Name: No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende hibridación in situ no radiactiva para biología vegetal usando Picea abies y diversas especies. Este protocolo modificado permite visualizar expresión génica en tejidos con alta eficiencia y reproducibilidad.

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Estamos muy agradecidos a Anders Bovin que proporcionó la música para la película y Michael Elliot acciones de voluntariado para ser la voz del altavoz. Se prestó apoyo por Carl Trygger Fundación, los objetivos estratégicos del programa de investigación agrícola de Genómica Funcional (AgriFunGen) de la Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, el Consejo Sueco de Investigación (VR), y el Consejo Sueco de Investigación para el Medio Ambiente, Ciencias Agrícolas, y Ordenación del Territorio (Formas ).

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<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
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</ol>

Dos aspectos de la P. abies protocolo han sido optimizados en comparación con el A. thaliana / B. napus protocolo, RNasa tratamiento y la concentración de proteinasa K. La RNasa elimina las señales de fondo y por lo tanto aumenta la especificidad de la señal 17. El tratamiento con proteinasa K es necesaria para permeabilizar los tejidos por lo que la sonda se puede entrar y se hibridan con la piscina de ARN de interés. La sonda antisentido DAL13 dio una señal de alto, sin RNasa tratamiento (Fig. 3C, E, G) en comparación con las secciones tratadas con RNasa durante 30 minutos (Figura 2 D, F y H). Dado que la RNasa tratamiento no mejoró la señal que fue retirada del protocolo. El tratamiento con proteinasa K se pusieron a prueba a tres concentraciones diferentes: 1, 3 y 5 mg / ml. En el caso de P. abies una señal de baja o no se observó con 1 mg / ml de proteinasa K (Fig. 3C-D). Una señal fuerte se obtuvo con los 3 mg / ml (Fig. 3E-F) y 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasa K. Puesto que no hay diferencia aparente en la intensidad de la señal cuando se encontró con 5 mg / ml de proteinasa K en comparación con 3 mg / ml, se optó por utilizar 3 mg / ml en el protocolo. Es probable que la necesidad de una concentración de proteinasa K más alto en el P. abies conos masculinos en comparación con el A. thaliana y B. yemas florales napus se debe a la mayor cantidad de tejido compacto con altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos. Durante la fijación e inclusión algunas diferencias entre el A. thaliana / B. napus protocolo y la P. abies protocolo son evidentes. El tejido de interés es fijo para proporcionar la retención de ARN y este es un paso crítico ya que los materiales mal fijo podría dar una señal de baja o no detectable a pesar de que el ARNm es muy abundante. El tejido se deshidrata, se aclaró y embebidos en cera en los cambios graduales para evitar daños en los tejidos, y en algunos protocolos de NaCl 0,85% se añade a la de etanol en la deshidratación para evitar aún más la contracción y la hinchazón de las tres células. La etapa de deshidratación durante la incrustación se puede realizar en el hielo para mantener la actividad RNasa como mínimo. En el P. abies protocolo de la solución de paraformaldehído al 4% solución contiene 0,25% de glutaraldehído, que se supone que para dar una mejor retención de ARN de 17 a pesar de que algunos sostienen que es probable que no hacen ninguna diferencia 3. Después de seccionar el material se fija en las diapositivas y los tratados previamente (es decir, desparafinado, rehidratada, permeabilized, tratados para reducir la unión no específica de la sonda y se deshidrata por fin) antes de la hibridación. En el protocolo que aquí se presenta el procedimiento de detección de todo se puede realizar en los laboratorios ordinarios, la señal se desarrolla por lo general dentro de 1-3 días y la relación entre la señal más de fondo continua puede controlarse. El DIG marcado sondas suelen dar una señal más clara, en comparación con sondas marcadas radiactivos, son más estables y pueden ser reutilizados en experimentos consecutivos. Por otro lado, la sensibilidad se reduce en comparación con sondas radiactivas 17. Hibridación in situ detecta expresión utilizando una sonda marcada específica para un determinado ARNm. Radio-etiquetado es un método de etiquetado robusta y sensible, pero requiere de un manejo de la radiactividad y toma varias semanas antes de que los resultados pueden ser detectados. Antígeno marcado con sondas por el contrario, son más estables, menos peligrosos y requieren de la exposición al medio de la detección de un par de días sólo 17 años. Por lo tanto, el etiquetado de antígeno métodos son actualmente dominantes. El paso más importante independientemente del protocolo es el diseño de la sonda. Se debe tener cuidado para asegurarse de que la sonda tiene una alta especificidad y se etiqueta con UTPs de alta calidad. A veces la temperatura de hibridación y / o la longitud de la reacción tiene que ser ajustado para las sondas específicas. Nuestro protocolo modificado sobre la base de la etiqueta DIG-sondas facilitará la localización de la expresión del ARNm de manera simultánea en las especies que van desde A. thaliana a P. abies, y que con algunos ajustes menores pueda utilizarse en otras especies vegetales. El protocolo, además de los conos masculinos, también ha sido probado en diferentes etapas de brotes vegetativos y en ambos cigóticos y somáticos de P. abies, con buenos resultados (resultados no publicados;. Karlgren et al).

