Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

El sistema myth se basa en el concepto de ubiquitina dividida, que hace referencia a la capacidad de la ubiquitina de separarse de forma estable en dos mitades: la terminal N, llamada NUBI, y la terminal C, llamada CUB, las cuales son capaces de reconstituirse en una molécula completa de pseudo ubiquitina. Aunque esta reconstitución es espontánea al utilizar NUBI de tipo silvestre, la introducción de una mutación de isoleucina 13 a glicina, que produce un fragmento denominado NUBG, reduce considerablemente su afinidad por CUB, bloqueando así la formación de la pseudo ubiquitina. Si NUBG y CUB están fusionadas a la proteína A y a la proteína B, respectivamente, y si A y B son capaces de interactuar, entonces la molécula de pseudo ubiquitina puede volver a formarse.

En el sistema MYTH, los cebos de membrana integral están fusionados al dominio de unión que consiste en el fragmento CUB unido a un factor de transcripción artificial. Mientras tanto, las presas se fusionan al fragmento NUBG; una interacción entre el cebo y la presa conduce a la reconstitución de la pseudo ubiquitina, la cual a su vez puede ser reconocida por enzimas desubiquitinantes citosólicas ilustradas como tijeras. Estas enzimas realizan un corte tras el extremo C del CUB, liberando al factor de transcripción, el cual puede entonces ingresar al núcleo y activar el sistema de reportero, permitiendo el aislamiento selectivo y la identificación de células en las que ocurren interacciones entre BA y presas.

Hola, soy Janie Snyder del laboratorio Igor STAARs en los departamentos de genética molecular y bioquímica de la Universidad de Toronto. Hoy les mostraré un procedimiento para el sistema de dos híbridos en membrana, o myth, que utilizamos en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones de proteínas integrales de membrana. Comencemos.

Antes de realizar el análisis MYTH, verifique que su proteína cebo tenga su extremo N y/o C en el citosol de la célula. La etiqueta CUB-LexA-VP16 debe fusionarse a su proteína en dicho extremo. Dado que las enzimas desubiquitinadas necesarias para la liberación del factor de transcripción se encuentran en el citosol, si la topología de su proteína cebo no es conocida, puede generar construcciones etiquetadas tanto en el extremo N como en el C, y utilizando la prueba de control N-U-B-G-I descrita brevemente, determine si alguna de ellas es adecuada para usar en MYTH, lo que indicaría que un extremo particular está localizado en el citosol.

A continuación, decida cuál de las dos variantes principales de myth es adecuada para su experimento. Para proteínas nativas de levadura, el método integrado de myth o immy es la opción preferida. En Imy Bates, las proteínas están marcadas endógenamente con la etiqueta CUB Lex a VP 16, manteniéndolas bajo el control de su promotor nativo.

Esto es ventajoso ya que el nivel de expresión del tipo silvestre de Bates ayuda a eliminar problemas asociados con la sobreexpresión de proteínas, como un aumento en el número de falsos positivos para proteínas de levadura no nativas; puede utilizarse el sistema tradicional myth o T myth, en el cual el cebo con etiqueta CU B Lex A V VP 16 se sobreexpresa ectópicamente a partir de un plásmido. Nos centraremos en T myth en este protocolo, ya que esta forma de myth es más ampliamente aplicable; con la excepción de la construcción inicial del cebo y los medios utilizados, ambas formas de myth se llevan a cabo de manera esencialmente idéntica. El cebo debe clonarse en un vector apropiado para la etiquetación y expresión.

Actualmente están disponibles una variedad de vectores T myth, como BV cuatro, p, a, BV cuatro y PCM BV cuatro, que permiten la construcción de Bates etiquetados en el extremo C, Beit Cub Lexie y VP 16 bajo el control de un promotor TF uno fuerte, un promotor A DH uno fuerte y un promotor CYC uno débil, respectivamente. Una vez que se ha seleccionado el efector del equipo, se realiza una digestión por enzimas de restricción en el plásmido en el sitio de restricción apropiado. La escisión debe ocurrir únicamente en las inmediaciones del sitio del marcador CU B Lxe VP 16, aguas arriba de la etiqueta para la marcación en el extremo C o aguas abajo para la marcación en el extremo N.

Por ejemplo, al utilizar el vector PAM BV, SFI uno es una opción ideal; después de que el plásmido haya sido digerido, guárdelo a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para su uso. El siguiente paso consiste en diseñar cebadores para la amplificación y clonación del gen de interés. El extremo cinco prima de su cebador directo debe coincidir con aproximadamente 35 a 40 nucleótidos hacia arriba del sitio de restricción, mientras que el extremo tres prima debe coincidir con los primeros 18 a 20 nucleótidos del gen diana, que es un DRB dos que codifica el receptor beta dos y genérico.

