Preparación de cuentas de compensación económicas y universales compatibles con anticuerpos multiespecie

Resumen

Este protocolo describe un método rentable para preparar perlas de compensación compatibles con múltiples especies para compensación de fluorescencia en citometría de flujo utilizando microesferas de poliestireno acoplado a proteínas recombinantes A/G/L.

Resumen

Este protocolo describe un método rentable y reproducible para preparar perlas de compensación compatibles con múltiples especies para compensación de fluorescencia en citometría de flujo multicolor. Aquí, la proteína de unión a inmunoglobulinas A/G/L (Proteína A/G/L) que contiene múltiples dominios de unión a inmunoglobulinas se expresó recombinante en Escherichia coli (E. coli), fue purificada mediante cromatografía de afinidad con níquel y acoplada covalentemente a microesferas de poliestireno carboxilado mediante química EDC/NHS. Las perlas resultantes se unen a anticuerpos de diversas especies y subclases, generando señales de fluorescencia fuertes y distintas adecuadas para la configuración de compensación. Estos resultados proporcionan orientación práctica para seleccionar el diámetro de la perla y la carga de proteínas para alcanzar intensidades de fluorescencia adecuadas a diferentes requerimientos de compensación. La ejecución exitosa del protocolo se indica mediante una purificación eficiente de proteínas y un pico de fluorescencia claro y de alta intensidad de las perlas conjugadas en comparación con las perlas control durante el análisis de citometría de flujo. Este enfoque simple y escalable permite la preparación rutinaria de perlas de compensación estables y versátiles en laboratorios estándar, reduciendo costes y mejorando la flexibilidad para aplicaciones de citometría de flujo.

Introducción

La citometría de flujo se ha convertido en una herramienta indispensable en inmunología, biología celular y investigación clínica para el análisis multiparamétrico de poblaciones ^{celulares 1,2,3}. Un desafío crítico en la citometría tradicional de flujo multicolor es el desbordamiento de fluorescencia, en el que el espectro de emisión de un fluorocromo se solapa en múltiples canales detectores, lo que conduce a contaminación de señales e interpretación^{errónea 4,5}. Por lo tanto, una compensación adecuada es esencial para una interpretación precisa de los datos.

Tradicionalmente, los controles de compensación se preparan utilizando células teñidas de un solo color. Sin embargo, el número limitado de células, la expresión variable de antígenos y la unión diferencial de los anticuerpos a las células plantean desafíos⁶. Como consecuencia, las perlas sintéticas modificadas para unirse a anticuerpos conjugados con fluorocromo han surgido como una alternativa^{práctica 7,8}. Las perlas ofrecen las ventajas de una capacidad de unión constante, alta intensidad de fluorescencia e independencia respecto a los niveles de expresión celular^{de antígenos 9}. En comparación con reactivos de captura de una sola especie o con restricción de Fc, la incorporación de múltiples dominios de unión a inmunoglobulinas (Proteína A, G y L) amplía la cobertura de especies y la compatibilidad de formatos de anticuerpos, permitiendo una preparación de una sola perla para acomodar diversos anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Entre las perlas utilizadas para compensación, el acoplamiento de proteínas que se unen a inmunoglobulinas como la Proteína A, la Proteína G y la Proteína L proporciona una amplia compatibilidad con isotipos de anticuerpos de diferentes especies. Las proteínas A y G se unen a la región Fc de muchas subclases de IgG, mientras que la proteína L se une a cadenas ligeras κ de inmunoglobulinas y así amplía su capacidad de unión a fragmentos de Fab y anticuerpos de cadena^{única 10,11}.

Aunque existen cuentas de compensación comerciales, su coste relativamente elevado puede ser prohibitivo para laboratorios con presupuestos limitados, lo que limita su aplicación^{generalizada 3}. Dadas estas dificultades, es necesario contar con plataformas flexibles y personalizables que permitan a los investigadores definir el tamaño de las perlas, el dominio de unión de anticuerpos y los tipos de anticuerpos utilizados para los controles de compensación. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método sencillo, económico y reproducible para preparar perlas de compensación compatibles con múltiples especies para citometría de flujo multicolor. Este protocolo describe el diseño, expresión y purificación de una proteína de fusión recombinante que contiene múltiples dominios de unión a inmunoglobulinas de las proteínas A, G y L, seguida de su conjugación covalente con perlas de poliestireno modificadas por carboxilo de diámetros definidos.