<table><tbody><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>mínimo 98%</td></tr><tr><td>Acrylamida, lineal</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-DIG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 o 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>mínimo 98%</td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de Denhardt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, diethylpirocarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de marcado de ARN con DIG (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicógeno</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>Puede utilizar Tissue-clear, Histoclear II, xileno o un producto similar al incluir su tejido.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>Se puede usar Histowax o Paraplast para la inclusión.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>Se puede usar Histowax o Paraplast para la inclusión.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidility DNA Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminillas Probe-on Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>Puede utilizar Tissue-clear, Histoclear II, xileno o un producto similar al incluir su tejido.</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>mínimo 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>use su producto estándar en el laboratorio</td><td></td><td>Utilice uno o ambos, Triton X-100 y Tween-20.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>use su producto estándar en el laboratorio</td><td></td><td>Utilice uno o ambos, Triton X-100 y Tween-20.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

no radiactivo in situ la hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Las tecnologías de la expresión de alto rendimiento de análisis disponibles en la actualidad a los científicos un desbordamiento de perfiles de expresión, pero su solución en términos de expresión específica de tejido es limitado debido a problemas en la disección de los distintos tejidos. Los datos de expresión tiene que ser confirmada y completada con los patrones de expresión utilizando por ejemplo la hibridación in situ, una técnica utilizada para localizar la expresión de ARNm de células específicas. El método de hibridación in situ es laboriosa, consume tiempo y requiere a menudo una amplia optimización dependiendo de la especie y el tejido. En experimentos in situ son relativamente más difíciles de realizar en las especies leñosas, como el abeto de coníferas de Noruega (Picea abies). Aquí les presentamos una modificación en el protocolo DIG hibridación in situ, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas incluyendo P. abies. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, se podría utilizar el protocolo de estudio de la expresión específica de tejido de genes homólogos en los órganos reproductivos masculinos de una gimnospermas y dos especies de angiospermas, P. abies, Arabidopsis thaliana y Brassica napus. El protocolo funcionó igual de bien para las especies y los genes estudiados. AtAP3 y BnAP3 se observaron en el segundo y tercer verticilo órganos florales en A. thaliana y B. napus y DAL13 en microsporophylls de conos masculinos de P. abies. Por P. abies la concentración de proteinasa K, que se utiliza para permeablize los tejidos, tuvo que ser aumentada a 3 g / ml en lugar de 1 g / ml, posiblemente debido a los tejidos más compactos y más altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos. Para todas las especies el tratamiento RNasa fue retirado debido a la reducida fuerza de la señal sin el correspondiente aumento de la especificidad. Al comparar los patrones de tejidos específicos de la expresión de genes homólogos de las plantas con flores como de un árbol de coníferas nos demuestran que la DIG en el protocolo situ que aquí se presenta, con sólo pequeños ajustes, se puede aplicar a una amplia gama de especies de plantas. Por lo tanto, el protocolo evita tanto la optimización de las especies extensa específicos y el uso de sondas laborioso marcado radiactivamente a favor de las sondas DIG etiquetados. Hemos elegido para ilustrar los pasos técnicamente exigentes del protocolo en nuestra película. Anna Karlgren y Carlsson Jenny contribuyeron igualmente a este estudio. Con los autores: Anna Karlgren en Anna.Karlgren @ ebc.uu.se y Sundström Jens F. en Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Se describe una modificación DIG<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridación, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas como el abeto rojo. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, el protocolo puede ser utilizado en los estudios de los diferentes tejidos y especies.

No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas

Las tecnologías de análisis de expresión de alto rendimiento disponibles hoy en día proporcionan a los científicos un exceso de perfiles de expresión, pero su resolución en términos de...

