A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

En esta presentación, presentaremos un sistema de perfusión palpebral basado en microfluídica para la medición simultánea de la secreción dinámica de insulina, la afluencia de calcio y los cambios en el potencial mitocondrial de los ojales pancreáticos en respuesta a la secreción de insulina en perros. El sistema de perfusión está compuesto por un dispositivo microfluídico de tres capas, bombas de jeringa y un colector de insulina fraccionado. Las imágenes de la afluencia de calcio inducida por secretagogos y los potenciales mitocondriales se obtienen mediante microscopio fluorescente.

Hola, mi nombre es Ola, una Waller del laboratorio del Dr. Val Holter en el Departamento de Cirugía de Trasplantes de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, soy Don Lee, también del laboratorio de octubre. Hola, soy Tricia Hart, también del laboratorio de Dr.Al Holster.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la obtención simultánea de imágenes de párpados mediante un gradiente lineal de glucosa. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las imágenes y la función de los ojales. Así que comencemos.

El dispositivo microfluídico utilizado para este procedimiento se ensambla a partir de tres capas de PDMS curado generado por fotolitografía estándar. La primera capa generada a partir de un maestro de silicona tiene los pocillos del dispositivo microfluídico que mantendrá suavemente los ojales en su lugar, de 150 micrómetros de profundidad y 500 micrómetros de diámetro. La segunda capa tiene canales de 500 micrómetros de alto y dos milímetros de ancho.

El centro del canal se expande para distribuir el flujo para un mejor intercambio de solución Dentro del dispositivo, a cambio se hace un pozo perforando un orificio de tres milímetros de alto y siete milímetros de ancho en el medio de la capa. La tercera capa es una losa gruesa de PDMS. Para preparar esta capa, perfore pequeños agujeros en ambos lados que se alineen con la entrada y salida del canal.

En la segunda capa, una vez que se han generado las tres capas, la primera capa se adhiere a un portaobjetos de vidrio con los pocillos hacia arriba. A continuación, la segunda capa se une a la primera capa con el espaciado de los canales. Finalmente, la tercera capa se une a la segunda capa.

Una vez que se han unido las capas, el dispositivo está listo para usar en experimentos. Usando una jeringa de 10 mililitros llena de etanol al 70% y conectada al puerto de entrada del dispositivo con Tai en el tubo, esterilice el dispositivo microfluídico haciendo fluir el etanol a través de los canales del dispositivo. Luego, usando el mismo flujo de configuración, agua desionizada para lavar el etanol.

Una vez que el dispositivo haya sido esterilizado, colóquelo en una platina de microscopio calentada con tubos de tigon, conecte las bombas de jeringa que contienen soluciones de glucosa alta y baja a un conector en Y. Luego conéctelo a la entrada del dispositivo microfluídico. Conecte la salida del dispositivo microfluídico a un colector de fracciones.

Asegúrese de que el tubo esté descansando sobre una placa calefactora de 37 grados centígrados. Es muy importante mantener las soluciones a temperatura fisiológica durante todo el experimento. A continuación, utilice el programa de vista de laboratorio para iniciar el gradiente de glucosa que se perfundirá a través de la red microfluídica durante el experimento.

Este software varía el caudal de dos soluciones de glucosa. Al controlar las bombas de jeringa, se pueden crear aquí varios perfiles de gradiente de glucosa, perfiles de gradiente de glucosa lineales, en forma de campana y en forma cuadrada. En comparación con los valores esperados calculados que se muestran en este experimento, se utilizará el gradiente lineal de dos milimolares a 25 milimolares de glucosa con un caudal variable de 0,01 mililitros por minuto de las dos soluciones de glucosa y un caudal constante de 0,25 mililitros por minuto que ingresa al dispositivo después de que se mezclan las soluciones.

Una vez que se haya seleccionado el perfil de degradado adecuado, pruebe la estabilidad del degradado. Primero, inicie el sistema de degradado. A continuación, ponga en marcha el colector de fracciones y recoja perfundir ocho tubos de un mililitro de orph.

Luego, usando un glucómetro, pruebe la concentración de glucosa en cada tubo usando excel. Analizar los resultados obtenidos del glucómetro. A continuación, sustituya la jeringa de glucosa alta por una jeringa que contenga una solución de BSA al 0,5 % en tampón de timbre Krebs PERFUSE de 50 mililitros a través del dispositivo a una velocidad de un mililitro por minuto.

Esto evitará la absorción inespecífica de insulina a las paredes de los microcanales para garantizar la precisión al medir posteriormente los niveles de insulina secretados después de la perfusión con BSA. Sustitúyalo por la solución alta en glucosa reus. Suspender de 25 a 30 ojales de ratón seleccionados a mano en un tampón Krebs ringer de glucosa molar de dos milimolares que contiene el colorante indicador de calcio fira 2:00 AM y el colorante indicador de potenciales mitocondriales rumine 1 2 3, incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, desconecte el dispositivo del sistema de perfusión y cargue con cuidado los ojales en el dispositivo microfluídico insertando la punta de la pipeta, que contiene los islotes en el puerto de entrada y, dispensando lentamente los islotes después de la carga, vuelva a conectar el dispositivo al sistema de perfusión. Teniendo cuidado de no introducir burbujas. A continuación, encienda la bomba de jeringa para comenzar a perfundir los ojales con KRB que contiene dos milimolares de glucosa.

Este paso lavará el exceso de tinte del medio, designará los conjuntos de filtros de excitación y emisión y los tiempos de exposición que se utilizarán durante el experimento. A continuación, configure el colector de fracciones para que recoja a intervalos de un minuto mientras utiliza los ojales con la solución baja en glucosa. Utilice la herramienta de región de interés o ROI del sencillo software de imágenes PCI para definir las áreas u ojales que desea obtener en imágenes.

Además, encierre en un círculo el área de fondo que se restará después de que las células se hayan lavado durante 10 minutos, inicie el colector de fracciones de gradiente de glucosa e inicie las imágenes de lapso de tiempo. Después de 30 minutos, apague el software y la bomba de jeringa de glucosa alta. Continúe perfundiendo con glucosa baja para eliminar el efecto de la glucosa alta.

Después de 10 minutos, detenga el flujo de glucosa baja apagando la bomba de jeringa. Después de la perfusión, exporte los datos a Excel para su análisis. La cantidad de insulina secretada en el perfu ocho se puede determinar mediante ojales de ratón ELA.

Se perfundieron con un gradiente lineal de dos a 25 milimolares de glucosa como se muestra aquí. La entrada de calcio y la secreción de insulina se desencadenan después de unos 13 minutos de perfusión, lo que corresponde a seis milimolares. Glucosa. Los cambios en los potenciales mitocondriales se observan antes, como se esperaba, alrededor de los 11 minutos.

Estos datos demuestran la ventaja de utilizar esta red microfluídica para caracterizar la fisiología de los ojales. Acabamos de mostrarle cómo utilizar nuestro dispositivo de parafusión microfluídica para el estudio de la fisiología de los ojales. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que no haya burbujas en el dispositivo, ya que esto podría hacer que los ojales se muevan durante un experimento.

Además, el flujo se puede ajustar hasta un ml por minuto sin alterar los ojales. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.