El protocolo describe el diseño molecular de la proteína de fusión, su expresión y purificación en E. coli, y la preparación de reactivos de compensación basados en perlas compatibles con múltiples anticuerpos conjugados con fluorocromo. Este protocolo está destinado a laboratorios que realizan citometría de flujo multicolor en diversos entornos de investigación, incluyendo inmunología, oncología y estudios traslacionales, especialmente cuando se requiere reducción de costes, compatibilidad entre especies y controles flexibles de compensación.

Protocolo

NOTA: Prepare todos los buffers y reactivos de forma fresca según la lista de la Tabla 1. Preparar soluciones EDC y NHS inmediatamente antes de su uso; No los guardes. Para todos los demás tampones (lisis, enlazamiento, lavado, elución, MES, PBS, Tris), prepara las soluciones de stock con antelación y guárdalas a 4 °C. Equilibrar los buffers almacenados a la temperatura de reacción adecuada (temperatura ambiente o 4 °C) antes de su uso. Asegúrese de que el buffer FACS y el buffer de almacenamiento estén preparados frescos o almacenados a 4 °C.

1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes A/G/L

1. Expresión de la proteína recombinante A/G/L
   1. Transformar el plásmido A/G/L de la proteína pET28 en células competentes para E. coli BL21(DE3) usando un protocolo estándar de choque térmico.
   2. Coloca las células transformadas en agar LB que contiene 50 μg·^mL-1 kanamicina e incuba durante la noche a 37 °C.
   3. Inocular una sola colonia en 5–10 mL de caldo que contenga kanamicina (50 μg·^mL-1) y cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 200 × g.
   4. Transfiere el cultivo nocturno a 200 mL de LB que contienen kanamicina (concentración final 50 μg·^mL-1) a una dilución 1:100.
   5. Cultivar el cultivo a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nM (OD600) alcance 0,6–0,8.
   6. Inducir la expresión de proteínas añadiendo isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM e incubar a 28 °C durante 12–16 horas.
   7. Extrae las células por centrifugación a 4 °C, 4000 × g durante 10 minutos.
   8. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en el buffer de lisis. Procede inmediatamente o guarda los pellets a -80 °C.
      Punto de pausa: Los pellets celulares pueden almacenarse a -80 °C durante varias semanas antes de la lisis.
2. Lisis celular
   1. Resuspende el pellet bacteriano en 10 mL de tampón de lisis por gramo de masa de células húmedas.
   2. Lisa las células usando un homogeneizador de alta presión ajustado a 1000 bar, pasando la suspensión durante 2–3 ciclos hasta que la solución se vuelva menos viscosa y translúcida.
      Nota: Alternativamente, la interrupción celular puede realizarse mediante sonicación sobre hielo usando modo pulso (5 s ENCENDIDO / 10 segundos APANADO) durante 8–12 ciclos, evitando el sobrecalentamiento. Asegura la lisis completa examinando una pequeña alitería bajo un microscopio.
   3. Centrifugar el lisado a 12000 × g durante 30 minutos a 4 °C.
   4. Recoge el sobrenadante como fracción proteica soluble para purificarlo.
3. Purificación de afinidad Ni-NTA
   1. Equilibrio de columnas y carga de muestras
      1. Equilibrar la columna Ni-NTA con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de unión que contenga 10 mM de imidazol.
      2. Filtrar el lisato clarificado a través de un filtro de 0,45 μM, añadir imidazol a una concentración final de 10 mM y cargarlo sobre la columna a 0,5 CV·^min-1.
      3. Recoge la fracción de flujo para monitorizar la eficiencia de la enlazamiento.
   2. Lavado
      1. Lava la columna con 10 CV de buffer de unión y buffer de lavado que contienen 20 mM de imidazol a un caudal de 1 CV·^min-1.
   3. Elución
      1. Eluir la proteína objetivo con un tampón de elución a un caudal de 1 CV·^min-1.
      2. Recoge fracciones y monitoriza A280 para identificar fracciones que contienen proteínas.
   4. Intercambio de tampones y almacenamiento de proteínas
      1. Transfiere la solución proteica purificada a un tubo centrífugo de ultrafiltración de corte de peso molecular (MWCO) de 50 kA.
      2. Centrifugar a 3.500 × g durante 15–20 minutos a 4 °C hasta alcanzar la concentración deseada.
      3. Descarta el flujo y añade un volumen igual de buffer PBS (pH 7,4) al retentado para el intercambio de buffer.
      4. Repite la centrifugación y el reemplazo de PBS 2–3 veces para reemplazar completamente el buffer original por PBS.
      5. Tras el paso final de concentración, recoge el retentado y mide la concentración de proteínas.
      6. Verificar las fracciones eluídas mediante SDS-PAGE; el peso molecular esperado de la proteína A/G/L es aproximadamente 90 kDa.
      7. Alicota la proteína purificada y conserva a -80 °C hasta que se use de nuevo.
         NOTA: El protocolo puede pausar en este paso. La proteína purificada A/G/L puede almacenarse a -80 °C para su posterior conjugación de perlas. Tras la concentración, se obtuvieron aproximadamente 10 mg de proteína purificada A/G/L a partir de 200 mL de cultivo bacteriano, con una concentración final de 2–5 mg·mL⁻¹.

