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Artículo de método

Citología broncoscópica y secuenciación metagenómica para diferenciar lesiones pulmonares relacionadas con el tratamiento del cáncer y las lesiones pulmonares infecciosas

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DOI:

10.3791/70725

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26 de mayo de 2026

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1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) mediante la recogida integrada guiada por broncoscopia, análisis citológico y secuenciación metagenómica de nueva generación (mNGS). Este flujo de trabajo integral distingue con precisión la lesión pulmonar relacionada con el tratamiento del cáncer de las infecciones pulmonares, facilitando decisiones clínicas precisas y oportunas.

Resumen

Los pacientes con lesión pulmonar relacionada con el tratamiento del cáncer (CTLI) presentan frecuentemente síntomas respiratorios inespecíficos y cambios radiológicos que imitan estrechamente la neumonía infecciosa o la progresión tumoral, lo que supone un desafío significativo para un diagnóstico definitivo. Los procesos diagnósticos tradicionales, que se evalúan principalmente mediante biomarcadores sanguíneos y cultivos microbianos estándar, normalmente no pueden hacer un diagnóstico claro y requieren demasiado tiempo. Aquí presentamos un protocolo integral para diagnosticar el LCT combinando el análisis citológico con líquido de lavado broncoalveolar (BALF) con la secuenciación metagenómica de nueva generación (mNGS). El flujo de trabajo procedimental consta de tres etapas principales. En primer lugar, se realiza una broncoscopia estandarizada para obtener muestras de BALF de alta calidad. En segundo lugar, realizar un análisis citológico de las muestras obtenidas de BALF proporciona una instantánea del microambiente pulmonar. Esto permite identificar características inflamatorias y detectar células malignas para excluir la progresión tumoral. Por último, el mNGS se utiliza para identificar o excluir etiologías infecciosas activas. Esta técnica genómica avanzada logra una detección rápida, altamente sensible e imparcial de patógenos, superando con éxito las limitaciones de los cultivos tradicionales. Los resultados representativos que utilizan este método demuestran que este enfoque puede distinguir eficazmente la neumonitis inmunológica de las infecciones pulmonares activas o de la progresión tumoral. En comparación con los métodos diagnósticos tradicionales, este protocolo tiene la ventaja de distinguir rápida y con precisión el CTLI de las etiologías infecciosas y las malignidades ocultas. En última instancia, este flujo de trabajo estandarizado aclara diagnósticos clínicos, guía decisiones críticas de tratamiento y mejora los resultados para los pacientes.

Introducción

Los avances en tratamientos antitumorales, como los inhibidores de puntos de control inmunitarios y las terapias dirigidas, han mejorado significativamente la supervivencia del paciente, pero también han incrementado la incidencia de toxicidades pulmonares no infecciosas, conocidas colectivamente como lesión pulmonar relacionada con el tratamiento del cáncer (CTLI)1,2,3,4,5,6,7 . Cabe destacar que la neumonitis inhibidora de puntos de control (CIP) ha surgido como un evento adverso fatal relacionado con el sistema inmune, con tasas de incidencia globales del 2–19% y tasas de mortalidad que alcanzan hasta el 35%8,9,10. El diagnóstico de la LCT presenta un gran desafío clínico porque sus síntomas respiratorios inespecíficos y manifestaciones radiológicas —como opacidades del vidrio esmerilado, consolidación o opacidades reticulares— imitan estrechamente los de neumonía infecciosa o progresióntumoral 11,12,13,14.

