Name: ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a detectar tricotecenos en muestras de alimentos mediante el método ELIME con detección electroquímica. Este protocolo competitivo ofrece alta sensibilidad y especificidad para el análisis de micotoxinas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Nancy Downer y todos los miembros del laboratorio de Química Analítica de la Universidad de Roma &quot;Tor Vergata&quot; por su colaboración y apoyo logístico. Este trabajo fue apoyado por el proyecto de la UE &quot;BioCop&quot;.

1) El bloqueo de perlas magnéticas recubiertas con: Proceder de la siguiente manera para bloquear perlas magnéticas recubiertas con: <ol><li> Preparar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf; </li><li> Homogeneizar (temblores, pero no agitación) de perlas magnéticas recubiertas (véase el apéndice para la preparación de perlas magnéticas recubiertas) con la muestra de rotación del mezclador; </li><li> Inmediatamente después de la homogeneización, pipeta de 10 l de perlas magnéticas recubiertas por separado en cada uno de los tubos Eppendorf; </li><li> Añadir 1 ml de leche desnatada solución de bloqueo en cada tubo Eppendorf de la serie; </li><li> Vamos a perlas magnéticas se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en el mezclador de rotación de la muestra; </li><li> Retire la solución de bloqueo: para ello se coloca el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo); pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando cuentas sin perturbaciones; </li><li> Añadir 1 ml de tampón PBS + NaN3 + BSA como solución de almacenamiento para cada tubo; </li><li> Tienda recubierto y bloquearon las bolas magnéticas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C); </li></ol> 2) la cadena inmunológica en partículas magnéticas para la construcción de la curva de calibración y análisis de las muestras Proceder de la siguiente manera para que las bolas magnéticas listo para la medición: <ol><li> Tome un tubo de Eppendorf (2 ml) de solución de cubierta y bloqueada por cada extracto de muestra que se va a analizar; </li><li> Tomar un extra de tubo de Eppendorf para cada solución calibrador de trabajo; </li><li> Homogeneizar las bolas magnéticas durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra antes de su uso; </li><li> Retire el líquido de almacenamiento mediante concentrador de partículas magnéticas; </li><li> Lávese las partículas magnéticas tres veces con solución de lavado PBS / BSA. Eliminar líquido de lavado; </li><li> Paso la competencia: Añadir a cada tubo que contiene las cuentas de lavado magnético, 200μl de la muestra de extracto preparado, el uso de un tubo de cuentas magnéticas para cada muestra. Repita el mismo procedimiento para cada solución estándar. Añadir 200 l de solución de anticuerpos monoclonales para cada tubo de cuentas magnéticas. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente; </li><li> Eliminar de los tubos Eppendorf la solución utilizada para la competición a paso; </li><li> Etiquetado paso: Añadir 400μl del anticuerpo secundario marcado a cada tubo de bolas magnéticas Eppendorf. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente; </li><li> Quitar el etiquetado de los tubos Eppendorf solución; </li><li> Lávese las partículas magnéticas tres veces con PBS / Tween ® 20 solución de lavado. Eliminar el líquido; </li><li> Resuspender con 100μl de buffer DEA cada alícuota de partículas magnéticas. Ahora las bolas magnéticas están listos para la etapa de medición electroquímica; </li></ol> 3) El conjunto de PalmSens con el multiplexor (MUX) opciones Tenga en cuenta: el producto enzimático de hidrólisis del sustrato faltas la superficie del electrodo, por este motivo un nuevo electrodo que se necesita para cada medición. <ol><li> Conectar un PC portátil a PalmSens a través del cable de serie; </li><li> Conecte el conector de 9-DIN de CH8 multiplexor con PalmSens. </li><li> Conecte el cable de serie de ocho canales Mux contacto eléctrico con CH8 multiplexor; </li><li> Coloque la tira de electrodos en el bloque de imán ocho. Preste atención para que cada imán debajo de cada electrodo de trabajo (de la nota, la necesidad de un solo imán para cada electrodo es imprescindible lo contrario, la partícula magnética no se concentrará en el área del electrodo de trabajo); </li><li> Conecte la tira de electrodos en ocho canales de contacto eléctrico Mux; </li></ol> Para la medición de la DPV utilizar los siguientes parámetros en las casillas correspondientes: E comenzar: 0 (V); final E: 0,6 (V); paso E: 0.016 (V); E pulso: 0,0339 (V); E acondicionado: 0 (V), deposición de E: 0 (V); Velocidad de lectura : 0,1 (V / s); T pulso: 0,06 (s); acondicionado T: 0 (s), deposición de T: 0 (s) de equilibrio T: 8 (s). 4) una reacción enzimática y medición electroquímica <ol><li> Homogeneizar agitando suavemente cada tubo Eppendorf que contiene partículas magnéticas listo para la etapa de medición electroquímica con el fin de obtener una suspensión y dispersión de partículas magnéticas; </li><li> Pipeta de cada Eppendorf, inmediatamente después de la homogeneización, una alícuota de 20 l de la dispersión con bolas magnéticas en la superficie del electrodo de trabajo correspondiente. Para cada electrodo del uso de una franja de 20 l de bolas magnéticas tomadas de diferentes tubos Eppendorf (por ejemplo, para el uso de electrodos ocho ocho diferentes Eppendorf); </li><li> Añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el primer electrodo. Inicio 2 minutos la cuenta regresiva. Después de 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el segundo electrodo. Después de otros 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el thiº de los electrodos. Proceder, en el mismo intervalo de tiempo (14 segundos) hasta que el último electrodo (que significa: agacharse cada alícuota de sustrato, con intervalos de 14 segundos). El intervalo de tiempo de 14 segundos se calcula como el