2. Conjugar las perlas a la proteína A/G/L

1. Prelavado de cuentas
   1. El vórtice aplica la perla a velocidad máxima durante 20–30 s a temperatura ambiente (20–25 °C) para resuspender de forma uniforme. Transfiere una perla de 8 μM de 0,2 mL (5 mg) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Esferas de pellets por centrifugación, 5000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   3. Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante sin alterar el pellet.
   4. Añade 1 mL de 0,1 M de tampón de mes, resuspende suavemente pipeteando o haciendo vórtices suaves, centrifuga de nuevo 5000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente y retira el sobrenadante. Repite este lavado una vez (en total dos lavados de MES).
2. Activación con EDC/NHS
   PRECAUCIÓN: El EDC y el NHS son irritantes y deben tratarse con el equipo de protección individual adecuado en una campana extractora.
   1. Resuspende las perlas en un buffer MES de 0,5 mL, luego añade secuencialmente 50 μL de 50 mg·^mL-1 NHS y 100 μL de 50 mg·mL-1 EDC.
      Nota: Las soluciones EDC y NHS deben prepararse frescas inmediatamente antes de su uso.
   2. El vórtice forma cuentas e incuba en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante 30 minutos para activarse.
3. Eliminar los reactivos de activación y lavar
   1. Cuentas de pellets: 5000 × g, 3 min, a temperatura ambiente. Quita cuidadosamente el sobrenadante.
   2. Añade 1 mL de buffer PBS, resuspende suavemente, centrifuga (5000 × g, 3 minutos, a temperatura ambiente) y retira el sobrenadante. Realiza un lavado de PBS para eliminar los reactivos de activación.
4. Acoplamiento de proteínas
   1. Vuelve a suspender el pellet de perlas activado en 0,4–0,5 mL PBS (objetivo final de volumen de reacción 0,5–0,6 mL). Mantén el volumen bajo para aumentar la concentración efectiva de proteínas.
   2. Añade 100 μg de proteína A/G/L. Mezcla suavemente.
   3. Incubar la reacción en un agitador rodante a temperatura ambiente durante 2 horas para acoplamiento rápido, o 4 °C durante la noche. Mantén un rodado suave para evitar que las cuentas se asienten.
5. Reacción de apaga/terminación
   1. Cuenta de pellets (5000 × g, 3 min) y quita el sobrenadante.
   2. Añadir 1 mL 0,1 M Tris (pH = 7,4) para apagar los ésteres restantes del NHS. Suspételle e incuba en un agitador rodante durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   3. Esferas de pellets y lavado con 1 mL de PBS en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuga de nuevo (5000 × g, 3 min) y descarta el sobrenadante. Luego, resuspende las cuentas con un buffer de almacenamiento de 0,5 mL.
      Punto de pausa: El protocolo puede pausar en este paso. Las perlas de resuspensión pueden almacenarse a 4 °C.
6. Mezcla y almacena
   1. Contando cuentas conjugadas y cuentas no conjugadas. Mezcle las perlas conjugadas y no conjugadas en una proporción del 25%–75% en el nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Suspende la mezcla de perlas en 1 mL de buffer de almacenamiento (PBS que contiene 1% de BSA y 0,05% de conservante antimicrobiano).
   3. Transfiere la suspensión a un tubo etiquetado y guárdalo a 4 °C. No se requiere protección ligera. Resuspende suavemente antes de usarlos para asegurar una distribución uniforme de las cuentas. En estas condiciones, las cuentas permanecen estables durante al menos 6 meses.

