Name: Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende el marcaje fluorescente de estructuras cardíacas en Drosophila melanogaster para análisis morfológico mediante microscopía confocal. Este protocolo permite visualizar con detalle la anatomía del corazón en larvas y adultos.

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Los autores agradecen SI Bernstein (San Diego State University) para la lectura crítica y sugerencias relativas a la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH para SI Bernstein, SDSU, y R. Bodmer, BIMR, y por una beca post-doctoral de la Filial Oeste de los Estados de la Asociación Americana del Corazón para G. Vogler y A. Cammarato.

Antes de empezar <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ol class="lalpha"><li> buffer relajante (artificial hemolinfa Drosophila (ADH) (véase &quot;Visualización de los latidos del corazón en Drosophila&quot;) que contiene 10 mM EGTA) </li><li> fijador (formaldehído al 4% en PBS 1x) </li><li> PBSTx (PBS con 0,1% Triton-X-100) </li><li> Convenientemente diluida primaria y especies específicas de la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos en PBSTx </li></ol></li><li> Diseccionar Drosophila para exponer los tubos cardíacos (de moscas adultas y / o larvas), tras <ol class="lalpha"><li> la semi-intacta corazón Drosophila preparación del protocolo de &quot;visualizar el corazón latiendo en Drosophila&quot;, o </li><li> Drosophila larval NMJ disección 1 del protocolo con las siguientes modificaciones: Use oxigenada ADH durante la disección de larvas y desplazar el pasador posterior ligeramente de la línea media ventral. Las larvas se cortan a lo largo de la línea media ventral. No remover el tejido antes de la fijación. </li></ol></li></ol> La tinción fluorescente <ol><li> Compruebe que todos los corazones están latiendo en rítmicamente oxigenada ADH. Colocar inmediatamente ADH con relajantes buffer. Examine cada tubo cardíaco para asegurar las contracciones se inhiben. </li><li> Fijar los corazones mediante la sustitución de la memoria intermedia de relax con fijador. Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave. (Para agitar la preparación de las larvas no es necesario en cualquier etapa, y puede ser considerado perjudicial para la integridad del tejido cardíaco). </li><li> Lávese las muestras tres veces durante diez minutos con PBSTx a temperatura ambiente con agitación continua. </li><li> Para los adultos, cuidadosamente Recorte los bordes de la cutícula ventral abdominal, que lo que queda es más elíptica y menos redondeada. Además, con un solo corte entre el abdomen y el tórax, cuidadosa y limpiamente separar ambos segmentos del cuerpo y asegurar el mínimo daño a la región anterior del corazón. Por los corazones de larvas, retire con cuidado la grasa corporal utilizando unas pinzas finas. La eliminación de grasa deben ser ejecutados con extrema precaución, ya que el corazón de larvas es muy frágil y tiene muy poco apoyo de otros músculos o del tejido conectivo. No quite las ramas traqueal, ya que puede dañar el corazón. </li><li> Transferencia de la región dorsal recortada de la cutícula abdominal por los bordes, evitando el contacto con el tubo situado en el centro cardíaco, en una placa de 96 pocillos con pozos que contienen desde 50 hasta 100 l de anticuerpo primario diluido en PBSTx. Por no más de 12 muestras por pozo. Incube a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación continua. Incubación también se puede hacer durante la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo primario. Lavar el corazón tres veces durante diez minutos con 100 PBSTx l a temperatura ambiente con agitación continua. </li><li> Tras la retirada del tampón de lavado final, añadir 100 ml de anticuerpo secundario en PBSTx, complementado con Alexa594-phalloidin (1:1000). Incubar durante una hora con agitación continua a temperatura ambiente. Mantener las muestras cubiertas para evitar fluoróforo blanqueo. </li><li> Después de la incubación secundaria, lavar el corazón tres veces durante diez minutos con 100 l de PBSTx a temperatura ambiente con agitación continua. Mantener las muestras cubiertas a lo largo de las etapas de lavado. </li><li> Para la eliminación de Triton-X-100, aclare el corazón por última vez en 100 l de PBS durante 10 minutos. Las muestras se pueden almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante varios días antes del montaje. </li></ol> Montaje de los corazones de adultos <ol><li> Se adhieren dos de 18 x 18 mm cubreobjetos a un portaobjetos de microscopio con 10 l de medio Vectashield montaje. Los cubreobjetos se deben espaciar ~ 10-15 mm. Coloque una pequeña gota de tercero medio de montaje en entre los dos cubreobjetos. </li><li> Ponga 20 l de Vectashield en el centro de un cubre terceros. </li><li> Retire con cuidado cada uno de