Actualmente, un diagnóstico de LCT debe determinarse excluyendo cuidadosamente otrasetiologías 15. Los flujos de trabajo diagnósticos tradicionales dependen en gran medida de biomarcadores sanguíneos y cultivos microbianos estándar, que son lentos y con frecuencia no logran un diagnósticodefinitivo 16,17,18,19,20,21,22,23. Aunque la biopsia quirúrgica pulmonar proporciona evidencia histopatológica clara, su invasividad la hace inadecuada para pacientes con cáncer crítico. Por ello, existe una necesidad crítica de un enfoque diagnóstico eficaz y mínimamente invasivo. En la práctica clínica, el protocolo descrito aquí debe aplicarse a pacientes con cáncer que hayan recibido previamente o estén recibiendo tratamientos antitumorales (por ejemplo, inmunoterapia o terapia dirigida) y presenten nuevos síntomas respiratorios y cambios en la imagen pulmonar. Se recomienda especialmente cuando se sospecha clínicamente de la LCT, las pruebas estándar no invasivas no proporcionan un diagnóstico claro y el paciente no puede tolerar exámenes quirúrgicos invasivos.

La broncoscopia combinada con lavado broncoalveolar (BAL) actúa como una "biopsia líquida" mínimamente invasiva del tractorespiratorio inferior 24. Al integrar el análisis citológico de BAL fluid (BALF) con la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS), este enfoque mejora significativamente los flujos de trabajo diagnósticos existentes. En primer lugar, la citología BALF proporciona una instantánea directa del microambiente pulmonar; puede identificar características inflamatorias25, como la linfocitosis y una relación invertida CD4/CD8 en la CIP, mientras simultáneamente se detecta células malignas para descartar la progresióntumoral 26,27,28,29,30. En segundo lugar, la mNGS logra una detección rápida, altamente sensible e imparcial de patógenos, superando las bajas tasas de detección y los retrasos de los cultivos tradicionales, especialmente para bacterias exigentes o patógenosatípicos 31,32,33,34,35. Se ha demostrado que el uso combinado de estas modalidades mejora significativamente la detección de infecciones mixtas y guía tratamientos precisos, reduciendo drásticamente la mortalidad delos pacientes 4,5.

A pesar de este potencial clínico, actualmente no existe un protocolo estandarizado para la recogida y análisis integral de BALF en el contexto de la CTLI. Aquí introducimos un protocolo estandarizado para obtener y procesar BALF mediante broncoscopia, combinando explícitamente la evaluación citológica con la mNGS. La novedad metodológica de este flujo de trabajo radica en su capacidad diagnóstica dual: utiliza la citología para mapear el microambiente inmunitario y excluir malignidades, junto con la mNGS para descartar o descartar de forma definitiva infecciones activas. En comparación con los métodos diagnósticos tradicionales, este protocolo integrado ofrece la ventaja clara de diferenciar rápida y con precisión el CTLI de las etiologías infecciosas y la progresión del tumor oculto. En última instancia, este flujo de trabajo estandarizado acelera el calendario diagnóstico y guía intervenciones clínicas oportunas y dirigidas (Figura 1).

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Protocolo

Este protocolo se adhiere a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de revisión institucional de nuestro hospital. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes antes del procedimiento.