tiempo requerido por el potenciostato para realizar la medición de la nota, la solución de 80 l de cada sensor debe cubrir el electrodo de trabajo, referencia y contra. Además, las soluciones para cada sensor no debe entrar en contacto con las soluciones de los electrodos de vecinos. </li><li> Después del minuto 2 la cuenta regresiva de la primera adición de la solución de sustrato enzimático, iniciar la medición electroquímica; </li><li> Utilice el PalmSens Lite para obtener picos de corriente (mA) para cada solución. </li></ol> 5) Cálculo Establecer una curva de calibración utilizando una ecuación logística cuatro parámetros para calcular la concentración de la cantidad total de toxina HT-2/T-2 en nanogramos por mililitro para cada tubo Eppendorf que contiene la muestra desconocida. Los datos experimentales, la altura del pico (mA) en contra de la concentración de los calibradores (ng / ml), debe estar equipado con un no-lineal de cuatro parámetros logísticos (4-PL) trama ecuación (1) (con Sigma Plot 8.0 o KaleidaGraph). La no-lineal 4-PL modelo se adopta generalmente para describir los ensayos de unión ligando (LBA) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> (1) a, b, x0, y0 son los parámetros de logística dada por el programa Sigma Plot ajuste de la curva. Use la fórmula explicada para calcular el contenido de HT-2/T-2 cantidad total de toxina en la solución de extracto de la muestra diluida <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="La ecuación 2" /> (2) x es la concentración en masa de la cantidad total de HT-2/T-2 toxinas en la solución del extracto diluido, calculado a partir de la ecuación logística cuatro parámetros en nanogramos por milliltre (ng / ml) y es el valor actual en mA obtenidos para la muestra desconocida Apéndice 6) de perlas magnéticas recubiertas Proceder de la siguiente manera para tener perlas magnéticas recubiertas con: <ol><li class="none"> Procedimiento de lavado </li></ol><ol><li> Homogeneizar tosylactivated Dynabeads ® M-280 (solución madre 2 x 109 cuentas / ml) por agitación y agitación (velocidad máxima) durante 1 min (evitar la formación de espuma) (tenga en cuenta la concentración de partículas magnéticas debe ser siempre la misma para asegurar la reproducibilidad de la medición); </li><li> Inmediatamente pipeta de 1 ml de homogeneizado por encima de las cuentas en un tubo de 2 ml Eppendorf; </li><li> Colocar el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo); </li><li> Pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando inalteradas cuentas; </li><li> Retire el tubo de Eppendorf del concentrador de partículas magnéticas y volver a suspender las bolas en 1 ml de 0,1 M pH 9,5 borato. Mezclar suavemente durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra durante 2 minutos; </li><li> Pipeta el sobrenadante; </li><li> Pipeta de 1 ml de solución tampón de borato en el tubo Eppendorf. Partículas magnéticas están listos para el paso de revestimiento; Proceso de emulsionado </li><li> Añadir 600 ml de HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) a 1 ml de partículas magnéticas) (final HT-2-KLH concentración de 375 mg / ml); incubar perlas magnéticas y la solución HT-2-KLH para 20h a 37 ° C * con una rotación lenta de inclinación en la rotación de mezclador de la muestra; </li><li> Después de colocar el tubo de incubación en el concentrador de partículas magnéticas y la pipeta el sobrenadante; Lávese las bolas recubiertas dos veces con 1 ml de solución tampón PBS / BSA. Entre cada lavado eliminar PBS / BSA solución. Todos los pasos de lavado se realizaron entorno perlas magnéticas y PBS / BSA en un mezclador rotatorio durante 5 minutos; </li><li> Lávese las bolas magnéticas, una vez utilizando 1 ml de solución tampón TRIS / BSA. Quitar TRIS / solución de BSA. Llevar a cabo este paso mediante el establecimiento de perlas magnéticas y tampón Tris / BSA en la rotación de mezclador de 4 horas a 37 ° C *; </li><li> Lávese las bolas magnéticas con 1 ml de una vez refrescado (conservarse en la nevera a 4 ° C) de PBS / BSA solución buffer. Quitar PBS / BSA solución. Llevar a cabo este paso, establecer las bolas magnéticas y el tampón PBS / BSA en la rotación de mezclador durante 5 minutos a temperatura ambiente; </li><li> Después de la etapa de lavado eliminar todo el líquido de lavado y añadir 1 ml de tampón PBS + NaN3 + BSA como de almacenamiento de líquidos; </li><li> Tienda de perlas magnéticas recubiertas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C); * Para este fin, el mezclador se coloca en el horno equipado con un agujero que permite la inserción de los cables de la fuente de alimentación. Como alternativa, el mezclador puede ser colocado en una habitación con termostato a 37 ° C. </li></ol> 7) Preparación de la muestra y la extracción 25 g demuestra finamente molida (el bebé los cereales del desayuno o la comida) se pesan en un vaso de la licuadora y se extrajo con 100 ml de solución de acetonitrilo / agua (86/14) durante 3 minutos en una batidora de alta velocidad. Después de la centrifugación a 4000 rpm (3000 g) durante 5 minutos, 8 ml de sobrenadante se tomaron y se purifica con la columna Mycosep, 4 ml de extracto de limpieza se secaron bajo corriente de nitrógeno. Las muestras secas se pueden guardar a -30 ° C hasta varios meses. 8) la reconstitución de muestra Cereales para el desayuno Reconstituir el extracto seco de cereales de desayuno (comida a base de cereales destinados al consumo para adultos) con 40 ml de PBS pH 7,4. De esta manera, una muestra con una concentración de la toxina igual que el límite legal supone (200 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo. Comida para bebés Reconstituir el bebé extracto seco de alimentos (comida a base de cereales destinados al consumo infantil) con 4 ml de PBS. De esta manera, una muestra con una concentración de toxinas igual que el límite legal supone (20-25 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo.