3. Control de calidad representativo

1. Incubar 10 μL de perlas conjugadas con 1 μL de anticuerpo fluorescente en un tampón FACS de 100 μL durante 15–30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Cada tubo debe contener solo un anticuerpo fluorescente.
2. Lavar las perlas con 1 mL de PBS, resuspender en 300–500 μL PBS y hacer pasar con el citómetro de flujo.
3. Configurar el canal de detección según el fluoróforo conjugado al anticuerpo (por ejemplo, láser de 488 nM con detector FITC para anticuerpos conjugados con FITC). Se puede usar un rango representativo de voltaje de tubo fotomultiplicador (PMT) de 0–200 V como punto de partida y ajustarse en función del rendimiento del instrumento. Recoge al menos 10.000 eventos por muestra.
4. Puerta en cuentas por FSC/SSC. Las perlas positivas deben mostrar un pico claro y único con alta MFI en el canal del fluoróforo; Control negativo debería mostrar solo el fondo.

Resultados

La proteína de fusión recombinante A/G/L consta de 816 aminoácidos con un peso molecular calculado de 90,5 kDa (Archivo suplementario 1). Esta proteína de fusión conserva cinco dominios B que se unen a IgG de la Proteína A, dos dominios de unión a IgG de la Proteína G y cinco dominios B de unión a la cadena ligera κ de la Proteína L, mientras que el dominio de unión a la albúmina fue retirado (Figura 1A, Tabla de suplementos 1

Discusión

Este protocolo describe un flujo de trabajo práctico y eficiente para la preparación de perlas de compensación fluorescentes basadas en proteínas recombinantes A/G/L. El procedimiento incluye expresión bacteriana, purificación por afinidad Ni-NTA y acoplamiento covalente de la proteína purificada a microsferas de poliestireno modificadas con carboxilo utilizando química EDC/NHS. Las perlas resultantes pueden unirse a anticuerpos de múltiples especies y subclases, proporcionando una herra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AF647 Rat Ig2a	BioLegend	141711
Ratón APC IgG1	BioLegend	353311
BL21(DE3) Células Competentes	Sangon	B528414
BSA	Solarbio	A8010
EDC	Thermo Fisher	22980	CAS: 1892-57-5
FITC Hámster Armenio IgG	BioLegend	400905
Imidazol	Sigma-Aldrich	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	GoldBio	I2481C	CAS: 367-93-1
Kanamicina	Sangon	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	Aladdín	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	Aladdín	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	Sigma-Aldrich	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	Aladdín	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	Aladdín	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	Thermo Fisher	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences	SA005005
Ratón PE IgG2a	BioLegend	362603
ProClean 300	Beyotime	ST853
Tris	Sigma-Aldrich	252859	CAS: 77-86-1
Triptona	Oxóide	LP0042
Filtro Ultra Centrífugo, MWCO de 50 kDa	Millipore	UFC9050
Microsferas uniformes de poliestireno carboxil	Tomicro Biotech	10ml, 25mg/ml	Shanghái, China
Extracto de levadura	Oxóide	LP0021