5.7: Microscopía de Inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado en parafina

1. Configuración

1. El protocolo de tinción típico implica los siguientes pasos:
   1. Rehidratar las secciones de tejido en las diapositivas utilizando una serie de etanoles clasificados.
   2. Incubar las secciones tisulares con un tampón de bloqueo, lo que ayudará a bloquear la unión no específica de anticuerpos al tejido y reducir la fluorescencia de fondo.
   3. Extracción del tampón de bloqueo e incubación de la sección en anticuerpo primario, momento en el que el anticuerpo unirá su objetivo de péptido.
   4. Extracción del anticuerpo primario y lavado extenso de las secciones en tampón de lavado.
   5. Incubar las secciones con anticuerpo secundario para permitir la unión al anticuerpo primario, si el anticuerpo primario no está etiquetado directamente con un fluoróforo y se requiere un anticuerpo secundario.
   6. Lavar el anticuerpo secundario de las diapositivas.
   7. Montaje de las diapositivas en los medios de montaje y permitiendo que se sequen antes de la visualización en un microscopio fluorescente.
2. Se necesitan los siguientes elementos: portaobjetos (vidrio o plástico), frascos, pipetas, pluma de papá, cámara húmeda, resbalones de cubierta y medios de montaje con DAPI.
3. El xileno se utiliza para la rehidratación de diapositivas. El xileno es peligroso y debe utilizarse en una campana de humos junto con un EPP adecuado, incluidos guantes y una capa de laboratorio.
4. Recetas para búferes, soluciones y reactivos
   1. Etanoles clasificados
      Etanol - 160 mL 200 proof EtOH y 40mL ddH₂O
      Etanol - 140 mL 200 proof EtOH y 60mL ddH₂O
   2. Solución de recuperación de antígenos
      Citrato de sodio de 10 mM, pH 6,0
   3. Bloqueo del búfer
      100 l Suero del animal huésped del que se hizo el anticuerpo secundario
      900 L 1X PBS
      Nota: Este es el volumen de 10 secciones; ajustar el volumen para aproximadamente 100 l de búfer por sección, según sea necesario.
   4. Tampón de lavado (1X PBS)

2. Protocolo

1. Rehidratación con xilenos y etanoles
   1. Coloque las diapositivas en un portaobjetos y, a continuación, sumerja las diapositivas en la solución de isómeros de xileno 100%, asegurándose de que las diapositivas estén completamente cubiertas con solución.
   2. Incubar diapositivas en los isómeros 100% de xileno durante 3 min. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas. Asegúrese de limpiar la portaobjetos con una toalla de papel antes de transferirla a una nueva solución para minimizar la contaminación.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
   3. Incubar diapositivas en 100% EtOH durante 2 min. Repetir dos veces para un total de 3 incubaciones separadas.
      Nota: Se recomienda que estas incubaciones se realicen en tres recipientes separados.
   4. Incubar toboganes en 95% EtOH durante 2 min.
   5. Incubar toboganes en 80% EtOH durante 2 min.
   6. Incubar toboganes en 70% EtOH durante 2 min.
   7. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
2. (Opcional) Recuperación de antígenos para desenmascarar epítopos reconocidos por el anticuerpo primario
   Nota 1: Este procedimiento depende en gran medida del anticuerpo utilizado y se recomienda que se realicen los procedimientos de optimización inicial para determinar el requisito de recuperación de antígenos.
   Nota 2: Este procedimiento no se realizó con la tinción F4/80 que se muestra a continuación. El requisito para la recuperación de antígenos debe optimizarse con cada nuevo anticuerpo.
   1. Coloque los portaobjetos en un soporte de plástico o de vidrio resistente al calor y asegúrese de que el bastidor esté lleno de portaobjetos para garantizar una distribución uniforme del calor. Las diapositivas en blanco se pueden utilizar si hay menos muestras que ranuras en el bastidor.
   2. Coloque el bastidor en 1000 ml de solución de desenmascaramiento de antígeno en el vaso de precipitados 2L - 10 mL antígeno material de desenmascaramiento a 990 ml de agua.
   3. Microondas a fuego alto durante 20 minutos en total, asegúrese de que los portaobjetos permanezcan cubiertos con agua.
   4. Diapositivas frías durante 20 minutos en vaso de precipitados.
   5. Lave la rejilla deslizante en portaobjetos que contenga ddH₂O durante 5 min cada uno. Repita dos veces para un total de 3 incubaciones separadas usando_ddH2 O fresco cada vez. Los portaobjetos se pueden lavar en el mismo portaobjetos durante cada lavado.
   6. Incubar diapositivas en 1X PBS durante 5 min.
3. Círculo de secciones con una pluma de papá. Esto permitirá el uso de un volumen mínimo de tampones necesarios para cubrir las secciones de tejido. No permita que las secciones de tejido se sequen.
4. Agregue el búfer de bloqueo a cada sección. La cantidad de tampón necesaria para cubrir la sección variará dependiendo del tamaño de la sección, pero podría oscilar entre 25-500 l. Se debe utilizar suficiente tampón para formar un cordón que cubra toda la superficie de la sección, incluidos los bordes.
   Nota: La elección del tampón de bloqueo puede variar dependiendo del anticuerpo que se esté utilizando. Por ejemplo, se puede utilizar un 10% de suero del animal huésped en el que se elevó el anticuerpo secundario para reducir la unión no específica del anticuerpo secundario (por ejemplo, se puede utilizar suero de cabra normal si el anticuerpo secundario se crió en cabra). Se debe realizar la optimización del búfer de bloqueo para cada anticuerpo primario. Para manchar secciones tumorales mamarias con F4/80, se utilizó 0,1 ml de suero de cabra normal al 10% en PBS.
5. Incubar las secciones en tampón de bloqueo en una cámara humidificada durante 1 hora a temperatura ambiente o 4oC hasta 24 horas. La cámara humidificada garantiza que las secciones no se sequen.
6. Retire el búfer de bloqueo drenándolo de la diapositiva. Alternativamente, el tampón de bloqueo se puede quitar con una pipeta, aunque tenga cuidado de no tocar la sección con la punta de la pipeta.
7. Diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo.
   Nota: Deberá determinarse la dilución correcta para cada anticuerpo y tipo de muestra. La optimización incluiría realizar una serie de diluciones para identificar la tinción óptima. Para manchar las secciones tumorales mamarias con F4/80, las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4oC en anticuerpos anti-F4/80 de rata de 0,1 ml diluidos 1:100 en suero de cabra normal al 1% en PBS.
8. Añadir el anticuerpo primario a cada sección e incubar en una cámara humidificada durante un máximo de 16 horas (durante la noche) a 4oC. Deje al menos una sección en el tampón de bloqueo sin anticuerpo primario para servir como control, lo que ayudará a identificar la unión no específica por el anticuerpo secundario.
9. Escurra el anticuerpo primario o el tampón de bloqueo de la sección y lave las secciones con PBS colocando diapositivas en el portaobjetos y colocándolo en un portaobjetos con 1 PBS. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada vez.
10. Diluir el anticuerpo secundario 1:200 en el tampón de bloqueo. La dilución se puede optimizar dependiendo del anticuerpo secundario.
11. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubar durante 1 hora en una cámara humidificada protegida de la luz.
12. Escurrir el anticuerpo secundario de las secciones y lavar 3 veces en PBS durante 10 minutos cada vez.
13. Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a las diapositivas y coloque un cubreobjetos en las muestras. Si el soporte de montaje no es un tipo de soporte de secado rápido, puede ser necesario sellar los bordes de la corredera con cera de parafina derretida o esmalte de uñas para evitar fugas y mantener las muestras a largo plazo.
14. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en la oscuridad e idee las secciones con un microscopio fluorescente.