<ol><li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Letters%22%5BJournal%5D)">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li>
<li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li>
<li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li>
<li>FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).</li>
<li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li>
</ol>

El uso de anticuerpos como la sonda de reconocimiento biomolecular ha visto un uso generalizado de tecnologías de detección, métodos inmunoquímicos de detección, tales como ELISA y Meias, son, hoy en día, entre las plataformas más utilizadas y aplicadas en muchos laboratorios de 7. Si bien estos enfoques lograr una sensibilidad y especificidad, el objetivo principal de muchos grupos de investigación en los últimos años ha sido la mejora y optimización de sus actuaciones. <p cl...

Reactivos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Cloruro de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihidrógeno fosfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato disódico de hidrógeno </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 anhidro </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil]-aminometano </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfato disódico sal </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloquear - leche en polvo no grasa </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH (hemocianina de lapa californiana), solución de reserva (1 mg / ml en PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> El conjugado HT-2-KLH se obtuvo por el CDI-método en el que la libre circulación de grupos OH en la posición 3 y 4 de la toxina HT-2 fueron activados por N, N&#39;-carbonildiimidazol (CDI) y la activa HT-2 toxina vamos a reaccionar con aminogroups de la proteína (KLH) para generar un vínculo carbammate estable. </td></tr><tr><td> Anticuerpo secundario marcado: Anti-ratón IgG (H + L) de caballo, conjugado con fosfatasa alcalina, la concentración de 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toxina </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Partículas magnéticas: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentración de 2 x 10 9 bolas / ml. </td></tr></table> Soluciones <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Preparación </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4 </td><td> Disolver 0,20 g de cloruro de potasio, 0,20 g de dihidrógeno fosfato de potasio, 1,16 g de fosfato disódico de hidrógeno y 8,00 g de cloruro de sodio en 900 ml de agua </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolamina de amortiguamiento, la DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Disolver 0.0476g de MgCl2 anhidro y 7.3.59 g de KCl en ~ 300 ml de agua. Vez disueltos, añadir 51 ml de la DEA (99,5%). Ajustar el pH a 9.8 con HCl (6 M). Diluir hasta 500 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de borato, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Disolver 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml de agua destilada, ajustar el pH a 9.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir hasta 500 ml con agua destilada. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Disolver 3,85 g de Tris [hidroximetil]-aminometano en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 8.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir a 200 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TRIS + BSA solución (0,1%), pH 8,4 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de TRIS buffer de pH 8,4. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + Tween ® 0,05% </td><td> Disolver 0,250 g de Tween 20 en 500 ml del preparado previamente buffer PBS, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA solución al 0,1% </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de PBS, pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA y 0.010 de NaN 3 en 50 ml de tampón PBS, pH 7,3. </td><td> Almacenamiento de sollución </td></tr><tr><td> Sustrato enzimático </td><td> Disolver 0,010 g de sal 1-naftil fosfato de sodio en 100 ml de buffer de pH 9,8 DEA. Envolver el matraz herméticamente en papel de aluminio. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloqueo </td><td> Añadir 0,20 g de secante bloqueador de grado de leche sin grasa seca (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a 200 ml de tampón PBS pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 de la solución madre </td><td> Disolver 10 mg de tricotecenos vial de toxina HT-2, en 10 ml de acetonitrilo para dar una solución con una concentración de 1 mg / ml. </td><td> Dividir esta solución en un solo uso alícuotas de 30 ml y guárdelos a menos de -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 la solución de trabajo estándar </td><td> Colocar 20 ml de HT-2 toxina solución de reserva en una de 2 ml calibrada matraz aforado y diluir con acetonitrilo para obtener una solución HT-2 de trabajo que contiene 10 mg / ml de toxina tricotecenos. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 Trabajo soluciones calibrante </td><td> Diluir el HT-2 solución patrón de trabajo (10 mg / ml) para preparar una solución de trabajo calibrante 100 ng / ml. Diluir HT-2 Solución de trabajo de calibrante 100 ng / ml para preparar soluciones de trabajo calibrador de las siguientes concentraciones 0 (blanco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Estas soluciones deben estar recién en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH </td><td> Dividir HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) (1 mg / ml en PBS) en un solo uso alícuotas de 350 microlitros. </td><td> Alícuotas de almacenar a -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal específico </td><td> Diluir 1:350 (v: v) la concentración de acciones (1,383 mg / ml) del anticuerpo monoclonal en PBS para el uso en el paso la competencia </td><td> Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. 10 ml de solución de anticuerpos en PBS para obtener un volumen de 3,5 ml, son suficientes para analizar las 17 normas y / o muestras. </td></tr><tr><td> Secundaria de anticuerpos etiquetados </td><td> Anti-ratón IgG (H + L) conjugado con fosfatasa alcalina se diluye 1:100 (v: v) en PBS a utilizar en el paso de la competencia. </td><td> Una solución de 100 l de valores de anticuerpos en PBS para obtener un volumen final de 10 ml, son suficientes para analizar las normas 25 y / o muestras. Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. </td></tr></table> Aparato <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Concentrador de partículas magnéticas: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrumento </td><td> PalmSens </td><td> Siempre con PalmSens Lite, el cable de serie de conexión PC portátil y el software de las opciones de Mux </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens multiplexor </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Ocho canales de contacto eléctrico Mux </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Tira con ocho electrodos serigrafiados (EFE) </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Apoyo especialmente diseñado para bandas de electrodos </td><td> hecho a mano </td><td> Incluye 8 imanes de neodimio de cada uno de ellos se coloca debajo de la superficie de cada electrodo de trabajo de la SPE </td></tr><tr><td> Calibrar pipetas microlitro </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitador magnético y barras de agitación. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vasos de vidrio (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matraces aforados (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 y 2 ml tubos Eppendorf. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ tubos de 5 ml y 15 ml. </td><td> Halcón </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de Vortex Mixer </td><td></td><td> No utilice vórtex para resuspender perlas magnéticas recubiertas con HT2-KLH o vinculados con la cadena inmunológica para evitar la desnaturalización de las partes proteicas </td></tr><tr><td> Horno de laboratorio o una sala con termostato </td><td></td><td> Elegir un horno capaz de mantener una temperatura de 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked inmuno magnética químicos) método para la detección de micotoxinas

