No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas
17 de abril de 2009
Se describe una modificación DIG In situ Protocolo de hibridación, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas como el abeto rojo. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, el protocolo puede ser utilizado en los estudios de los diferentes tejidos y especies.
Protocolo de hibridación in situ no radiactivo aplicable para el pino silvestre y una amplia gama de especies vegetales. Carre Etal. Hola, mi nombre es AM GaN, y estamos trabajando en la Universidad OBS y en la Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas en Uppsala, Suecia.
Hemos establecido un protocolo de visita a insectos que funciona en varias especies vegetales diferentes. Hoy vamos a mostrarles algunos pasos exigentes. En este protocolo, les mostraremos la inclusión, la sección y los diferentes pasos del experimento real de visita a insectos.
Vamos al laboratorio Uno, fijación e inclusión, pasos del nueve al once del protocolo. Paso nueve, precalentar las placas de Petri y los moldes a 60 grados centígrados. Paso diez, calentar un par de pinzas y distribuir los tejidos uniformemente en un recipiente.
Agregue más parafina para que los tejidos queden cubiertos. Paso 11: deje endurecer la parafina a temperatura ambiente. Dos pasos sexuales 12 a 19 en el protocolo.
Encienda las placas calefactoras y tenga cera histológica derretida disponible. Saque las muestras de la cámara frigorífica. Paso 13, use un escalpelo para cortar cuidadosamente un bloque de cera con tejido.
Dar forma a la pieza para facilitar el corte. Paso 14, caliente el bloque frío y la suela para que se fusionen. Deje que la preparación se endurezca a cuatro grados centígrados.
Paso 15, corte el bloque de parafina en secciones de seis a ocho micrómetros de grosor. Usando un micrótomo, las secciones quedan unidas en una tira larga. Corte la tira y trasládela al papel.
En este momento, es posible examinar las secciones individuales bajo un microscopio estereoscópico para seleccionar las secciones de interés. Será fácil realizar un examen con tejidos teñidos con eosina. Paso 17: coloque agua Milli Q libre de RNasa sobre los portaobjetos.
Corte la cinta en trozos más pequeños y colóquelos sobre los portaobjetos. Lleve los portaobjetos a la placa calefactora. Paso 17, deje que las cintas se aplanen en una placa a 42 grados centígrados durante uno o dos minutos.
Retire el agua utilizando Kim oil. Paso 19, incube los portaobjetos a 42 grados centígrados durante la noche para que los tejidos se adhieran a los portaobjetos en la sección de hibridación in situ 4.1. Pasos de pretratamiento 36 a 48 del protocolo.
Paso 36: deshidratación de secciones en capa histológica. Los portaobjetos se colocan espaciados uniformemente en una gradilla para facilitar el traslado entre diferentes recipientes y deshidratar las secciones. En una serie de etanol, añada anhídrido acético mientras agita vigorosamente.
Paso 45, preparación para el tratamiento con anhídrido acético 4.2 hibridación in situ. Pasos 49 a 52 en un protocolo. Paso 51, envejecimiento de portaobjetos pro uno más.
La solución es viscosa. Intente evitar las burbujas. Incube las laminillas en una cámara húmeda.
4.3 inicio. Después de la hibridación, pasos 53 a 72 del protocolo. Paso 62, incubar las laminillas con el bloque burer en un recipiente de plástico.
Paso 63, agregue suficiente solución bloqueadora solo para cubrir los portaobjetos. Los anticuerpos se añaden a los portaobjetos mediante envejecimiento. El envejecimiento solo funciona con portaobjetos prob bon plus. Para portaobjetos de un diseño similar, paso 65, permita que las fuerzas capilares eleven la solución de anticuerpo anti dig.
Este paso se repite. Paso 70, como antes, en sandwich y aspire la solución azul western. Observe que la solución azul western se aspira dos veces, tal como lo hicimos con la solución de anticuerpo anti dig.
Y paso 65, paso 71 incubar las laminillas en la oscuridad durante uno a cinco días. A temperatura ambiente, la monitorización de las señales de hibridación puede realizarse en un microscopio estereoscópico. Mientras las laminillas aún estén ensambladas, debería ser posible observar manchas de color púrpura a marrón.
Así es como se ven en realidad los resultados del experimento en la estación CW. Puede observar la señal aquí como una tinción púrpura o marronosa.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo modificado de hibridación in situ con DIG que es eficiente y adaptable a diversas especies vegetales, incluyendo el pino de Noruega. El protocolo incorpora ajustes específicos, como cambios en el tratamiento con RNasa y en la concentración de proteinasa K, para mejorar su aplicabilidad en diferentes tejidos y especies.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Biología molecular
- Técnicas de hibridación in situ
Antecedentes
- La hibridación in situ es una técnica valiosa para estudiar la expresión génica en tejidos.
- Los métodos tradicionales pueden ser lentos y específicos de especie.
- Las modificaciones a los protocolos existentes pueden mejorar la eficiencia y la versatilidad.