1. Preparación previa al procedimiento

  1. Evaluación del paciente (dentro de la semana siguiente a la broncoscopia)
    1. Realizar análisis de laboratorio recientes, incluyendo un hemograma completo y un perfil de coagulación, para garantizar la seguridad de un procedimiento invasivo (Archivo Suplementario 1).
    2. Realiza un electrocardiograma de 12 derivaciones.
    3. Evalúa los signos vitales y asegura la estabilidad hemodinámica.
    4. Mide la saturación de oxígeno en reposo del paciente en el aire ambiente para evaluar la función pulmonar.
      NOTA: Si el SpO₂ es bajo o el paciente tiene compromiso respiratorio, considere un análisis de gases arteriales para detectar PaO₂/PaCO₂ basales.
    5. Filtra todas las contraindicaciones.
    6. Indica al paciente que ayune al menos 6 horas y evite beber agua durante 2 horas antes del procedimiento para reducir el riesgo de aspiración.
    7. Realiza succión oral y nasal y limpieza inmediatamente antes del procedimiento para minimizar la contaminación de las vías respiratorias superiores.
  2. Preparación de equipamiento y personal
    1. Preparar todo el aparato de broncoscopia y el equipo de monitorización necesarios. Seleccione un tamaño adecuado de broncoscopio según la anatomía de las vías respiratorias del paciente. Verifica la funcionalidad de succión del broncoscopio.
      NOTA: Asegúrese de que el equipo de reanimación de emergencia, incluidos dispositivos suplementarios de suministro de oxígeno y aparatos de succión, esté disponible inmediatamente en la sala de procedimientos para gestionar posibles complicaciones en las vías respiratorias. Cualquier broncoscóscopo certificado con formación estándar puede realizar este procedimiento de forma independiente sin certificaciones especializadas.
    2. Calienta la solución fisiológica estéril (0,9% NaCl) destinada al lavado a 37 °C.
    3. Extrae entre 100 y 150 mL de la solución salina estéril calentada en varias jeringuillas de 20 mL para facilitar una rápida instillación.
  3. Configuración de posicionamiento y monitorización del paciente
    1. Coloca al paciente en posición supina sobre la camilla de broncoscopia.
    2. Instala equipos de monitorización continua para el paciente antes de comenzar el procedimiento.
      1. Aplicar electrocardiogramas (ECG) directamente en el pecho del paciente para monitorizar continuamente la actividad cardíaca.
      2. Conecte una sonda de pulsioxímetro al dedo del paciente para monitorizar continuamente la saturación de oxígeno y el pulso en sangre.
      3. Fije un manguito tensiforme no invasivo en la parte superior del brazo del paciente para detectar continuamente la presión venosa.
  4. Instalación del dispositivo de soporte de oxígeno y destete postprocedimiento
    1. Preparar y configurar el dispositivo de soporte de oxígeno adecuado en función del estado respiratorio base del paciente. Complete esta configuración antes de iniciar la broncoscopia.
    2. Montaje de cánula nasal de alto flujo (HFNC)
      1. Selecciona un sistema HFNC para pacientes conSpO2 ≥ 90% de aire ambiente y sin hipercapnia. Conecta la cánula al paciente y ajusta el caudal inicial de gas a ≥60 L/min con unFiO 2 de 1,0. Ajusta continuamente la FiO2 durante el procedimiento para mantenerSpO 2 ≥ 90%.
    3. Estrategia de transición para pacientes con ventilación no invasiva (NVI)
      1. Retirar la mascarilla NVI y transferir al paciente a un sistema HFNC inmediatamente antes de la inserción del broncoscopio. Ajusta el caudal de gas HFNC a ≥60 L/min con unFiO 2 de 1,0. Realizar succión activa de las vías respiratorias durante el periodo sin máscara para eliminar secreciones y optimizar la permeabilidad de las vías respiratorias.
