Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).
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Artículo de método
Inmunoprecipitación de ADN metilado
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La identificación de los patrones de metilación del ADN es un procedimiento común en el estudio de la epigenética, como la metilación se sabe que tiene efectos significativos en la expresión génica, y está involucrado con el desarrollo normal, así como la enfermedad
Protocolo
Extracción de ADN y preparación de muestras
ADN de una variedad de diferentes muestras (células cultivadas, fresco congelado, así como tejidos en parafina fijado en formol e incrustados) puede ser utilizado para MeDIP. Es importante usar el ADN altamente purificado sin proteínas asociadas, como las histonas. También es importante para eliminar el ARN tanto como sea posible de la muestra, ya que puede interferir con la cuantificación del ADN y la unión del anticuerpo. La cantidad de ADN utilizado para MeDIP puede variar de 200 ng a 1 mg dependiendo de la cantidad de ADN disponible. Para demostrar este protocolo, 1 ug de ADN se utiliza. El pr....
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Discusión
Hay una creciente conciencia de los juegos de rol significativo en la enfermedad de la metilación del ADN, por lo tanto el desarrollo de ensayos para medir esta modificación se están convirtiendo cada vez más importante 3, 12, 13. La técnica MeDIP es una herramienta susceptible de cribado, tanto en el de todo el genoma y el lugar específico de nivel 6, 7. Esta técnica proporciona una vista rápida de los niveles de metilación del ADN usando una cantidad limitada de partida de ADN y permite realizar .......
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Agradecimientos
Queremos agradecer a los miembros de la Brown y laboratorios de Lam por su participación en la crítica de este video y en el artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Michael Smith Fundación para la Investigación de la Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Sonicador Biorupter | Herramienta | Diagenode | UCD-200 TM | |
| Tubos microcentrífugos SafeSeal de 1,7 ml | Otro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| Espectrofotómetro ND 3300 | Herramienta | NanoDrop | ||
| Anticuerpo primario: Anti-5’-metilcitosina ratón mAb | Reactivo | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Anticuerpo secundario: Dynabeads M-280 Oveja anti-ratón IgG | Reactivo | Invitrogen | 112-01D | |
| Soporte magnético para tubos | Herramienta | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Herramienta | Labnet International | H5500 | |
| Tampón IP | 10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05 % Triton X-100. Almacenado a temperatura ambiente | |||
| Tampón de digestión | 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5 % SDS, 50 mM NaCl |
Referencias
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
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Reimpresiones y permisos
