Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Resumen

Hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limita a la cuantificación de ARN o de proteína. Con las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina se describe en este artículo, será posible asignar metilación de las histonas y otros reguladores epigenética de la expresión génica en el cerebro postmortem.

Resumen

Enfermedades neuropsiquiátricas crónicas como la esquizofrenia, enfermedad bipolar y el autismo se cree que el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales que podrían resultar en alteraciones epigenéticas de la expresión génica y otras patología molecular. Tradicionalmente, sin embargo, los estudios de expresión en el cerebro post mortem se limitaron a la cuantificación de ARNm o proteína. Las limitaciones encontradas en la investigación postmortem del cerebro tales como variabilidad en el tiempo y la autolisis integridades tejido también es probable que el impacto de los estudios de estructuras de orden superior de la cromatina. Sin embargo, la organización nucleosomal de ADN genómico como el ADN: núcleo de unión de histonas - parece ser preservado en gran medida en muestras representativas de los bancos diferentes del cerebro. Por lo tanto, es posible estudiar el patrón de metilación y otras modificaciones covalentes de las histonas en definir loci del genoma en el cerebro postmortem. A continuación, presentamos una versión simplificada nativos inmunoprecipitación de cromatina (NChIP) protocolo para muestras de cerebro congelado (no fijos) humanos. A partir de la digestión nucleasa micrococcal de homogeneizados de cerebro, NChIP seguido por qPCR se puede completar en tres días. La metodología que aquí se presenta debe ser útil para dilucidar los mecanismos epigenéticos de la expresión génica en el cerebro humano normal y enfermo.

Protocolo

Procedimiento:

1 ^ª Jornada

1. Homogeneizar 50-500 mg de tejido congelado cuestión post-mortem gris con Douncing Buffer.

! PRECAUCIÓN - tejidos humanos deben ser manipulados con cuidado bajo condiciones de estricta seguridad. Se debe manipular a las normas de seguridad BSL-2 o superior.

1. Tener previamente disecado, post-mortem de cerebros de los -80 ° C, los Dounce en el volumen cerebral de Buffer 5X Douncing, y el lugar en el tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Combinado de la muestra y el control de los pares se procesan simultáneamente.

2. Micrococcal nucleasa (MN) Digestión

1. Añadir 5U/mL de micrococcal nucleasa de la muestra y la mezcla dentro de la solución con la pipeta de arriba a abajo antes de colocarlos en hielo.
   * Paso crítico - Es importante hacer este paso con rapidez ya que MN tiene la capacidad de actuar en hasta 4 ° C.
2. Incubar las muestras durante 7 minutos a 37 ° C.
3. Después de la incubación de 7 minutos, añadir 0,5 M EDTA a una concentración de 10 mM para detener la actividad MNase.

3. Hypotonisation

1. Coloque las muestras en un tubo de 15 ml halcón. Añadir 10 veces el volumen de muestra de 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 del volumen de muestra de benzamidina 0,2 M y el volumen 1 / 1000 de la muestra de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Estos dos últimos compuestos se utilizan como inhibidores de la proteasa.
   * Paso crítico - Es importante mantener las muestras en hielo durante todos estos pasos.
2. Incubar la muestra durante 1 hora, mientras agitación cada 10 minutos.
3. Al final de la incubación de una hora, agregar el volumen 1 / 2000 de la muestra de 3M TDT, un nuevo inhibidor de la proteasa.
4. Muestra Vortex, una vez más y se centrifuga a 3175 rcf durante 10 minutos a 4 ° C.
   * PASO OPCIONAL - Precleansing con proteína G agarosa.
   1. Tomar el sobrenadante y poner en el nuevo tubo de 15 ml halcón.
   2. Añadir 500 l de proteína G agarosa.
   3. Gire a la temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
5. Distribuir sobrenadante para que 500 l se utilizó como control de entrada (que contiene el ADN genómico solamente), y el resto se divide en dos tubos con 1.600 l de cada muestra - que son de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) muestras.
6. El control de entrada se sitúa en -80 ° CO / N hasta su posterior utilización.
7. A las muestras de chip - añadir volumen 1:10 de 10XFSB y 4μg de anticuerpos, entonces vórtice las muestras y girarlas a 4 ° C durante la noche.
   ! ATENCIÓN - La cantidad y la dilución de anticuerpos puede requerir de optimización.

2 ^º día

! ¡CUIDADO! - Comience a 2 ^º día lavando la proteína G agarosa que se utiliza para aislar el ADN nucleosomal. Desde bolas de agarosa son muy sensibles, es necesario cortar las cabezas de las puntas de pipeta siempre cualquier solución que contiene perlas de agarosa.