      2. Vigila de cerca al paciente para detectar desaturación durante la transición temporal de la VIN a la HFNC. Si el SpO₂ baja del 90% y sigue siendo refractario a la succión y a los ajustes máximos de HFNC, abortar inmediatamente el procedimiento de broncoscopia. Reaplicar rápidamente la mascarilla de VNI para restaurar la presión positiva o escalar a una intubación endotraqueal invasiva si el estado respiratorio del paciente se deteriora.
    4. Instalación invasiva de ventilación mecánica (IMV)
      1. Ajusta el volumen de marea a 6–8 mL/kg de peso corporal previsto, FiO₂ a 1,0, presión positiva al final de la espiración (PEEP) a 5–8 cmH₂O y frecuencia respiratoria a 12–16 respiraciones/min. Inserta el broncoscopio directamente a través del tubo endotraqueal establecido.
    5. Mantener un seguimiento continuo de signos vitales al finalizar el lavado broncoalveolar (BAL). Ajusta el oxígeno suplementario para mantenerSpO 2 entre el 92% y el 96% (o entre el 88% y el 92% en pacientes con hipercapnia crónica).
    6. Verificar que el paciente cumpla todos los siguientes criterios antes de reducir el soporte de oxígeno: salida completa de la sedación, restauración de reflejos protectores de las vías respiratorias, estabilidad hemodinámica y ausencia de hemorragia activa o broncoespasmo severo.
    7. Para el destete con HFNC, primero reduce la concentración y luego el caudal. Disminuye el FiO₂ en incrementos del 5% al 10% hasta alcanzar el ≤40%. Posteriormente, disminuye el caudal en incrementos del 5% al 10%. Suspender completamente la HFNC cuando el paciente mantenga el SpO₂ objetivo con un FiO₂ ≤ 35% y un caudal ≤ 20 L/min.
    8. Para el destete de la VIN, asegúrate de que la hipoxemia mejore y que los signos vitales estén estables, y luego procede con uno de dos métodos:
      1. Disminuye el IPAP en 2–3 cmH₂O por ajuste, reduce la PEEP a 4–5 cmH₂O y disminuye la FiO₂ a ≤40%.
      2. Para el destete intermitente, hacer la transición al paciente a la HFNC para facilitar y extender gradualmente la duración de la respiración espontánea. Reinicie inmediatamente el soporte total de la VIN si el paciente presenta taquipnea (>30 respiraciones/min), taquicardia (>140 latidos/min), fatiga muscular respiratoria, alteración del estado mental o SpO₂ < 90%.
    9. Para el destete IMV, realiza una prueba de respiración espontánea o una prueba de fugas en el manguito. Proceder a la extubación solo después de que el paciente supere con éxito el ensayo, demuestre una fuerza adecuada en la tos espontánea y exhiba secreciones mínimas en las vías respiratorias.
  5. Sedación y anestesia
    1. Inyectar 15 mL de lidocaína al 2% en la mucosa nasal y orofaringe, divididos en 2–5 dosis.
    2. Inyectar 10 mL de lidocaína al 2% en dosis divididas a través del canal de trabajo del broncoscopio. Aplica estas dosis paso a paso mientras avanzas el broncoscopio hacia la vía aérea para cubrir la mucosa traqueal, carina y árbol bronquial.
      NOTA: La dosis máxima absoluta segura de lidocaína tópica es incierta. La toxicidad suele producirse cuando la concentración sérica supera los 5 μg/mL, pero los efectos secundarios subjetivos pueden aparecer en concentraciones más bajas. Haz un seguimiento cuidadoso del volumen total de anestésico administrado.
    3. Administrar sedación sistémica según la preferencia del paciente, el grado de ansiedad y la tolerancia esperada al procedimiento para garantizar una anestesia adecuada, maximizar el confort del paciente y reducir la tos. Administrar midazolam 2–2,5 mg mediante inyección intravenosa lenta, o reducir la dosis a 0,5–1 mg para pacientes frágiles oancianos 36.
    4. Seadoptan continuamente el monitor SpO₂, el ECG y la presión arterial no invasiva (NIBP).
      NOTA: La sedación sistémica aumenta significativamente los riesgos de hipoxemia refractaria, colapso de las vías respiratorias e intubación traqueal de emergencia. Vigila de cerca al paciente durante todo el procedimiento.