los corazones de la solución de lavado PBS por los bordes extremos de la cutícula, y suavemente coloque su corazón hacia abajo sobre la gota de medio de montaje sobre el cubreobjetos terceros. Por no más de cinco corazones por gota sobre el cubreobjetos. </li><li> Compruebe bajo un microscopio para asegurar que todos los corazones están mirando hacia abajo. </li><li> Con cuidado, invertir el cubreobjetos que contiene el corazón y la rapidez con que el lugar de la diapositiva que contiene el par de cubreobjetos de tal manera que la gota con fusibles tubos cardíaco con la gota Vectashield entre los dos cubreobjetos. Un &quot;puente&quot; debe ser formado por el cubreobjetos. Los corazones serán suspendidos entre un cubreobjetos y portaobjetos de microscopio. </li><li> Compruebe bajo un microscopio para asegurarse de que los corazones están mirando hacia arriba. </li><li> Fix cubreobjetos en sus bordes con esmalte de uñas. </li><li> El corazón está listo para ser fotografiado por fluorescentes o de cmicroscopía onfocal. </li></ol> Montaje de los corazones de larvas <ol><li> Coloque una gota (aproximadamente 20 l) Vectashield en un portaobjetos de microscopio. </li><li> Cuidado de transferencia de hasta dos muestras de larvas en el Vectashield y orientarlos lado dorsal por el uso de agujas de tungsteno. </li><li> Individualmente arrastrar las muestras de medio de montaje y de alinear cada en paralelo. </li><li> Coloque un cubreobjetos en lados opuestos de la muestra. Con unas pinzas, coloque un cubreobjetos tercera en la parte superior, por primera vez por un lado, por la que se sobre el cubreobjetos posterior y bajándola hasta el cubreobjetos anterior, formando así un puente. Las fuerzas capilares causará un flujo de Vectashield de posterior a anterior, que ayuda a la correcta alineación del corazón larval. </li><li> Arreglar todos los cubreobjetos en su lugar, en sus bordes, con esmalte de uñas y cuidado rellenar el espacio entre los cubreobjetos Vectashield con 20-30 l. </li><li> Sellar con esmalte de uñas y se almacenan a 4 ° C, o para almacenamiento a largo plazo a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Cuando se ejecuta correctamente, todos los componentes y los tejidos del vaso dorsal deben permanecer intactos y se visualiza fácilmente. La fluorescencia de fondo debe ser mínimo. Para los adultos, el ventral manchas longitudinales capa muscular muy bien y produce una señal importante (Figura 1 y Figura 2). Los cardiomiocitos circular subyacente sin embargo, tienden a no producir una señal tan intenso como el de la capa que recubre ventral. Los miocitos de la anterior &quot;cámara cónica&quot; del corazón adulto contienen una cantidad considerable de material contráctil y, en consecuencia, esta región aparece como la relación más sólida con el resto del tubo cardíaco. El corazón de larvas muestra una espiral arreglo miofibrilar similar a la de los cardiomiocitos adultos contráctil (Figura 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Figura 1a" border="0" /></a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Figura 1b" /></a> Figura 1: Inicio. Una micrografía fluorescente que muestra todo el tubo cardíaco de un adulto Drosophila melanogaster, que expresa la miosina-GFP. La imagen fue tomada con un microscopio Zeiss Imager Z1 fluorescentes equipados con un módulo ApoTome deslizamiento. Miosina-GFP se muestra en verde, la actina se tiñe con AlexaFluor phalloidin ® 594 (roja) y α-actinina se etiqueta con anti-α-actinina anticuerpos (azul). Tenga en cuenta el procedimiento de preparación permite la recuperación de las muestras de corazón con estructuras bien conservadas. CC = cónica cámara; AM = músculo Alary, V = válvula interna; VLL = capa muscular longitudinal ventral. Parte inferior. Una región de la trompa de un adulto cardiaca de la CC a través del segmento abdominal tercero del corazón justo debajo de la capa ventral longitudinal que muestra la disposición de las miofibrillas en espiral de los cardiomiocitos contráctiles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /></a> Figura 2: Representante confocal pilas de una porción anterior del corazón adulto teñidas con phalloidin AlexaFluor ® 594 (rojo) y un anti-Pericardin (colágeno tipo IV) (verde) de anticuerpos. Pericardin se asocia con el corazón a lo largo de la superficie ventral, probablemente procedentes de las miofibrillas orientadas longitudinalmente de la capa muscular ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" /></a> Figura 3: Una micrografía fluorescente del segmento A7 del corazón propio de una etapa de tres larvas de Drosophila. La imagen fue tomada con un microscopio Zeiss Imager Z1 fluorescentes equipados con un módulo ApoTome deslizamiento. Actina se etiqueta con AlexaFluor phalloidin ® 594 (verde) y α-actinina se tiñeron con anti-α-actinina anticuerpos (rojo).