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Inmunoensayos son una alternativa válida a la que consumen más caro y HPLC cuantitativa o GC 1, 2 métodos de cribado para la detección de micotoxinas peligrosas en los productos alimenticios. En este protocolo se muestra cómo fabricar e interrogar a una enzima vinculada ensayo electroquímicos competitivos inmunomagnética basado en el uso de partículas magnéticas como soporte sólido para la cadena de inmunoquímica 3 y electrodos serigrafiados como la detección de la plataforma. Nuestro método tiene como objetivo determinar la cantidad total de HT-2 y las toxinas T-2, las micotoxinas que pertenecen a la familia de los tricotecenos y de gran preocupación para la salud humana 4. El uso de un anticuerpo clon con una reactividad cruzada del 100% para HT-2 y T-2 permite detectar simultáneamente dos toxinas con una sensibilidad similar 5. El primer paso de nuestro análisis es la etapa de recubrimiento en el que inmovilizar HT2-KLH conjugado toxina en la superficie de partículas magnéticas. Después de una etapa de bloqueo, necesario para evitar absorciones no específicas, la adición de un anticuerpo monoclonal permite la competencia entre los inmovilizados HT-2 y libres presentes HT-2 o T-2 en la muestra o en una solución estándar. Al final de la etapa de la competencia, la cantidad de anticuerpo monoclonal ligado a la inmovilización HT-2 será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en la solución de la muestra. Un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) se utiliza para mostrar la unión entre el anticuerpo específico y el inmovilizado HT-2. La etapa de medición final se realiza dejando caer una parte alícuota de la suspensión de cuentas magnéticas, correspondientes a una muestra específica / solución estándar, en la superficie de un electrodo serigrafiado de trabajo, partículas magnéticas se inmovilizan y se concentraron por medio de un imán colocado precisamente bajo el serigrafiado de los electrodos. Después de dos minutos de incubación entre partículas magnéticas y un sustrato de la AP, el producto enzimático es detectado por voltametría de pulso diferencial (DPV), utilizando un equipo portátil (PalmSens) también es capaz de iniciar automáticamente ocho mediciones en un intervalo de pocos segundos.

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Los inmunoensayos representan una alternativa válida a los métodos cuantitativos de HPLC o GC, que son más costosos y requieren más tiempo, para la detección mediante cribado de sustancias peligrosas...

