Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Resumen

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Resumen

Las neuronas en el cerebro humano se postmitóticas en gran parte durante el desarrollo prenatal, y así mantener sus núcleos en todo el ciclo de vida completo. Sin embargo, poco se sabe acerca de los cambios en la cromatina nuclear y la organización neuronal durante el curso del desarrollo y el envejecimiento, o en las enfermedades neuropsiquiátricas crónicas. Sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los ensayos basados ​​en la cromatina y el ADN (excepto los de pescado) Resolución de la falta de células individuales. Con este fin, la gran heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante, ya que por lo general diversas subpoblaciones de neuronas se entremezclan con los diferentes tipos de glía y otras células no neuronales. Una posible solución sería hacer crecer células de tipo culturales específicas, pero la mayoría de las células del SNC, incluyendo las neuronas, son ex vivo sostenible, en el mejor de los casos, sólo un par de semanas y por lo tanto proporcionaría un modelo incompleto de los mecanismos epigenéticos potencialmente operan en todo el ciclo de vida completo . Aquí, ofrecemos un protocolo para extraer y purificar los núcleos de congelación (no fijos) del cerebro de cadáver. El método consiste en la extracción de núcleos en solución amortiguadora de lisis hipotónica, seguida por ultracentrifugación y immunotagging con anticuerpos anti-NeuN. Núcleos etiquetados neuronal continuación, se recogen por separado mediante fluorescencia activadas por la clasificación. Este método debe ser aplicable a cualquier región del cerebro en una amplia gama de especies y adecuada para los estudios de inmunoprecipitación de la cromatina en el sitio-y la modificación de los anticuerpos específicos anti-histonas, y por la metilación del ADN y otros ensayos.

Protocolo

Los núcleos de extracción

1. Poner 250 mg de tejido congelado el cerebro post mortem en 5 ml de ^un tampón de lisis en un douncer y colocarlo sobre hielo. Para recibir unos 5 millones de núcleos después de FACS clasificación, por lo general el uso de 1000 mg de tejido por muestra.
2. Una vez que el tejido se ha descongelado, el tejido Dounce durante 1 minuto, mientras que en el hielo.
3. Tome el tejido homogeneizado y colocarlo en un tubo de ultracentrífuga 15 ml claro. Ponga el tubo en hielo.
4. Tomar 9 mL de solución de sacarosa ² con una pipeta, poner la pipeta en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga claro,....

Discusión

El protocolo que aquí se presenta debe ser particularmente útil para los estudios se centraron en los cambios epigenéticos de la cromatina neuronal y, en general, sobre el fenotipo molecular del núcleo neuronal, durante el funcionamiento normal desarrollo de la enfermedad y el envejecimiento, o neurológicos o psiquiátricos. El método es particularmente ventajoso cuando la heterogeneidad celular del tejido cerebral, incluyendo posibles cambios en la ración de las neuronas a células gliales en el transcurso del tiempo ya causa de la enfermeda.......

Materiales

Reactivos:

1. Tampón de lisis
0,32 M	Sacarosa	5,47 g
5 mM	CaCl2	250 l
3 mM	Mg (acetato) 2	150 l
0,1 mM	EDTA	10 l
10 mM	Tris-HCl, pH 8	500 l
1 mM	TDT	17 l
0,1%	Triton X-100	50 l
Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada

2. Solución de sacarosa
1,8 M	Sacarosa	30,78 g
3 mM	Mg (acetato) 2	150 l
1 mM	TDT	17 l
10 mM	Tris-HCl, pH 8	500 l
Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada

3. Dounce buffer
10 mM	Tris	0,242 g
4 mM	MgCl2	0,163 g
1 mM	CaCl2	0,03 g
Ajustar el pH a 7.5 y el volumen a 200 ml con agua esterilizada