2. Procedimiento BAL

NOTA: Realizar el procedimiento de recogida de BALF estrictamente conforme a los protocolos estándar y las directrices de práctica clínica.

  1. Selección del segmento pulmonar objetivo (Figura 2)
    1. Revisa la tomografía computarizada torácica de alta resolución (HRCT) más reciente del paciente antes del procedimiento para determinar la distribución anatómica precisa de la enfermedad pulmonar.
    2. Seleccione el segmento pulmonar objetivo para la BAL en función de la distribución específica de la enfermedad identificada en la tomografía de la TCFC.
    3. Indica al broncoscopio que realice el lavado en el segmento más afectado radiográficamente o en el segmento que demuestre la progresión más rápida para enfermedad localizada o marcadamente asimétrica.
    4. Dirige el broncoscopio para lavar el lóbulo medio derecho o la lingula del lóbulo superior izquierdo para detectar enfermedades difusas o simétricas, ya que estos sitios anatómicos suelen proporcionar un retorno adecuado de líquidos.
  2. Prelavado y descarte de muestras
    1. Inyecta entre 20 y 30 mL de solución salina calentada a través del broncoscopio en el segmento encallado. Espera 20–30 s.
    2. Aplica una succión suave (presión negativa 50–100 mmHg) para aspirar el líquido de nuevo. Recoge esta primera alicota en una trampa y deséchala sin enviarla a análisis, ya que puede contener moco y restos bronquiales.
  3. Procedimiento principal de lavado
    1. Conecte firmemente una jeringuilla estéril que contenga un 0,9% de solución fisiológica normal al canal de trabajo del broncoscopio.
    2. Inyecta 20 mL de solución salina a través del canal de trabajo durante 3–5 s. Pausa inmediatamente durante 5–10 segundos tras la inyección, permitiendo que el líquido se disperse completamente y se asiente en los espacios alveolares distales por gravedad.
    3. Aplica una succión suave para recuperar el líquido infundido en una trampa de recogida estéril. Mantén una presión de succión por debajo de 100 mmHg para evitar un colapso significativo de las vías respiratorias o daños en la mucosa de las vías respiratorias.
    4. Repita estrictamente la secuencia de instillación, pausa y succión hasta que el volumen total infundido esté entre 100 y 150 mL para asegurar que la muestra del tracto respiratorio inferior sea adecuada y representativa.
      NOTA: Monitoriza continuamente los signos vitales, la saturación de ogénito y la comodidad del paciente durante todo el procedimiento. Pausa el procedimiento inmediatamente si se produce una tos intensa o desaturación y reanuda solo después de que el paciente se haya estabilizado.
  4. Técnica de recuperación de líquidos
    1. Utiliza baja presión de succión (≤100 mmHg) para evitar el colapso de las vías respiratorias.
    2. Emplea una técnica de "succión pulsada" en lugar de succión continua: ocluye y libera intermitentemente el tubo de succión para permitir que el aire se mezcle, movilizando el líquido y evitando que el bronquio colapse contra el endoscopio.
    3. Objetivo de obtener al menos 40–60 mL de BALF.
      NOTA: Cesar el lavado si el paciente desarrolla complicaciones (por ejemplo, broncoespasmo, hipoxemia intolerable), incluso si no se recupera el volumen completo. Mantén el tiempo total del procedimiento para la instillación y aspiración de BAL por debajo de 2–3 minutos para minimizar el riesgo de hipoxia.
  5. Cuidado post-lavado
    1. Retira el broncoscopio con cuidado al completar el BAL.
    2. Aspira cualquier secreción restante de las vías aéreas centrales.
      NOTA: Continúe con el soporte con VNIF o con la VIN si se utiliza hasta que el paciente esté estable en la recuperación. Vigila al paciente para detectar complicaciones postprocedimentales, como sangrado o neumotórax.