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
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<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Aquí se presenta un protocolo útil para la preparación y la tinción de la embarcación Drosophila melanogaster dorsal y los tejidos a través de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal o. Ofrecemos un relato conciso de los pasos y refinado por empleado comúnmente en nuestro laboratorio para la tinción de efectivo que permita bien resueltos en las imágenes in situ de las larvas y adultos tubos corazón Drosophila. Otros han descrito métodos similares en forma abreviada 2, 3...

<table><tbody><tr><td>Ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacético (EGTA)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído, 10%, libre de metanol, ultrapuro</td><td>Reactivo</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 faloídicina</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield&amp;#174; para fluorescencia con DAPI</td><td>Reactivo</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de tungsteno</td><td>Reactivo</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Portaalfileres</td><td>Reactivo</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

marcaje fluorescente de drosophila estructuras del corazón

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

La<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Vaso dorsal, o el corazón, es una estructura tubular que consta de una sola capa de cardiomiocitos contráctiles, células pericárdicas que se alinean a lo largo de cada lado de la pared del corazón, los músculos de apoyo Alary y, en adultos, una capa de células de músculo longitudinal ventral. La casa de las fibras contráctiles conservan los componentes de la citoarquitectura músculos incluidos los paquetes compactos de las miofibrillas y complejos de proteínas del citoesqueleto / submembranous, que interactúan con homólogos de los componentes de la matriz extracelular. Aquí se describe un protocolo para la fijación y el marcaje fluorescente de elementos particulares de miocardio del corazón de las larvas y adultos disecados semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt;. En concreto, se demuestra el etiquetado de los sarcoméricas F-actina y α-actinina en el corazón de las larvas. Además, llevamos a cabo el etiquetado de los F-actina y α-actinina en la miosina-GFP expresando las moscas adultas y de la α-actinina y pericardin, un colágeno tipo IV de la matriz extracelular, en el medio silvestre corazones de tipo adulto. Se presta especial atención a una estrategia de fijación de los corazones de adultos semi-intacta que minimiza el manejo y optimiza la oportunidad de mantener la integridad de los tubos cardíacos y los tejidos asociados. Estas preparaciones son adecuadas para las imágenes a través de microscopía de fluorescencia y confocal. En general, este procedimiento permite realizar un análisis cuidadoso y detallado de las características estructurales del corazón de un potente sistema genético modelo manejable.

Aquí se describe un protocolo básico para el marcaje fluorescente de diferentes elementos de los tubos de corazón de la larva y el adulto<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Estas muestras son adecuadas para las imágenes a través de microscopía de fluorescencia confocal o. Esta técnica permite el análisis estructural detallado de las características de los corazones de un organismo modelo de gran alcance.

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

El vaso dorsal de *Drosophila melanogaster*, o corazón, es una estructura tubular compuesta por una sola capa de cardiomiocitos contráctiles, células pericárdicas...

