Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Summary

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Abstract

Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.

Protocol

De cultivo celular

1. Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
2. Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de superficie celular, a continuación).
3. Piscina igual número de células a partir de cada punto del tiempo y la etiqueta con CyDye DIGE Fluor Cy2.....

Discussion

Concentración de proteínas

Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La cantidad relativa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit CyDye DIGE, 2 nmol	Reactivo	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reactivo	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Tampón pH 3-11NL	Reactivo	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reactivo	GE Healthcare	17-6003-77
Herramienta IPGbox		GE Healthcare	28-9334-65
Herramienta del kit IPGbox		GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak	Reactivo	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Reactivo fluido		GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF	Instrumento	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Componente	instrumento	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Herramienta de rodaja de gel		GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Unidad de separación y fuente de alimentación/unidad de control	Instrumento	Healthcare	80-6466-46	Unidad de 230 V: 80-6466-27
Typhoon 9410 Generador de imágenes de modo variable	Instrumento	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Instrumento Selector de Puntos		GE Healthcare	18-1145-28
Instrumento digestor Ettan		GE Healthcare	18-1142-68
Instrumento Ettan Spotter	GE	Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-33
Software de análisis diferencial 2D DeCyder	Otros	Healthcare	28-4012-01
Software de análisis ImageQuant	Otros	GE Healthcare	28-9236-62
Reactivo de urea		GE Healthcare	17-1319-01
Reactivo CHAPS		GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Ditiothreitol (DTT)	Reactivo	GE Healthcare	17-1318-01
Reactivo	azul de bromofenol	GE Healthcare	17-1329-01
Reactivo		Tris GE Healthcare	17-1321-01
Dodecilsulfato de sodio (SDS)	Reactivo	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glicerol 87%	Reactivo	GE Healthcare	17-1325-01
Reactivo PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C		GE Healthcare	17-1310-01
Reactivo PlusOne TEMED		GE Healthcare	17-1312-01
Reactivo de persulfato de amonio PlusOne		GE Healthcare	17-1311-01
Reactivo de glicina PlusOne		GE Healthcare	17-1323-01
Preparación de muestras 2D para proteínas de membrana	Reactivo	Pierce, Thermo Scientific	89864
Sulfato de estreptomicina	Reactivo	Invitrogen	15140-122