3. Manejo de muestras y control de calidad

  1. Medición, transporte y evaluación inicial del BALF
    1. Anota el volumen de líquido retornado frente al volumen infundido inmediatamente durante el procedimiento.
    2. Calcula el porcentaje de recuperación usando la siguiente fórmula:
      Porcentaje de recuperación = (volumen recuperado / volumen inculcado) × 100%
      NOTA: Una recuperación del ≥30% se considera generalmente una buena muestra de BALF.
    3. Coloca el BALF recogido en hielo inmediatamente. Transporta el BALF con prontitud al laboratorio.
      PRECAUCIÓN: Las muestras humanas de BALF pueden ser potencialmente infecciosas. Manipula todas las muestras con las precauciones estándar adecuadas.
    4. Observa y registra el color macroscópico y la turbidez de la muestra de BALF antes del procesamiento.
      NOTA: El líquido claro o amarillo pálido sin turbidez visible es típico de estados no infecciosos. Un aspecto turbio o lechoso se asocia con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP)38. El líquido purulento indica una posible infección bacteriana. El líquido con tinte de sangre indica posible hemorragia o hemorragia alveolardifusa 39.
  2. Evaluación de la viabilidad celular
    1. Diluir el BALF a una concentración de aproximadamente 1 × 106 células/mL usando solución fisiológica estéril.
    2. Mezcle el BALF diluido con azul de tripán en una proporción de volumen 1:1 para obtener una mezcla de reacción de 20 μL.
      PRECAUCIÓN: El azul de tripán es un químico tóxico y se sospecha que es carcinógeno.
    3. Incuba la mezcla de reacción durante 3 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
    4. Coloca la mezcla en un hemocitómetro. Examina las células bajo un microscopio óptico de baja potencia.
    5. Contar un mínimo de 200 células para determinar sistemáticamente la viabilidad de las células.
      NOTA: Las células viables permanecen sin teñir, son transparentes y morfológicamente intactas, mientras que las células no viables absorben el tinte azul. Se requiere una viabilidad inicial de las células del >90%–95% para garantizar conteos fiables de citología aguas abajo.
  3. Distribución de alícuotas
    1. Dividir el BALF en tubos designados para diferentes análisis durante la operación de lavado.
    2. Designa el Tubo 1 como "descartado" para la primera alitería devuelta.
    3. Designa el Tubo 2 para microbiología y asigna entre 10 y 20 mL de BALF para el estudio del patógeno (por ejemplo, mNGS).
      NOTA: Realizar simultáneamente tinción/cultivo bacteriano de Gram, tinción/cultivo fúngico, citología de bacilo ácido-rápido (AFB) y PCR simultáneamente en la práctica clínica.
    4. Designa el Tubo 3 para citología y reserva al menos 10 mL para el recuento celular total y diferencial.
    5. Designa el Tubo 4 como reserva opcional y almacena cualquier fluido restante (a 4 °C para corto plazo o -80 °C a largo plazo) para pruebas adicionales.
      NOTA: Congela la muestra de mNGS a -80 °C inmediatamente si la prueba no puede comenzar de inmediato. Procesar muestras de citología frescas; si se anticipa un retraso, refrigerar la muestra a 4 °C durante hasta 24 horas para preservar la morfología celular.