3. Análisis de datos y resultados

1. Las secciones manchadas se analizan con un microscopio fluorescente. Los detalles específicos de la captura y el análisis de imágenes dependerán de las especificaciones del microscopio y del software utilizado para realizar el análisis. Normalmente, las imágenes se pueden tomar como imágenes de un solo color y superponerse para generar imágenes multicolor. El porcentaje de celdas positivas se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente y dividiendo por el número total de celdas manchadas de DAPI dentro de una sección. Para la tinción F4/80 de secciones de tumores mamarios, utilizando el software Leica Application Suite, versión 3.8, en la pestaña Adquirir y en el modo de adquisición de superposición de imágenes, se habilitaron ambos DAPI y RFP. Exposición, Ganancia, y Gamma se ajustaron (20.0 ms, 1.0x, y 1.53 respectivamente para DAPI y 944.2 ms, 1.0x, y 1.08 respectivamente para RFP), aunque esto varía entre los experimentos. El botón Adquirir superposición se utilizó para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP.
2. La imagen siguiente(Figura 1) muestra un ejemplo de imagen de inmunofluorescencia de una sección tumoral manchada con F4/80, que detecta un antígeno en macrófagos y otras células mieloides. La sección se montó con medios de montaje que contienen DAPI y los núcleos se muestran en azul.

La función de una proteína en una célula depende en gran medida de su correcta localización dentro de la célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un método mediante el cual se puede visualizar una proteína dentro de las células utilizando tintes fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es decir, una molécula que absorbe energía luminosa a una longitud de onda específica mediante un proceso llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía a una longitud de onda diferente, lo que se conoce como emisión.

Los tintes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico de la diana y se introducen en células o tejidos cultivados mediante inmunotinción. Cuando este anticuerpo primario se une a la proteína de interés, la proteína se marca con el tinte fluorescente. Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios de proteínas para marcar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de montaje antidecoloración para preservar el marcado de fluorescencia y luego está lista para obtener imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa primero a través de un filtro de excitación, que permite que solo pase la luz en la longitud de onda de excitación. Luego, la luz de excitación llega a un espejo especializado, llamado espejo dicroico o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de onda de excitación hacia una lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita los fluoróforos, que luego emiten la energía luminosa a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la lente del objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite el paso de la luz de emisión. Luego, pasa por un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora llegan al ocular o cámara, donde presentan una imagen ampliada creada a partir de la luz emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de interés dentro de la célula.