En nuestro ejemplo, el extremo cinco prima del cebador reverso debe coincidir con el complemento inverso de aproximadamente 35 a 40 nucleótidos ubicados aguas abajo del sitio de restricción. El extremo tres prima debe coincidir con el complemento inverso de los últimos 18 a 20 nucleótidos del gen diana, omitiendo el codón de parada si la etiqueta VP16 del CU B Lex se está colocando en el extremo C, como se muestra en el ejemplo. Dependiendo de si se realiza una etiquetado en el extremo N o C, asegúrese de que los 35 a 40 nucleótidos seleccionados de la secuencia del plásmido utilizados en el cebador directo o reverso resulten en la clonación del gen diana en el mismo marco de lectura que el CU B Lex y la etiqueta VP16. Dado que en nuestro ejemplo el extremo C de la proteína A DRB dos será etiquetado.

Las 35 bases del extremo 3' de una secuencia de MBV en el cebador inverso se han seleccionado de manera que las secuencias del gen A DRB dos y del gen CUB queden dentro del mismo marco de lectura; amplifique el gen de interés mediante PCR utilizando los cebadores seleccionados. Los parámetros de la PCR dependerán de la enzima específica y de los cebadores utilizados para proporcionar un entorno en el cual pueda ocurrir la recombinación homóloga mediante reparación de brechas. El plásmido previamente digerido y el gen de interés amplificado se transforman en una cepa de levadura adecuada utilizando un protocolo estándar de transformación de levaduras, como el descrito por Geets y Woods.

Una vez que la levadura transformada haya crecido en la placa, seleccione una colonia individual de la cepa e inóquela en cinco mililitros de SD sin leucina. Incube el medio líquido a 30 grados Celsius durante la noche hasta que el cultivo alcance la saturación. Centrifugue las células a 700 ×g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y aísle el ADN del plasma cebo del sedimento celular utilizando cualquier kit comercial de minipreparación.

Siga el protocolo estándar con una modificación para asegurar una lisis suficiente de las células de levadura: agregue un volumen pequeño de 0,5 milimoles de perlas de vidrio de soda cal al precipitado después de la suspensión inicial en tampón de resuspensión y mezcle en vórtex vigorosamente durante cinco minutos. Luego continúe con el protocolo comercial de forma habitual. Transforme el ADN de levadura aislado en una cepa de E. coli químicamente competente adecuada para la propagación de plásmidos, con una eficiencia de transformación de al menos 1 × 10⁷ células por microgramo de ADN.

Después de recolectar el ADN plasmídico de la E. coli transformada, verifique la construcción adecuada del plásmido cebo mediante secuenciación antes de usarlo; las cepas cebo deben analizarse para asegurar que las proteínas cebo se localicen correctamente en la membrana de levadura. La localización se determina mediante microscopía de fluorescencia. La inclusión de una molécula YFP en la secuencia de la etiqueta cebo permitirá la visualización directa de células vivas y se utiliza comúnmente en imy.

Alternativamente, puede utilizarse un enfoque estándar de inmunofluorescencia con un anticuerpo contra los componentes Lex A o VP16 de la etiqueta, una vez que se haya establecido la localización adecuada del cebo. Es necesario asegurarse de que el cebo no active por sí mismo el IE, es decir, que no active el sistema de reportero solo ni en presencia de proteínas de control no interactivas. Para garantizar que el cebo no tenga activación autónoma, empleamos la prueba N-U-B-G-I. En esta prueba.

El cebo se transforma con un control positivo que interactúa y un control negativo que no interactúa, y luego se depositan diferentes diluciones de cada transformante sobre medios selectivos apropiados. El cebo debe crecer en el medio selectivo en presencia del control positivo y no debe crecer en presencia del control negativo para ser adecuado para su uso en MYTH. Una vez que se ha validado el cebo, la cepa reveladora de MYTH que contiene el cebo puede transformarse con una biblioteca de presas de interés para detectar interacciones proteína-proteína.

Para comenzar esta transformación a gran escala en levadura, inocule una colonia individual de la cepa indicadora myth que contenga su cebo en cinco mililitros de medio SD sin leucina e incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación. Diluya la cultura nocturna en 200 mililitros de medio SD sin leucina e incube a 30 grados Celsius con agitación hasta que alcance una DO 600 de 0,6 a 0,7. Cuando se haya alcanzado la DO 600 objetivo, divida la cultura de 200 mililitros entre cuatro tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros con tapa roscada y recopile las células mediante centrifugación.