4. Procesamiento en laboratorio de BALF

  1. Recuento total de células
    1. Invierte el tubo para mezclar suavemente el BALF y vuelve a suspender las células.
    2. Diluir el BALF con un volumen adecuado de solución fisiológica estéril si la muestra contiene tapones de moco macroscópicos y restos.
    3. Prehumedece una gasa médica estéril a fondo con solución fisiológica estéril antes de la filtración. Filtra la muestra diluida a través de dos capas de la gasa médica estéril prehumedecida.
    4. Recoge el filtrado en un tubo de recogida estéril. Cuenta el total de células nucleadas usando un analizador hematólogo.
      NOTA: Una baja contaminación por células epiteliales (<5% de las células) y una proporción mínima de glóbulos rojos (<10%) indican una muestra alveolar de alta calidad.
  2. Recuento diferencial de células
    1. Transfiere 1 mL de la muestra bien mezclada de BALF a un microtubo de 1,5 mL. Centrifuga el microtubo a 211 × g durante 5 minutos para concentrar las células.
    2. Retira el sobrenadante, dejando exactamente entre 50 y 100 μL de fluido en el microtubo. Resuspende bien la pastilla celular en el sobrenadante restante.
    3. Pipete 10–20 μL de la suspensión de celda resuspendida sobre la superficie de una lámina de vidrio limpia, cerca del borde esmerilado.
    4. Sujeta una segunda lámina de vidrio limpia en un ángulo de 30–45° respecto a la primera. Empuja la segunda lámina hacia adelante usando una técnica suave de cuña para crear una mancha celular fina y uniforme.
    5. Repite los pasos 4.2.3 a 4.2.4 para preparar 2–3 diapositivas idénticas.
    6. Deja que las láminas difundidas se sequen completamente al aire a temperatura ambiente.
    7. Teñe las láminas usando el método Wright-Giemsa.
    8. Observa las láminas teñidas bajo un microscopio óptico usando un objetivo de inmersión en aceite de alta potencia (aumento de 1.000×).
    9. Identificar y categorizar al menos 400 células para determinar el recuento diferencial de células.
      NOTA: Conservar cualquier muestra de BALF con alta sospecha clínica de malignidad a 4 °C y enviarla al laboratorio central de patología para su citocentrifugación estandarizada en un plazo de 2 horas tras la recogida de la muestra.
  3. Tubería mNGS
    1. Inactiva la muestra de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) incubándola a 65 °C durante 30 minutos.
    2. Transfiere 0,5 mL de la muestra inactivada de BALF a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 1 g de perlas de vidrio de 0,5 mm.
    3. Fija el tubo de la microcentrífuga a una plataforma horizontal en un mezclador de vórtice. Agitar la mezcla a 2.800–3.200 rpm durante 30 minutos para facilitar la alteración mecánica de la pared celular microbiana y la posterior liberación de ADN.
    4. Centrifuga brevemente el tubo para asentar las perlas y transfiere cuidadosamente 0,3 mL del sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    5. Extrae los ácidos nucleicos totales del sobrenadante utilizando un kit de extracción de ADN de microvolumen, siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante.
    6. Mide la concentración del ADN extraído usando un fluorómetro.
    7. [PUNTO DE PAUSA] Almacenar el ADN extraído a -20 °C para uso a corto plazo o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo si no se prepara la biblioteca de inmediato.
    8. Construye las bibliotecas metagenómicas a partir del ADN extraído utilizando un kit de preparación de bibliotecas de entrada ultra baja.
    9. Inspeccionar las bibliotecas construidas para asegurar el tamaño adecuado de los fragmentos y la concentración suficiente.
    10. Secuenciar las bibliotecas cualificadas en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento.
  4. Análisis de datos de secuenciación
    1. Elimina lecturas de baja calidad y secuencias adaptadoras de los datos en bruto de secuenciación usando software de procesamiento de secuencias.
    2. Las lecturas de descarte con una longitud inferior a 35 pares de bases (pb), lecturas con baja complejidad y lecturas con una puntuación de calidad Phred (puntuación Q) inferior a 20.
    3. Alinea las lecturas de alta calidad al genoma de referencia humano (versión hg38) utilizando un algoritmo de alineación Burrows-Wheeler para identificar secuencias de ADN humano.
    4. Descarta las secuencias alineadas del huésped humano para aislar los datos de secuenciación no hospedador.
    5. Compara las lecturas restantes de secuenciación no hospedadora con una base de datos de referencia de clasificación para obtener información microbiana a nivel de especie. Construir la base de datos a partir de bases de datos de genomas microbianos publicadas, como la base de datos de secuencias de referencia del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Asegúrese de que contenga datos completos sobre patógenos (por ejemplo, 25.863 patógenos que comprenden 12.142 bacterias, 2.680 hongos, 10.061 virus, 654 parásitos, 206 micobacterias y 120 micoplasma/clamidia).
    6. Establecer controles negativos ('Sin plantilla', NTC) y positivos procesándolos mediante los mismos procedimientos de extracción, preparación de bibliotecas y análisis bioinformático.
    7. Examina el número de lectura estrictamente mapeado (SMRN) y la cobertura genómica para la evaluación diagnóstica.
      NOTA: SMRN denota la cantidad de secuencias que están alineadas con precisión con el microorganismo a nivel de especie.
    8. Clasificar un resultado bacteriano, fúngico, micoplasma o clamidia: el resultado mNGS es positivo si el microorganismo no se detecta en la NTC Y su cobertura genómica está entre los 10 primeros entre los microbios del mismo género, O si la proporción de SMRN_sample a SMRN_NTC es > 10 (cuando SMRN_NTC ≠ 0).
    9. Confirmar que el SMRN_sample cumple los siguientes umbrales mínimos para un resultado positivo: ≥3 para bacterias, hongos, micoplasmas y clamidias; ≥100 para parásitos; y ≥1 para Mycobacterium tuberculosis.
    10. Clasifica un resultado viral de mNGS como positivo si el virus no se detecta en la NTC, O si la proporción de SMRN_sample a SMRN_NTC es >5 (cuando SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Confirma que la SMRN_sample para virus es ≥1.
    12. Elabora una lista de patógenos candidatos junto con sus conteos de lectura o abundancias relativas.
    13. Registrar cualquier gen de resistencia a los antibióticos o factor de virulencia identificado por la cadena de bioinformática.
    14. Define un impacto significativo combinando el número de lecturas, la comparación estadística con los grupos de control y la relevancia clínica.
    15. Evalúa si cada patógeno identificado puede explicar la situación clínica.