Los tintes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunotinción para etiquetar los núcleos como punto de referencia dentro de las células. Se pueden utilizar múltiples fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de las proteínas.

Este video muestra el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una muestra de tejido, seguido de la obtención de imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia.

Antes de comenzar el proceso de tinción, las secciones, que se deshidrataron durante el proceso de incrustación, deben rehidratarse. Para hacer esto, primero, coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en isómeros 100% Xlene. Deje que los portaobjetos se incuben durante tres minutos. Luego, retire los portaobjetos del recipiente, limpie el exceso de xileno con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo, durante tres minutos más. Repita esta incubación cada vez en un recipiente nuevo con xileno fresco y limpie los portaobjetos con toallas de papel antes de transferirlos al nuevo recipiente, para un total de tres incubaciones. A continuación, incube las secciones en una serie de soluciones de etanol graduadas, comenzando con etanol al 100% durante dos minutos. Limpie la rejilla de portaobjetos con una toalla de papel y transfiera los portaobjetos a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros dos minutos. Continúe el ciclo de lavado, limpiando el exceso de etanol con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un nuevo baño, siguiendo las concentraciones de etanol indicadas durante el tiempo especificado. Después del lavado final con etanol, sacuda el exceso de solución e incube los portaobjetos en 1X PBS durante cinco minutos.

Para comenzar el proceso de tinción, primero, encierre las secciones en un círculo con un bolígrafo PAP para identificar el área mínima que deben cubrir los tampones. Una vez que las secciones estén claramente marcadas en el portaobjetos, agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a cada portaobjetos, asegurándose de cubrir toda la superficie de la sección. Después de que los pañuelos estén cubiertos con un tampón de bloqueo, coloque los portaobjetos en una cámara humidificada. Deje incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente.

Después del tiempo de incubación deseado, retire el tampón de bloqueo drenándolo del portaobjetos. A continuación, diluya el anticuerpo primario en tampón de bloqueo. Para una dilución 1:100, agregue 990 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario al mismo tubo. Etiquete un portaobjetos como control y luego agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo. Este control ayudará a identificar cualquier unión no específica del anticuerpo secundario. Ahora, agregue 100 microlitros de tampón de anticuerpos primarios a los portaobjetos restantes. Incubar las secciones durante la noche en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados, en la oscuridad.

Después de la incubación durante la noche, retire las secciones de la cámara y drene el anticuerpo primario de cada portaobjetos y el tampón de bloqueo del control. Coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y luego lávelos tres veces en 1X PBS durante diez minutos cada uno. Mientras los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo. Para una dilución 1:200, agregue 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mililitros, seguido de cinco microlitros del anticuerpo secundario al mismo tubo. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubarlas durante una hora en una cámara humidificada y protegida de la luz. Cuando suene el temporizador, retire los portaobjetos de la incubadora. Drene el anticuerpo secundario de las secciones. Una vez que se haya extraído el anticuerpo secundario, coloque los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos, protegidos de la luz. Repita este lavado tres veces, usando 1X PBS nuevo para cada lavado. Después de los lavados, agregue dos o tres gotas de medios de montaje que contengan DAPI a cada portaobjetos y coloque un cubreobjetos de vidrio sobre las muestras. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche en un lugar oscuro antes de obtener imágenes de las secciones con un telescopio fluorescente.

Durante la obtención de imágenes, los detalles de la captura de imágenes dependerán del microscopio específico y del software disponible. Sin embargo, en este ejemplo en particular, el software Leica Application Suite, versión 3. 8, se utiliza para realizar el análisis. Con este programa, haga clic en la pestaña Adquirir y, en el modo de adquisición de superposición de imágenes, habilite DAPI y RFP. A continuación, ajuste la exposición, la ganancia y la gamma tanto para DAPI como para RFP, tomando una inicial utilizando la configuración predeterminada definida por el software, y luego optimizando el brillo modificando el tiempo de exposición y la ganancia, teniendo en cuenta que es deseable una configuración óptima mínima para evitar la saturación de la imagen y el fotoblanqueo de las muestras. Gamma se puede modificar para optimizar las áreas más oscuras de una imagen.

Una vez ajustada la configuración, presione el botón Adquirir superposición para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP. Esta imagen de ejemplo, capturada con la técnica demostrada, muestra una sección de tumor mamario de ratón, teñida con el anticuerpo F4/80, que detecta un antígeno, representado en rojo, en macrófagos y otras células mieloides. Dado que se utilizaron medios de montaje que contienen DAPI, los núcleos se muestran en azul. Los datos de las imágenes proporcionarán información sobre la intensidad y la localización de la proteína dentro de la sección de tejido.

Por ejemplo, en la imagen del tumor teñido con F4/80, se observa una tinción de la superficie celular de este antígeno. Estos datos también pueden proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de células teñidas positivamente, que aquí se muestra en rojo, y comparándolo con la población total de células, que se muestra en azul, y calculando la frecuencia utilizando la siguiente ecuación.