrática inicial de 25 minutos con bajo contenido orgánico, una rampa lineal corta al 70% de acetonitrilo, una fase de alto escalón orgánico al 90% de acetonitrilo y un paso final de equilibrio que regresaba a las condiciones iniciales. El sistema operaba a 0,25 mL·min⁻¹ con una temperatura de columna de 35 °C y un volumen de inyección de 0,1 μL (Figura suplementaria S1).

Animales

En este estudio se utilizaron un total de 36 ratas machos de Sprague–Dawley (200 ± 20 g) y 36 ratones BALB/c machos (20 ± 2 g). Los animales fueron alojados bajo condiciones estandarizadas (22 ± 2 °C, 55 ± 5% de humedad, 12 horas de ciclo luz/oscuridad) con libre acceso a comida y agua. Los animales se aclimataron durante 7 días antes de la experimentación y se monitorizaron diariamente para su salud general. Se realizaron todos los procedimientos para minimizar el sufrimiento animal y se aplicó anestesia antes de la recogida de sangre y la extracción de tejidos.

Edema del oído inducido por xileno en ratones

El modelo de edema del oído del ratón se estableció como se describió^{anteriormente 9}. Tras la aclimatación, los ratones se asignaron aleatoriamente en seis grupos (n = 6 por grupo): control (CG), modelo (MG), dexametasona (DEX, 10 mg/kg) y SLEL en dosis baja (75 mg/kg), dosis media (150 mg/kg) y dosis alta (300 mg/kg). Todos los tratamientos se administraron con gavage oral una vez al día durante 7 días consecutivos (volumen dosificado final: 10 mL/kg). A las 1,5 horas de la administración final, se indujo inflamación aplicando 30 μL de xileno de forma uniforme en ambas superficies del oído derecho, excepto en el grupo de control. Treinta minutos después, se anestesió a los ratones, se recogieron muestras de sangre y se obtuvieron puñezones circulares de 8 mm en las orejas desde posiciones anatómicas idénticas de ambas orejas.

Edema de las patas inducido por carragenina en ratas

El modelo de edema de pata de rata se estableció usando carragenina, como se describió^{anteriormente 10}. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a seis grupos (n = 6 por grupo): CG, MG, DEX (5 mg/kg) y SLEL de baja dosis (50 mg/kg), dosis media (100 mg/kg) y dosis altas (200 mg/kg). Los tratamientos se administraron por vía oral una vez al día durante 7 días (10 mL/kg). Se midieron los volúmenes basales de las patas antes de la dosis final. Treinta minutos después de la última administración, se inyectó 0,1 mL de solución de carragenina al 1% (p/v) de forma subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera derecha. Los volúmenes de las patas se midieron a 1, 2, 3 y 4 horas tras la inyección usando un pletismómetro. El edema de la pata se calculó como:

Edema de la pata (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Examen histológico

Se recogieron tejidos de oído y pata inmediatamente después de las evaluaciones funcionales. Los tejidos se fijaron en formalina amortiguada al 10% de neutro durante 72 horas a temperatura ambiente, incrustados en parafina, seccionados (5 μm) y teñidos con H&E según los protocolos^{estándar 11}.

Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)

Se obtuvieron muestras de suero mediante centrifugación a 3.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Los niveles de TNF-α, IL-6 e IL-1β se cuantificaron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente según protocolos estándar.

Análisis de Western blot

Se prepararon extractos de proteína total a partir de tejidos de oído y pata utilizando tampón de lisis RIPA suplementado con inhibidores de proteasa e fosfatasa. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron mediante un ensayo de BCA, y se resolvieron cantidades iguales de proteína (30 μg por muestra) mediante SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de incubación con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche y anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectaron bandas inmunorreactivas utilizando quimioluminiscencia mejorada y se cuantificaron con el software ImageJ.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

El ARN total se aisló de los tejidos del oído y las patas utilizando el reactivo de extracción de ARN que aparece en la Tabla de Materiales. Un microgramo de ARN total fue transcrito inversamente en ADNc utilizando un kit comercial de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó utilizando la química SYBR Green con cebadores específicos de genes (Tabla 1) en un volumen de reacción de 10 μL bajo un protocolo de amplificación en dos pasos. Las condiciones detalladas de transcripción inversa y los parámetros del ciclo de PCR se proporcionan en la sección de Protocolo. Los niveles relativos de transcripción se calcularon utilizando el método 2^⁻ΔΔCT , utilizando el Gapdh como gen de referencia interno.

Análisis de datos y estadística

Los datos se expresan como media ± DS. Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se realizaron utilizando un test t de Student no emparejado, mientras que se aplicó ANOVA unidireccional para análisis que involucraron a más de dos grupos. La significación estadística se definió como p < 0,05. La significación se indica como # p < 0,05 y ## p < 0,01 frente al grupo de control (CG), y * p < 0,05 y ** p < 0,01 frente al grupo modelo (MG).

Resultados

Composición química en SLEL hasta UPLC-Q/TOF/MSn

El perfil químico de SLEL se examinó utilizando UPLC-Q/TOF-MSn en modos de iones positivos y negativos. Se identificaron nueve lactonas sesquiterpenas como constituyentes predominantes (Figura suplementaria S1). Las asignaciones de fórmulas moleculares se derivaron de iones aductos observados, incluyendo [M+H]⁺ y [M+Na]⁺ en modo positivo, así como [M−H]⁻ y [M+HCOO]⁻ en modo negativo (Tabla suplementaria ...

Discusión

En este estudio, lactonas sesquiterpenas de Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) se evaluaron utilizando dos modelos de inflamación aguda establecidos, a saber, edema de oído inducido por xileno en ratones y edema de pata inducido por carragenina en ratas. Al incorporar puntuación histopatológica, mediciones de citocinas séricas, cuantificación de ARNm a nivel tisular y lecturas de señalización a nivel de proteína, este protocolo proporciona una caracterización en múltiples capas d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anti-GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti Iκ Bα	Tecnología de señalización celular	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti p-Iκ Bα	Tecnología de señalización celular	2859
anti p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1 y beta; Equipamiento	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
Kit IL-6	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Micropipeta	Eppendorf
Lector de microplacas	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Kit de transcripción inversa	MedChemExpress	HY-K051A
Amortiguador RIPA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-& alfa; Equipamiento	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Congelador de ultra baja temperatura	SANYO