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Resultados

Siguiendo el protocolo estandarizado anterior, los clínicos pueden obtener de forma reproducible muestras de BALF de alta calidad y aprovechar tanto análisis celulares como genómicos para distinguir el CTLI de sus imitadores. A continuación, presentamos un resultado representativo de nuestro caso para ilustrar los hallazgos típicos. Se presenta a una mujer de 68 años con cáncer de pulmón en estadio IV poco diferenciado (tumor primario de la región pleural derecha) bajo inmunoterapia con ...

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Discusión

En la era actual de la terapia contra el cáncer, las lesiones orgánicas relacionadas con el tratamiento, como las inducidas por inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICI), siguen siendo una preocupación clínica importante que puede limitar la progresión del tratamiento o incluso ser potencialmente mortal 3,4. Entre los eventos adversos inmunológicos (IRAE) inducidos por ICI, la neumonitis ha recibido una atención signifi...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Declaración de Asistencia a la IA:
Los autores declaran el uso de tecnologías asistidas por IA durante la preparación de este manuscrito. Concretamente, Gemini by Google se utilizó exclusivamente para pulir el idioma inglés, corregir errores gramaticales y asegurar que el formato estructural cumpliera con las directrices de la revista. La herramienta de IA no se utilizó para la generación, análisis ni la interpretación de resultados científicos. Todos los autores han revisado minuciosamente el texto generado, realizado las ediciones necesarias y asumido toda la responsabilidad de la exactitud científica e integridad del manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Mejora de la Capacidad de Tecnología Sanitaria de la Comisión Provincial de Salud de Jilin (Subvención nº 2023JC007).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2% de lidocaínaHunan KelunN/AAnestesia local para la mucosa de las vías respiratorias.
Cuentas de vidrio de 0,5 mmSigmaN/AUtilizado para la alteración mecánica de la pared celular de microbios.
Broncoscopio electrónico BF-260OlimpoN/AEl broncoscopio se utiliza para obtener líquido de lavado alveolar.
Alineación Burrows-WheelerCódigo abierto0.7.17(RRID:SCR_010910)Algoritmo para mapear secuencias al genoma humano.
Instrumento de oxigenoterapia humidificada de alto flujoBMC MedicalN/AProporciona un flujo determinado, gas respiratorio calentado y humidificado para pacientes con respiración espontánea.
Mezclador de vórticeCientífico y nbsp; IndustriasN/AIndustrias científicas
MidazolamJiangsu EnhuaN/ASedante sistémico para la comodidad del paciente.
Plataforma Nextseq 550IlluminaN/ALa secuencia genética para secuenciar el genoma en BALF
Kit de Biblioteca de Entrada Ultrabaja QIAseqTiangenN/AKit para construir una biblioteca metagenómica
Qubit 4.0Thermo Fisher ScientificN/AInstrumento para detectar el contenido de ácidos nucleicos BALF
Kit de microADN TIANamp DP316TiangenN/AEl kit de extracción de ADN para extraer ácidos nucleicos totales de BALF
Azul de tripánBiosharpN/AColorante utilizado para la evaluación de la viabilidad celular.
  Baños MaríaJoanN/ASe utiliza para la inactivación de muestras de BALF a 65 °C.
Tinción de Wright-GiemsaYuanmuN/ASe usa para la tinción diferencial de células.
Analizador hematológico XN-9000SysmexSN-13699Analizador hematológico para contar el total de células nucleadas de la muestra de BALF

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