Hola, me llamo Francesco Lichi. Soy investigador posdoctoral en el Laboratorio Bioanalítico del profesor Palki en la Universidad de Roma Tova Gata. Hoy, junto con mis colegas, les mostraré la preparación de un CY electroquímico para la detección de la micotoxina TCO en muestras de alimentos.Entre los diferentes métodos utilizados en la prueba inmuno celular, la inmunoensayo enzimático es uno de los más populares en este método. Tanto el anticuerpo como el antígeno están marcados con una enzima. Recientemente, el uso de métodos electroquímicos para la detección de la actividad enzimática ha demostrado tener ventajas particulares para ciertas aplicaciones.La electroquímica es, de hecho, menos propensa a interferencias, adecuada para la miniaturización y para la deducción masiva a bajo costo. Desde esta perspectiva, el uso de electrodos serigrafiados es de gran importancia para garantizar un bajo costo y simplicidad del procedimiento. Además, el uso de lechos magnéticos podría combinarse con electrodos serigrafiados para obtener la máxima sensibilidad del método.Hoy, le mostraremos cómo preparar un biosensor electroquímico basado en el uso de electrodos impresos por serigrafía y partículas magnéticas para la detección de la micotoxina TCO en muestras alimentarias. Las micotoxinas tricotecénicas se encuentran comúnmente en cereales, y por esta razón representan una amenaza seria para la seguridad de los alimentos y piensos derivados de cereales. Las más importantes dentro del grupo A son las toxinas T-2 y HT-2.Como veremos, este método puede realizarse fácilmente por personal no capacitado y con instrumentación de bajo costo y portátil. Este es uno de los objetivos principales del proyecto integrado bio financiado por la comunidad europea en cuyo marco se ha llevado a cabo este trabajo. Ahora veamos cuál es el principio del método y los materiales que utilizaremos.Así que comencemos. Las perlas magnéticas se utilizarán como soporte para la reacción en cadena inmunológica. Una tira de ocho electrodos impresos por pantalla se utilizará como elemento sensor.Cada sensor está compuesto por un electrodo de grafito que actúa como electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar y un electrodo de referencia de plata. Estos sensores pueden operarse secuencial e individualmente en un tiempo muy corto mediante un instrumento electroquímico portátil fabricado por palm Sense según el principio del método. El principio del método es sencillo y se basa en una reacción inmunológica competitiva.La toxina conjugada se inmoviliza sobre las perlas magnéticas, que posteriormente se bloquean para evitar la absorción no específica. La medición propiamente dicha comienza con la etapa de competencia. En esta fase, se deja que las perlas recubiertas reaccionen con una cantidad fija de anticuerpo monoclonal, y la toxina presente en la muestra y la inmovilizada sobre las perlas magnéticas competirán por los sitios de unión del anticuerpo.La cantidad de anticuerpo unida a las perlas codificadas será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en una muestra. A continuación del paso de competencia se lleva a cabo el paso de marcado. En este caso, se deja que las perlas magnéticas reaccionen con un anticuerpo secundario conjugado con una enzima marcadora.El anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo monoclonal y garantizará una marcación eficiente. Finalmente, al paso de marcación le sigue el paso de medición. En este caso, las perlas magnéticas se colocan concentradas sobre la superficie del electrodo con la ayuda de la plataforma magnética, y simplemente añadimos el sustrato enzimático uno nafto fosfato, y medimos la producción de uno naftol.La curva de unión generada mostrará valores altos de corriente a bajas concentraciones de toxina y señales bajas a altas concentraciones de toxina. La concentración de la toxina se obtendrá utilizando una curva de calibración generada en soluciones tampón estándar. Para configurar el ensayo real, preparamos un portamuestras con tubos fendor limpios de dos mil, uno separado para cada solución estándar de la curva de calibración, así como para las