Después de lavar los pellet con agua estéril doblemente destilada y solución de acetato de litio trissy DTA, suspendemos cada pellet en 600 microlitros de solución de acetato de litio trissy DTA en cada uno de cuatro tubos cónicos de 15 mililitros con rosca. Añada 2,5 mililitros de solución de PEG acetato de litio a 600 microlitros de células resuspendidas, 100 microlitros de solución de ADN de esperma de salmón y siete microgramos de ADN de la biblioteca de presas cuatro. Agite los tubos durante un minuto para asegurar una mezcla completa y luego incube en un baño de agua a 30 grados Celsius durante 45 minutos.

Mezcle brevemente cada 15 minutos tras la incubación de 45 minutos. Añada 160 microlitros de dimetilsulfóxido o DMSO a cada tubo y mezcle inmediatamente invirtiendo los tubos. Incube en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 20 minutos.

Una vez completado el choque térmico, recopile las células mediante centrifugación y resuspenda. Suspenda cada uno de los pellet en tres mililitros de X-Y-P-A-D 2X. Reúna todas las muestras en un solo tubo de centrífuga de 50 mililitros con tapón de rosca.

Incube las células a 30 grados Celsius durante 90 minutos para la recuperación celular. Centrifugue las células y re suspenda el botón celular en 4,9 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9 % utilizando 100 microlitros de células re suspendidas. Prepare diluciones seriadas de diez veces en cloruro de sodio estéril al 0,9 %, que varíen desde 10 x hasta 10.000 x, plaque 100 microlitros de las diluciones 100 x y 1000 x en medio selectivo e incube a 30 grados Celsius durante dos a tres días.

Estas placas sirven como control y se utilizan para calcular con igualdad la eficiencia de la transformación. Divida los 4,8 mililitros restantes de células resuspendidas y siembre en placas grandes de 150 milímetros, luego incube a 30 grados Celsius durante tres a cuatro días. Una vez que hayan crecido colonias, resuspenda colonias individuales, cada una representando células que contienen un par posible de cebo y presa interactuantes, en 100 microlitros de cloruro de sodio al 0,9 % y siembre alícuotas de cinco microlitros en medio selectivo que contenga XG; deje crecer durante dos a cuatro días únicamente.

Se seleccionan las colonias que presentan un crecimiento robusto y un color azul para un análisis posterior. Después de aislar y secuenciar los plásmidos de las colonias de levadura positivas, compile y analice todos los datos de secuenciación para elaborar su lista preliminar de interactores. Para verificar nuevamente estas interacciones, se emplea la prueba de dependencia del cebo.

En esta prueba, todos los plásmidos de presa que expresan los interactores identificados se transforman nuevamente en la cepa original de cebo, así como en la cepa que porta un cebo artificial de control consistente en un único dominio transmembrana fusionado al CUB Lex, una etiqueta VP16. Se resuspenden colonias individuales de estas transformaciones en 100 microlitros de agua estéril doblemente destilada y se depositan volúmenes de cinco microlitros sobre el medio selectivo apropiado más X sc. Idealmente, se deben seleccionar varios transformantes para cada presa, y tanto el cebo original como el cebo artificial deben colocarse en la misma placa. Incubar las placas durante dos a cuatro días a 30 grados Celsius. Las levaduras que portan el cebo artificial en presas que provocan la activación del sistema de reportero se consideran promiscuas, y esa presa específica se elimina de la lista de interactores.

Elogios que causen crecimiento y coloración azul en levaduras con el cebo de interés, pero no con el cebo artificial. Confirme una interacción específica. Si, sin embargo, las levaduras que contienen la presa y su cebo de interés no crecen.

Esta presa se elimina de la lista de interactores. Las presas restantes constituyen la lista completa de interactores identificados en la pantalla mito. Tras la finalización del procedimiento mito, se obtendrá un mapa de interacción.

Esto representa una colección de interacciones candidatas que el investigador debe analizar más a fondo mediante estudios específicos determinados caso por caso. Para evaluar la significancia biológica de cada una, acabamos de mostrarle cómo llevar a cabo el ensayo de doble híbrido en membrana o procedimiento myth para identificar los socios interactuantes de una proteína de interés. Al realizar el procedimiento myth, es importante verificar que su proteína de interés tenga su extremo N o C terminal ubicado en el citosol de la célula, y diseñar en consecuencia su estrategia de etiquetado.

Además, es importante evaluar cuidadosamente que sus cepas de cebo expresen adecuadamente el cebo y que este se localice correctamente. Asimismo, es fundamental realizar la prueba de control NUB GI, ya que resulta útil para ayudar a establecer las condiciones de tamizaje. Finalmente, asegúrese de verificar independientemente todas las interacciones que detecte mediante myth.

Seguir estos sencillos pasos debería garantizar que obtenga los mejores resultados posibles del procedimiento myth. Bueno, eso es todo. Gracias por verlo y mucha suerte con sus experimentos.