Hola, soy Nikita Ari del Laboratorio de Ralph Boer en el programa de Desarrollo y Envejecimiento del Instituto Burnham para la Investigación Médica. También soy Gil ler del laboratorio inferior. Hoy les mostraremos los procedimientos para la marcación fluorescente de estructuras cardíacas larvarias y adultas de Presolar.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para preparar los tubos cardíacos para análisis morfológico y estructural mediante microscopía confocal o microscopía fluorescente, con el fin de marcar fluorescentemente las estructuras cardíacas en Drosophila adulta. Primero, realice un corte único entre el tórax y el abdomen en un adulto semientero para separar los segmentos corporales. Luego, recorte los bordes ventrales sobresalientes de la cutícula del adulto.A continuación, transfiera y etiquete especímenes adultos o larvas diseccionadas con anticuerpos primarios y secundarios. Después del etiquetado, monte los especímenes adultos lavados sosteniendo los bordes de la cutícula y colocándolos con el lado del corazón hacia abajo sobre una gota de vector shield en un cubreobjetos; invierta el cubreobjetos sobre una gota de medio flanqueada por dos cubreobjetos en una portaobjetos para formar un puente. Con los corazones ahora suspendidos en posición vertical para el montaje de corazones larvales.Transfiera los especímenes a un portaobjetos con las caras ventrales hacia abajo y monte dos cubreobjetos a cada lado del portaobjetos. Finalmente, forme un puente con un tercer cubreobjetos colocándolo primero sobre el cubreobjetos cercano a los extremos posteriores de las larvas. Los corazones ya están listos para la obtención de imágenes.Antes de comenzar este procedimiento, prepare el siguiente tampón relajante A DH que contiene A DH como se describe en otro protocolo de video de esta serie, con un fijador compuesto por 10 milimolar de EGTA y 4% de formaldehído en P B S 1X-P B S, TX, así como anticuerpos primarios adecuadamente diluidos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. En P B S TX, diseque drosófilas adultas y larvas de drosófila para exponer los tubos cardíacos siguiendo la preparación del corazón de drosófila semientero mostrada en los protocolos de video que visualizan el corazón latiendo en drosófila y el protocolo de disección de la NMJ larval de drosófila. Con modificaciones, utilice A DH oxigenado durante el disección de larvas y desplace ligeramente las agujas posteriores desde la línea media ventral de la larva.Corte a lo largo de la línea media ventral. No elimine ningún tejido antes de la fijación en los siguientes pasos. Comience el procedimiento de etiquetado verificando bajo un microscopio que todos los corazones estén contrayéndose y relajándose rítmicamente en una ADH oxigenada. Luego, reemplace rápidamente la ADH con tampón relajante y vuelva a examinar cada tubo cardíaco para asegurarse de que las contracciones estén inhibidas.Proceda a fijar los corazones sustituyendo el tampón relajante por fijador. Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave. Tenga en cuenta que para preparaciones larvarias, la agitación no es necesaria en ninguna etapa y podría incluso ser perjudicial para la integridad del tejido cardíaco.Al finalizar los 20 minutos, retire el fijador y lave los especímenes tres veces durante 10 minutos cada vez con P-B-S-T-X. A temperatura ambiente y con agitación continua para los adultos, realice un corte único entre el abdomen y el tórax cuidadosa y limpiamente. Separe ambos segmentos corporales para asegurar un daño mínimo a la región anterior del corazón.Tenga cuidado de no cortar la sección abdominal anterior donde se encuentra la cámara cónica del corazón. Examine la muestra bajo el microscopio para asegurarse de que se haya realizado un corte limpio. A continuación, recorte cuidadosamente los bordes ventrales sobresalientes de la cutícula abdominal, de modo que lo que quede sea más elíptico y menos redondeado.Para corazones de larvas, utilice pinzas finas para retirar cuidadosamente el cuerpo graso. Realice este paso con extrema precaución. Dado que el corazón larval es especialmente frágil y tiene muy poco soporte de otros músculos o tejido conectivo, no retire las ramas traqueales, ya que esto podría dañar el corazón.A continuación, incubar con el anticuerpo primario, que se diluye en PVS TX y se dispensa a 50 microlitros por pocillo de una placa de 96 pocillos. Para moscas adultas, sostenga la cutícula dorsal recortada por los bordes sin tocar el tubo cardíaco ubicado en el centro y transfiérala a la placa. Coloque no más de 12 especímenes por pocillo e incube a temperatura ambiente durante dos horas con agitación continua.Sujete los especímenes larvales por el borde utilizando pinzas y transfiéralos a un pocillo lleno de P-B-S-T-X. Nuevamente, no agite los especímenes larvales al final de la incubación. Retire la solución del anticuerpo primario.Lave los corazones tres veces durante 10 minutos cada vez con 100 microlitros de P-B-S-T-X a temperatura ambiente después del último lavado con 100 microlitros del anticuerpo secundario en PBS tx suplementado con Alexa 5 9 4 Phin. Mantenga las muestras cubiertas para prevenir el blanqueo del fluoro a partir de ahora e incube durante una hora a temperatura ambiente. Retire la solución de anticuerpo secundario y lave los corazones tres veces durante 10 minutos cada vez con 100 microlitros de P-B-S-T-X a temperatura ambiente.Finalmente, elimine el TRITTON X 100 lavando los corazones con 100 microlitros de PBS durante 10 minutos. Los especímenes pueden almacenarse en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante varios días antes del montaje. Primero, prepare