muestras.Luego, se pipetean 10 microlitros de la suspensión de perlas en cada tubo. Esta solución contiene perlas magnéticas previamente recubiertas con la toxina conjugada. Sin embargo, antes de realizar el ensayo, debe eliminarse el líquido de almacenamiento porque el azida sódico utilizado como conservante afectaría la actividad enzimática de la etiqueta.Para hacer esto, se añade tampón P-B-S-B-S-A. Los tubos se agitan, luego se vuelve a insertar el imán y se aspira el tampón de lavado. El primer paso real del ensayo se denomina etapa de bloqueo.Durante este paso, se añade un mililitro de solución bloqueante a cada uno de los tubos. Luego, se colocan en el mezclador rotatorio de muestras y se incuban durante media hora a temperatura ambiente. A continuación, se elimina la solución bloqueante para el siguiente paso crucial, el paso de competición, al que se añaden a cada tubo la solución de anticuerpo monoclonal específico y la solución de toxina.Para ello, se inyectan 200 microlitros de anticuerpo monoclonal en la concentración optimizada. Luego, se añaden 200 microlitros de cada solución patrón o muestra a cada tubo. Se dejará que estos reactivos incuben durante 30 minutos.Con el fin de optimizar el contacto entre los reactivos inmovilizados en la superficie de las partículas magnéticas y las moléculas en solución para iniciar este proceso, los tubos se devuelven al mezclador rotatorio de muestras para proceder con el paso de marcado. Es necesario eliminar la solución del paso anterior. Luego se añaden 400 microlitros de anticuerpo secundario marcado a cada tubo, y se devuelven al mezclador rotatorio de muestras, incubando durante 30 minutos.Luego, tras la eliminación del líquido de marcado, realizamos procedimientos de lavado utilizando diversos tampones para evitar cualquier interferencia por reactivos enzimáticos no unidos. Finalmente, para prepararnos para las mediciones reales, las perlas magnéticas se resuspenden en 100 microlitros de tampón DEA uno, adecuado para optimizar la actividad enzimática del marcador. La medición se realiza con este potenciostato portátil que se muestra conectado a una tira de ocho electrodos situada debajo.Hay un soporte especial en el que ocho imanes fuertes están fijados exactamente debajo de la superficie de cada electrodo de trabajo. El imán sirve para concentrar las perlas en la superficie del electrodo de trabajo. Pipeteamos de cada EOR un alícuota de 20 microlitros de la dispersión de perlas magnéticas reactivas y la cargamos sobre la superficie del electrodo de trabajo correspondiente.Para realizar la medición real, es necesario añadir el sustrato enzimático, pero también se debe controlar cuidadosamente la secuencia de pasos. Añadimos ad microlitros de solución de sustrato enzimático a la superficie del primer electrodo. Luego, iniciamos una cuenta regresiva de dos minutos.Después de 14 segundos, agregamos la solución de sustrato sobre el segundo electrodo. Después de otros 14 segundos, añadimos la solución de sustrato al tercer electrodo. Procedemos utilizando el mismo intervalo de tiempo hasta el último electrodo.De hecho, el intervalo de 14 segundos se calcula como el tiempo necesario para que el potenciostato realice la medición. Bien, tras la cuenta regresiva de dos minutos a partir de la primera adición de la solución de sustrato enzimático, se inicia el protocolo de medición electroquímica. La medición real del producto formado se realiza mediante telemetría diferencial post-potencial.Las curvas para los electrodos sucesivos comienzan a aparecer en la pantalla mediante un ensayo competitivo. La intensidad de corriente de la señal obtenida será inversamente proporcional a la concentración de toxina presente en el tubo durante la etapa de competencia. La señal de corriente de las soluciones patrón se representará en una curva sigmoidea, y el contenido de toxina en muestras desconocidas se obtendrá extrapolando el valor de concentración a partir de la señal registrada.Bueno, espero que esta demostración haya sido clara y útil para comprender las ventajas de los inmunosensores electroquímicos. Gracias por verla y buena suerte con sus experimentos.