Protocolo de hibridación in situ no radiactivo aplicable para el pino silvestre y una amplia gama de especies vegetales. Carre Etal. Hola, mi nombre es AM GaN, y estamos trabajando en la Universidad OBS y en la Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas en Uppsala, Suecia.Hemos establecido un protocolo de visita a insectos que funciona en varias especies vegetales diferentes. Hoy vamos a mostrarles algunos pasos exigentes. En este protocolo, les mostraremos la inclusión, la sección y los diferentes pasos del experimento real de visita a insectos.Vamos al laboratorio Uno, fijación e inclusión, pasos del nueve al once del protocolo. Paso nueve, precalentar las placas de Petri y los moldes a 60 grados centígrados. Paso diez, calentar un par de pinzas y distribuir los tejidos uniformemente en un recipiente.Agregue más parafina para que los tejidos queden cubiertos. Paso 11: deje endurecer la parafina a temperatura ambiente. Dos pasos sexuales 12 a 19 en el protocolo.Encienda las placas calefactoras y tenga cera histológica derretida disponible. Saque las muestras de la cámara frigorífica. Paso 13, use un escalpelo para cortar cuidadosamente un bloque de cera con tejido.Dar forma a la pieza para facilitar el corte. Paso 14, caliente el bloque frío y la suela para que se fusionen. Deje que la preparación se endurezca a cuatro grados centígrados.Paso 15, corte el bloque de parafina en secciones de seis a ocho micrómetros de grosor. Usando un micrótomo, las secciones quedan unidas en una tira larga. Corte la tira y trasládela al papel.En este momento, es posible examinar las secciones individuales bajo un microscopio estereoscópico para seleccionar las secciones de interés. Será fácil realizar un examen con tejidos teñidos con eosina. Paso 17: coloque agua Milli Q libre de RNasa sobre los portaobjetos.Corte la cinta en trozos más pequeños y colóquelos sobre los portaobjetos. Lleve los portaobjetos a la placa calefactora. Paso 17, deje que las cintas se aplanen en una placa a 42 grados centígrados durante uno o dos minutos.Retire el agua utilizando Kim oil. Paso 19, incube los portaobjetos a 42 grados centígrados durante la noche para que los tejidos se adhieran a los portaobjetos en la sección de hibridación in situ 4.1. Pasos de pretratamiento 36 a 48 del protocolo.Paso 36: deshidratación de secciones en capa histológica. Los portaobjetos se colocan espaciados uniformemente en una gradilla para facilitar el traslado entre diferentes recipientes y deshidratar las secciones. En una serie de etanol, añada anhídrido acético mientras agita vigorosamente.Paso 45, preparación para el tratamiento con anhídrido acético 4.2 hibridación in situ. Pasos 49 a 52 en un protocolo. Paso 51, envejecimiento de portaobjetos pro uno más.La solución es viscosa. Intente evitar las burbujas. Incube las laminillas en una cámara húmeda.4.3 inicio. Después de la hibridación, pasos 53 a 72 del protocolo. Paso 62, incubar las laminillas con el bloque burer en un recipiente de plástico.Paso 63, agregue suficiente solución bloqueadora solo para cubrir los portaobjetos. Los anticuerpos se añaden a los portaobjetos mediante envejecimiento. El envejecimiento solo funciona con portaobjetos prob bon plus. Para portaobjetos de un diseño similar, paso 65, permita que las fuerzas capilares eleven la solución de anticuerpo anti dig.Este paso se repite. Paso 70, como antes, en sandwich y aspire la solución azul western. Observe que la solución azul western se aspira dos veces, tal como lo hicimos con la solución de anticuerpo anti dig.Y paso 65, paso 71 incubar las laminillas en la oscuridad durante uno a cinco días. A temperatura ambiente, la monitorización de las señales de hibridación puede realizarse en un microscopio estereoscópico. Mientras las laminillas aún estén ensambladas, debería ser posible observar manchas de color púrpura a marrón.Así es como se ven en realidad los resultados del experimento en la estación CW. Puede observar la señal aquí como una tinción púrpura o marronosa.

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

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Investigación

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Biología

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Este protocolo presenta un flujo de trabajo eficiente para la microscopía de localización de moléculas individuales de núcleos aislados de Arabidopsis, utilizando aislamiento, fijación y marcaje optimizados para lograr una visualización nanométrica fiable de la cromatina y la ARN polimerasa II. Este enfoque puede adaptarse fácilmente a otras proteínas asociadas a la cromatina o modificaciones de histonas para imágenes de alta resolución.

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