Microscopía de Inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado en parafina

La función de una proteína en una célula depende en gran medida de su correcta localización dentro de la célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un método mediante el cual se puede visualizar una proteína dentro de las células utilizando tintes fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es decir, una molécula que absorbe energía luminosa a una longitud de onda específica mediante un proceso llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía a una longitud de onda diferente, lo que se conoce como emisión.

Los tintes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico de la diana y se introducen en células o tejidos cultivados mediante inmunotinción. Cuando este anticuerpo primario se une a la proteína de interés, la proteína se marca con el tinte fluorescente. Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios de proteínas para marcar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de montaje antidecoloración para preservar el marcado de fluorescencia y luego está lista para obtener imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa primero a través de un filtro de excitación, que permite que solo pase la luz en la longitud de onda de excitación. Luego, la luz de excitación llega a un espejo especializado, llamado espejo dicroico o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de onda de excitación hacia una lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita los fluoróforos, que luego emiten la energía luminosa a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la lente del objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite el paso de la luz de emisión. Luego, pasa por un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora llegan al ocular o cámara, donde presentan una imagen ampliada creada a partir de la luz emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de interés dentro de la célula.

Los tintes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunotinción para etiquetar los núcleos como punto de referencia dentro de las células. Se pueden utilizar múltiples fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de las proteínas.

Este video muestra el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una muestra de tejido, seguido de la obtención de imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia.

Antes de comenzar el proceso de tinción, las secciones, que se deshidrataron durante el proceso de incrustación, deben rehidratarse. Para hacer esto, primero, coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en isómeros 100% Xlene. Deje que los portaobjetos se incuben durante tres minutos. Luego, retire los portaobjetos del recipiente, limpie el exceso de xileno con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo, durante tres minutos más. Repita esta incubación cada vez en un recipiente nuevo con xileno fresco y limpie los portaobjetos con toallas de papel antes de transferirlos al nuevo recipiente, para un total de tres incubaciones. A continuación, incube las secciones en una serie de soluciones de etanol graduadas, comenzando con etanol al 100% durante dos minutos. Limpie la rejilla de portaobjetos con una toalla de papel y transfiera los portaobjetos a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros dos minutos. Continúe el ciclo de lavado, limpiando el exceso de etanol con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un nuevo baño, siguiendo las concentraciones de etanol indicadas durante el tiempo especificado. Después del lavado final con etanol, sacuda el exceso de solución e incube los portaobjetos en 1X PBS durante cinco minutos.

Para comenzar el proceso de tinción, primero, encierre las secciones en un círculo con un bolígrafo PAP para identificar el área mínima que deben cubrir los tampones. Una vez que las secciones estén claramente marcadas en el portaobjetos, agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a cada portaobjetos, asegurándose de cubrir toda la superficie de la sección. Después de que los pañuelos estén cubiertos con un tampón de bloqueo, coloque los portaobjetos en una cámara humidificada. Deje incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente.

Después del tiempo de incubación deseado, retire el tampón de bloqueo drenándolo del portaobjetos. A continuación, diluya el anticuerpo primario en tampón de bloqueo. Para una dilución 1:100, agregue 990 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario al mismo tubo. Etiquete un portaobjetos como control y luego agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo. Este control ayudará a identificar cualquier unión no específica del anticuerpo secundario. Ahora, agregue 100 microlitros de tampón de anticuerpos primarios a los portaobjetos restantes. Incubar las secciones durante la noche en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados, en la oscuridad.

Después de la incubación durante la noche, retire las secciones de la cámara y drene el anticuerpo primario de cada portaobjetos y el tampón de bloqueo del control. Coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y luego lávelos tres veces en 1X PBS durante diez minutos cada uno. Mientras los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo. Para una dilución 1:200, agregue 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mililitros, seguido de cinco microlitros del anticuerpo secundario al mismo tubo. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubarlas durante una hora en una cámara humidificada y protegida de la luz. Cuando suene el temporizador, retire los portaobjetos de la incubadora. Drene el anticuerpo secundario de las secciones. Una vez que se haya extraído el anticuerpo secundario, coloque los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos, protegidos de la luz. Repita este lavado tres veces, usando 1X PBS nuevo para cada lavado. Después de los lavados, agregue dos o tres gotas de medios de montaje que contengan DAPI a cada portaobjetos y coloque un cubreobjetos de vidrio sobre las muestras. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche en un lugar oscuro antes de obtener imágenes de las secciones con un telescopio fluorescente.

Durante la obtención de imágenes, los detalles de la captura de imágenes dependerán del microscopio específico y del software disponible. Sin embargo, en este ejemplo en particular, el software Leica Application Suite, versión 3. 8, se utiliza para realizar el análisis. Con este programa, haga clic en la pestaña Adquirir y, en el modo de adquisición de superposición de imágenes, habilite DAPI y RFP. A continuación, ajuste la exposición, la ganancia y la gamma tanto para DAPI como para RFP, tomando una inicial utilizando la configuración predeterminada definida por el software, y luego optimizando el brillo modificando el tiempo de exposición y la ganancia, teniendo en cuenta que es deseable una configuración óptima mínima para evitar la saturación de la imagen y el fotoblanqueo de las muestras. Gamma se puede modificar para optimizar las áreas más oscuras de una imagen.

Una vez ajustada la configuración, presione el botón Adquirir superposición para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP. Esta imagen de ejemplo, capturada con la técnica demostrada, muestra una sección de tumor mamario de ratón, teñida con el anticuerpo F4/80, que detecta un antígeno, representado en rojo, en macrófagos y otras células mieloides. Dado que se utilizaron medios de montaje que contienen DAPI, los núcleos se muestran en azul. Los datos de las imágenes proporcionarán información sobre la intensidad y la localización de la proteína dentro de la sección de tejido.

Por ejemplo, en la imagen del tumor teñido con F4/80, se observa una tinción de la superficie celular de este antígeno. Estos datos también pueden proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de células teñidas positivamente, que aquí se muestra en rojo, y comparándolo con la población total de células, que se muestra en azul, y calculando la frecuencia utilizando la siguiente ecuación.