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Magnética modulación del sistema de biosensores se utiliza a la rápida, sensible y simplemente detectar ensayos biológicos, como las moléculas de ADN y las proteínas.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Este video muestra la detección de complejos anticuerpo-antígeno químicamente conjugados a través de la técnica de ensayo de inmunoabsorción enzimática sándwich, o ELISA. El anticuerpo capturado se une al epítopo específico del antígeno del conjugado anticuerpo-antígeno, que puede visualizarse posteriormente utilizando un anticuerpo secundario ligado a una enzima.

Ensayo de inmunoabsorción enzimática para verificar conjugados anticuerpo-antígeno acoplados químicamente

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Aquí se presenta un protocolo que implica la concentración integrada, el enriquecimiento y la detección colorimétrica de puntos finales de patógenos transmitidos por los alimentos en grandes volúmenes de agua agrícola.  El agua se filtra a través de hisopos de Moore modificados (MMS), enriquecidos con medios selectivos o no selectivos, y la detección se realiza mediante dispositivos analíticos basados en papel (μPAD) incrustados con sustratos colorimétricos indicativos de bacterias.

Colorimétrico Papel a base de Detección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp,. Y<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; De grandes volúmenes de agua en la agricultura

Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

La presencia de toxinas cianobacterianas en los embalses de agua dulce para consumo humano es una gran preocupación para las autoridades de gestión del agua. Para evaluar el riesgo de contaminación del agua, este artículo describe un protocolo para la detección en campo de cepas de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos.

Protocolo Experimental para la detección de Las cianobacterias En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.

Un ensayo basado en electroquimioluminiscencia para variantes de proteínames MeCP2

En la infección por Mycoplasma pneumoniae, las pruebas serológicas pueden generar buenos resultados, pero con baja especificidad debido a la reacción inmunológica cruzada. El ELISA interno de captura de antígeno, descrito en este documento, garantiza una alta especificidad de la especie y ha demostrado ser una prueba de detección confiable para el diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno para la detección específica de Mycoplasma pneumoniae

Este protocolo presenta un método validado de cromatografía líquida-movilidad iónica-espectrometría de masas de alta resolución para determinar la presencia de alcaloides del cornezuelo de centeno en los alimentos en cumplimiento del Reglamento (UE) 2023/915 de la Comisión recientemente publicado.

Detección de alcaloides de cornezuelo de centeno regulados en matrices alimentarias por cromatografía líquida-espectrometría de movilidad iónica atrapada-espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Aprende a detectar tricotecenos en muestras de alimentos mediante el método ELIME con detección electroquímica. Este protocolo competitivo ofrece alta sensibilidad y especificidad para el análisis de micotoxinas.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Explorar más videos