Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Resumen

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Resumen

Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.

Protocolo

De cultivo celular

1. Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
2. Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de superficie celular, a continuación).
3. Piscina igual número de células a partir de cada punto del tiempo y la etiqueta con CyDye DIGE Fluor Cy2.....

Discusión

Concentración de proteínas

Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La cantidad relativa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit CyDye DIGE, 2 nmol	Reactivo	GE Healthcare	28-9345-30
Kit 2-D Quant	Reactivo	GE Healthcare	80-6484-51
Tampón IPG pH 3-11NL	Reactivo	GE Healthcare	17-6004-40
Franja seca Immobiline pH 3-11NL, 24 cm	Reactivo	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Herramienta	GE Healthcare	28-9334-65
Kit IPGbox	Herramienta	GE Healthcare	28-9334-92
Solución de rehidratación DeStreak	Reactivo	GE Healthcare	17-6003-19
Fluido de cobertura para franjas secas Immobiline	Reactivo	GE Healthcare	17-1335-01
Unidad Ettan IPGphor 3 IEF	Instrumento	GE Healthcare	11-0033-64
Colector Ettan IPGphor	Componente del instrumento	GE Healthcare	80-6498-38
Ensamblador de geles Ettan DALTtwelve	Herramienta	GE Healthcare	80-6467-22
Unidad de separación Ettan DALTtwelve y fuente de alimentación/unidad de control	Instrumento	GE Healthcare	80-6466-46	Unidad de 230 V: 80-6466-27
Imagenador de modo variable Typhoon 9410	Instrumento	GE Healthcare	63-0055-81
Seleccionador de manchas Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1145-28
Digestor Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-68
Dispensador Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-33
Software de análisis diferencial 2-D DeCyder	Otro	GE Healthcare	28-4012-01
Software de análisis ImageQuant	Otro	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reactivo	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reactivo	GE Healthcare	17-1314-01
Ditiotreitol (DTT) PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1318-01
Azul de bromofenol	Reactivo	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reactivo	GE Healthcare	17-1321-01
Dodecilsulfato sódico (SDS)	Reactivo	GE Healthcare	17-1313-01
Glicerol 87% PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1325-01
ReadySol IEF 40% T, 3% C PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1310-01
TEMED PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1312-01
Persulfato amónico PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1311-01
Glicina PlusOne	Reactivo	GE Healthcare	17-1323-01
Preparación de muestras 2-D para proteínas de membrana	Reactivo	Pierce, Thermo Scientific	89864
Sulfato de estreptomicina	Reactivo	Invitrogen	15140-122