el portaobjetos para el montaje.Aplique tres gotas de 10 microlitros de medio de montaje vectorial espaciadas uniformemente sobre un portaobjetos para microscopio. Coloque dos cubreobjetos de 18 por 18 milímetros sobre las gotas exteriores, manteniendo los cubreobjetos a unos 10 a 15 milímetros de distancia entre sí.Además, coloque 20 microlitros de vector shield en el centro de un tercer cubreobjetos. A continuación, sostenga la mosca adulta diseccionada por los bordes extremos del exoesqueleto. Para retirarla cuidadosamente de la solución de lavado PVS, colóquela suavemente con el lado del corazón hacia abajo sobre la gota de medio de montaje en el tercer cubreobjetos, no más de cinco corazones por gota en el cubreobjetos.Después de colocar los corazones sobre la gota, que está sobre la laminilla, revise al microscopio para asegurarse de que todos los corazones estén orientados hacia abajo. Ahora invierta cuidadosamente la laminilla con los corazones y colóquela rápidamente sobre la portaobjetos que sostiene el par de laminillas, de modo que la gota de la laminilla invertida que contiene los tubos cardíacos se fusione con la gota del escudo vectorial que reposa en el espacio entre las laminillas. Al emparejar de esta manera, las tres laminillas forman un puente.Los corazones se suspenderán entre la cubreobjetos central y el microscopio. Deslice debajo del puente y verifique bajo el microscopio que los corazones de las moscas adultas estén ahora orientados hacia arriba utilizando esmalte de uñas. Fije las cubreobjetos en sus bordes.Los corazones ya están listos para ser observados mediante microscopía fluorescente o confocal. Para montar los corazones de larvas, coloque una gota de aproximadamente 20 microlitros de BTA shield sobre un portaobjetos utilizando pinzas finas. Sujete las larvas por los bordes de la cutícula y transfiéralas cuidadosamente a la gota.Oriente las larvas con el lado dorsal hacia abajo utilizando agujas de tungsteno. Coloque hasta dos larvas en un portaobjetos. A continuación, arrastre cada espécimen fuera del medio de montaje y alinee las larvas en paralelo.Coloque un cubreobjetos a cada lado de los corazones alineados utilizando pinzas. Coloque un tercer cubreobjetos encima, primero apoyando un lado sobre el cubreobjetos frontal y bajándolo luego hasta el cubreobjetos trasero. De este modo se forma un puente.Las fuerzas capilares provocarán un flujo del escudo vectorial desde la parte trasera hacia la delantera, lo cual ayuda al alineamiento adecuado del corazón larval. Finalmente, fije todas las laminillas en su lugar por los bordes con esmalte de uñas y llene cuidadosamente el espacio entre las laminillas con 20 a 30 microlitros de escudo vectorial, selle con esmalte de uñas y almacene a cuatro grados Celsius para conservación a corto plazo o a menos 20 grados Celsius por un período más prolongado. Cuando se realiza correctamente, todos los componentes y tejidos asociados del vaso dorsal deben permanecer intactos y ser fácilmente visualizables.La fluorescencia de fondo debe ser mínima en adultos. La capa muscular longitudinal ventral se tiñe muy bien y produce una señal considerable. Las cardiomiocitos circulares subyacentes, sin embargo, tienden a no producir una señal tan intensa como la que proviene de la capa ventral superficial.Los miocitos de la cámara cónica anterior del corazón adulto contienen una cantidad considerable de material contráctil, y por consiguiente, esta región aparece como la más robusta en comparación con el resto del tubo cardíaco. La imagen del corazón larval muestra una disposición espiral de los miofibrillas. Similar a la de los cardiomiocitos contráctiles del adulto, acabamos de mostrar su protocolo para la preparación y tinción de corazones ovulares para microscopía fluorescente y confocal.Al realizar este procedimiento, es importante recordar limitar cualquier manipulación innecesaria. Esto garantizará una estructura cardíaca más intacta y conservada. Este protocolo solo sirve como punto de partida.Como con cualquier otra inmunohistoquímica, diferentes anticuerpos requieren diferentes condiciones y deben optimizarse individualmente. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus tinciones.

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Investigación

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Biología

Técnica necesaria para la visualización de los latidos del corazón en adultos y...

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

Se describe un proceso para la fijación, inclusión, corte, y las imágenes de la etapa...

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

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Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

El protocolo de imágenes de fluorescencia y seccionamiento cardíaco de Drosophila simplifica el estudio de la estructura y las patologías del corazón. Este enfoque implica secciones, tinciones e imágenes sencillas, sin pasar por la experiencia técnica necesaria para la disección tradicional. Mejora la accesibilidad, lo que convierte a Drosophila en un modelo más ampliamente utilizable para la investigación relacionada con el corazón dentro de la comunidad científica en general.

Método novedoso y eficiente para la tinción de fluorescencia cardíaca de Drosophila con criosección

Aprende el marcaje fluorescente de estructuras cardíacas en Drosophila melanogaster para análisis morfológico mediante microscopía confocal. Este protocolo permite visualizar con detalle la anatomía del corazón en larvas y adultos.

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

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