- Este estudio se centra en un protocolo adecuado para una variedad de especies vegetales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo más rápido y adaptable de hibridación in situ.
- Mostrar la aplicabilidad del protocolo a la pícea de Noruega y otras especies vegetales.
- Proporcionar pasos procedimentales detallados para los investigadores.
Métodos Utilizados
- Inclusión y seccionamiento de tejidos vegetales.
- Pasos de pretratamiento e hibridación para análisis in situ.
- Uso de reactivos específicos y condiciones para optimizar los resultados.
- Monitoreo de las señales de hibridación mediante microscopio.
Resultados principales
- El protocolo modificado facilita con éxito la hibridación in situ en múltiples especies vegetales.
- Los ajustes en el tratamiento con RNasa y la concentración de proteinasa K mejoran la compatibilidad con los tejidos.
- Se logró una visualización clara de las señales de hibridación.
- El protocolo es eficiente y reproducible para diversas aplicaciones.
Conclusiones
- El protocolo modificado de hibridación in situ con DIG es una herramienta valiosa para la investigación vegetal.
- Permite un análisis rápido y eficaz de la expresión génica en diversos tejidos vegetales.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para aplicaciones más amplias en biología vegetal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el análisis de expresión génica espacial de alta resolución en sistemas vegetales, lo que favorece la validación de objetivos en las fases iniciales del descubrimiento mediante la confirmación de patrones de expresión específicos de tejidos. Reduce la dependencia de radioisótopos y de optimizaciones extensas específicas de cada especie, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad para estudios comparativos entre especies. El método aporta valor mecanicista para la reducción de riesgos en cribados fenotípicos y en el descubrimiento de biomarcadores traslacionales en líneas de producción de biofármacos basadas en plantas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Confirma la localización específica de ARNm en tejidos para investigar hipótesis terapéuticas y aclarar la función génica en las vías de desarrollo reproductivo.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la visualización directa de la expresión génica en órganos reproductivos masculinos en modelos de gimnospermas y angiospermas.
- Valor predictivo: Apoya la confianza predictiva al demostrar patrones de expresión conservados de genes homólogos (por ejemplo, homólogos de AP3) en estructuras florales de Arabidopsis, Brassica y pino silvestre.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara secciones de tejido estandarizadas para ensayos de hibridación posteriores con detección de señales consistente utilizando sondas marcadas con DIG.
- Reproducibilidad: Elimina el tratamiento con RNasa y ajusta la concentración de proteinasa K para aumentar la intensidad de la señal y reducir la variabilidad entre especies.
- Escalabilidad: Facilita la aplicación de alto rendimiento en diversas especies vegetales con mínimos ajustes del protocolo, permitiendo la reutilización de la plataforma en genómica comparativa.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Demuestra aplicabilidad desde angiospermas modelo hasta gimnospermas, apoyando la extrapolación de hallazgos a sistemas leñosos perennes relevantes para la producción de biomasa y biopolímeros.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Reduce la ambigüedad en la asignación de funciones génicas al vincular la homología de secuencias con la expresión espacial en estructuras de desarrollo conservadas.
- Alineación de Biomarcadores: Permite la correlación espacial de la expresión génica con rasgos fenotípicos en tejidos reproductivos, facilitando el descubrimiento de biomarcadores en la agricultura molecular vegetal.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro de la fase de biología de descubrimiento, permitiendo la identificación de dianas guiada por hipótesis antes del cribado de compuestos líder en sistemas de expresión basados en plantas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la validación de la expresión espacial de genes candidatos en tejidos específicos y etapas del desarrollo.
- Selección: Genera lecturas espaciales cuantitativas que orientan el diseño de ensayos para el monitoreo del efecto de compuestos en tejidos transgénicos o tratados.
- Análisis: Produce señales cromogénicas detectables (de púrpura a marrón) adecuadas para imágenes y análisis comparativo entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los patrones de expresión génica con fenotipos del desarrollo en órganos reproductivos, apoyando decisiones de avance en las vías de validación de rasgos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y adaptable para el análisis de expresión génica entre especies, reduciendo esfuerzos redundantes de optimización.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco mediante la detección directa y resuelta espacialmente de ARNm, sin riesgos radioactivos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad al eliminar el tratamiento con RNasa y estandarizar el uso de proteinasa K, reduciendo las tasas de fallo del protocolo.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción en la selección de blancos al proporcionar datos de expresión inequívocos en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en patrones de expresión conservados entre especies, mejorando las tasas de éxito en aplicaciones posteriores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, inclusión de tejidos y corte de materiales vegetales.
- Depende del acceso a micrótomos, hornos de hibridación y sistemas de detección cromogénica.
- Necesita la estandarización de la concentración de proteinasa K según la densidad del tejido y el contenido de fenoles.
- Implica la adaptación de los tiempos y temperaturas de incubación para diferentes especies y longitudes de sonda.
- Limitado por la autofluorescencia del tejido y la penetración de compuestos en muestras altamente lignificadas o ricas en metabolitos secundarios.