1. Sondeo de la proteína G perlas de agarosa para ADN

1. Añadir 1,6 ml 1XFSB a 245 l de proteína G-agarosa (suficiente para 4 tubos) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml (loop).
2. Separar la solución en dos tubos de 2 ml y llenar cada uno de hasta 1,6 ml con 1X FSB.
3. Gire a temperatura ambiente durante 30 segundos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
4. Eliminar el sobrenadante con una aspiradora.
5. Añadir 1,6 ml de 1X FSB, una vez más. Girar las muestras durante 30 segundos y luego se centrifuga a 0,1 RCF durante 30 segundos.
6. Eliminar el sobrenadante, una vez más, y se combinan los dos tubos con 1,5 mL 1XFSB.
7. Añadir 15 ul de ADN de esperma de salmón sonicado (10mg/ml).
   ! ATENCIÓN - Este paso se debe, en principio, reducir la unión no específica de la immunoprecipitate a las perlas. Sin embargo, esto también podría dar lugar a falsos positivos de algunas de las secuencias de ADN (humano).
8. Gire a temperatura ambiente durante 30 minutos y centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
9. Eliminar el sobrenadante. Añadir 200 uL de 1XFSB.
10. Añadir 90 l de bolas de agarosa en cada muestra de chip. Gire a 4 ° C durante 1 hora.
11. Añadir 1 ml de 1XFSB en resto de bolas de agarosa para servir como un control negativo y girar a 4 ° C durante 1 hora.
12. Después de la incubación de una hora, se centrifuga la muestra y el control negativo en el 0,1 RCF durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.

2. Lavado de las Perlas

! ¡CUIDADO! - Buffers de lavado debe mantenerse a 4 ° C hasta su uso, y deben ser utilizados sólo si son menos de un mes de edad.

1. Añadir 1 ml de cada solución de lavado hasta el talón y giran durante 3 min a temperatura ambiente.
2. Centrifugar a 0,1 RCF durante 30 segundos.
3. Desechar el sobrenadante con vacío.

* Cada solución de lavado

- Bajo la sal tampón de lavado

- Elevada de sal tampón de lavado

- Solución de cloruro de litio - sólo girar a temperatura ambiente durante 1 minuto!

- Buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elución

* Paso crítico - Hacer Tampón de Elución fresco para cada experimento el día en que se va a utilizar.

1. Añadir 250 l de buffer de elución recién preparada para cada muestra.
2. Girar durante 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 0,4 RCF durante 1 min.
3. Guardar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop).
4. Añadir 250 l de tampón de elución de cada muestra y agitar con la mano durante unos segundos. Luego, las muestras de vórtice durante 15 minutos en un mulitvortexer.
5. Centrifugar a 16 RCF rpm durante 4 minutos y guardar el sobrenadante en el mismo tubo de 2,0 mL (Loop).

4. Digerir las proteínas

1. Añadir 10 l 0,5 M EDTA, 25 l 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml de proteinasa K (1 / 200 de la muestra) a cada muestra de chip.
2. Para cada control de entrada, agregar solución amortiguadora de lisis para la digestión de proteinasa K (1 / 10 de tampón de muestra) y 10mg/ml proteinasa K (1 / 200 de tampón de muestra).
3. Incubar de entrada y de muestras de chips de 52 ° C durante al menos 3 horas.

5. Fenol / cloroformo extracción

! PRECAUCIÓN - Experimento requieren fenol / cloroformo se debe realizar bajo el capó. Use guantes de nitrilo al manejar con fenol / cloroformo.

1. Después de la incubación de 3 horas, le sumamos los 500 l de fenol-cloroformo a cada muestra.
2. Vortex todas las muestras de varios segundos, luego se centrifuga a 13 rpm RCF durante 5 minutos.
3. En este punto, dos fases estará presente y estamos interesados ​​en el contenido de la fase superior. Saque la fase superior y lo puso en un tubo de microcentrífuga 2 ml.
4. Añadir una mezcla de 2μL de glucógeno y 50μL de acetato de sodio 3M para cada muestra, junto con 1,375 ml de etanol al 100%.
5. Vortex todas las muestras de fuerza. Lugar en -80 ° C durante la noche.

3 ^º Día

1. Extraer muestras de forma -80 ° C y los coloca en el hielo para que se descongele.
2. Centrifugar a 15 RCF durante 10 minutos a 4 ° C.
3. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento en el fondo del tubo.
4. Añadir 1 ml de etanol frío al 75% para cada muestra, y luego invertir 4-6 veces.
5. Centrifugar a 18 RCF durante 5 min a 4 ° C.
6. Extraer el sobrenadante, una vez más y permitir que las pastillas se seque al aire.
7. Disolver pellets secos en 50 l de 4 mm de Tris-HCl, pH 8 y se almacena a -80 ° C hasta su uso posterior.

Discusión

El protocolo descrito aquí es particularmente útil para los investigadores interesados ​​en las firmas de metilación de las histonas y / o ADN del cerebro humano, ya que estas marcas de la cromatina puede ser menos propensa a los artefactos post-mortem, en comparación con otros tipos de modificaciones, incluyendo (histonas) acetilación y fosforilación ^{1, 2.} El cerebro postmortem se presta al estudio de la mono-nucleosomal los preparativos, el ADN permanece en gran parte unido a las histonas centrales, al menos en las muestras con...

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