Name: Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende el análisis de pulso-caza de glicanos unidos a N en células de mamífero mediante marcaje metabólico con manosa tritiada, liberación enzimática y separación por HPLC. Este método permite estudiar la dinámica temporal de los glicanos en glicoproteínas.

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Damos las gracias a Zehavit Frenkel y Tolchinsky Sandra de asistencia técnica. La investigación relacionada con este trabajo es apoyado por becas de la Fundación Ciencia Israel (1229-1207) y el alemán-israelí Proyecto de Cooperación (DIP-DFG).

El protocolo está destinada para el análisis de cadenas de azúcares de las glicoproteínas o total de una glicoproteína de interés específico. El procedimiento es básicamente el mismo en ambos casos con algunas modificaciones como se indica a través del protocolo. <ol><li> Para el etiquetado del metabolismo de N-glicanos ligados uno tiene que usar una cultura subconfluentes de células de mamífero cultivadas durante la noche en una placa de 90 mm para cada muestra (muestras pueden representar diferentes puntos de tiempo o de tratamientos). Este protocolo está optimizado para las células NIH 3T3. </li><li> Comer a las células de la glucosa por la incubación en 5 ml de recién preparada previamente calentada (37 ° C) de glucosa en un medio libre, se suministra con dializados 10% de FCS y 4 mM piruvato sódico durante 5-15 minutos. </li><li> Vuelva a colocar el medio del hambre con 1 ml de pre-calentado (37 ° C) de glucosa en un medio libre con 400 Ci de [2 - 3 H] marcada con manosa (menor concentración de 65 Ci / ml se utiliza para el etiquetado de las glicoproteínas total), e incubar las células en las condiciones de cultivo de tejido normal durante 1 hora. </li><li> Eliminar el medio de etiquetado de cada muestra, y con cuidado añadir 2 ml de PBS a 4 ° C para las muestras correspondientes a pulso y colocarlos en hielo (estas muestras se denominan pulsos), mientras que las muestras correspondientes a la persecución que ser enjuagados tres veces con 2 ml de pre-calentado (37 ° C) medio normal de cultivo completo, y luego se colocan en una incubadora de CO 2 a 37 ° C con 5 ml de pre-calentado medio habitual para los períodos de persecución deseado. </li><li> Enjuague las muestras de pulso (previamente colocado en hielo) 3 veces con 2 ml de helado de PBS. Las células se raspa el plato en 2 ml de PBS utilizando un rascador de células, y se coloca en un tubo Eppendorf de 2 ml. </li><li> Corto giro de las células a 16000xg (06.10 segundos), descartar el sobrenadante y congelar el sedimento celular a -80 ° C. </li><li> Siga los pasos 5 y 6 también para las muestras de persecución en el final del tiempo de persecución. </li><li> Eliminar las células del congelador y lisar ellos por la adición de 300 l de tampón A, vortex brevemente e incubar durante 20 min en hielo, o en el caso del análisis de las glicoproteínas total, por incubación de 20 minutos sobre el hielo con tampón B, seguido por ultrasonidos (4 tiempos, 10 segundos, con un máximo de amplitud), luego hervir las muestras durante 5 minutos. </li><li> Centrifugar los lisados ​​a 16000xg durante 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf y desechar el sedimento. </li><li> Si el análisis de las glicoproteínas total, proceder a la filtración molecular y deglicosilación (paso 17). Para la inmunoprecipitación de la glicoproteína H2a demostrado aquí, agregar 20l/sample de (Repligen) la proteína A-agarosa 1:01 suspensión y 3 l / muestra de nuestro conejo policlonal de anticuerpos anti H2a para la glicoproteína deseada (en nuestro ejemplo anticuerpos anti-H2a ), el sobrenadante del paso 9. </li><li> Incubar las muestras de 04.16 horas a 4 ° C, mezclando constantemente por la rotación lenta. </li><li> De girar las bolas a 16000xg durante 30 segundos y retirar con cuidado el sobrenadante con vacío. </li><li> Aclarar las cuentas, mediante la adición de 500 l de amortiguación D y agitación. Giro como en el paso 12 y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado 3 veces. </li><li> Añadir 10μl desnaturalización de amortiguación (suministrado con el NEB endo-H kit) a la bolita de cuentas y hervir las muestras durante 5 minutos (cuando las proteínas totales se analizan, el deglicosilación se lleva a cabo en el filtro Microcon, paso 17). </li><li> De girar las bolas (16000xg durante 30 segundos), y la transferencia del sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf. Luego 0.5μl de endo H enzima se añaden a cada muestra, junto con 10 l de tampón de reacción (también suministrado con el kit NEB endo H), y las muestras se incuban a 37 ° C durante 3 horas. </li><li> Para separar los glicanos liberados de las proteínas, la muestra se diluye 5 veces con agua destilada y se coloca en la parte superior de un filtro molecular (Microcon Ultracel YM30), con un 30kDa de corte, luego se centrifuga a 14000Xg durante 3 min. Aplicar 50μl de agua destilada y repetir la centrifugación de las muestras. Este lavado se repite 2 veces más, manteniendo el flujo continuo. </li><li> Si usted está analizando glicoproteínas total, aplicar el sobrenadante de los lisados ​​(desde el paso 9) para el filtro Microcon. Lavar el extracto con 100 l de buffer E, 3 veces por centrifugación repetida en 14000Xg durante 3 min. Añadir 3 l de tampón de reacción 10X endo H y 1,5 l de la enzima endo H al retenido Microcon, y se incuba durante 3 horas a 37 º C. Los glicanos liberados se eluyó con agua desionizada por tres centrifugaciones repetidas, como en el paso 16. </li><li> Si lo desea, retenidos en los pasos 16 y 17, con endo H resistente a las glicoproteínas son incubados con 200mU de F N-glucosidasa en 15 l de tampón C a 37 ° C durante 16 h. Elución con agua destilada se hace como en el paso 16. </li><li> Coloque el tubo que contiene la reacción endo H de flujo continuo (medidas 16 y 17) en un concentrador de SpeedVacY secar las muestras por completo (esto se puede hacer hasta 45 ° C para acelerar este proceso). </li><li> Para preparar las muestras para el HPLC, volver a suspender las bolitas secas en 12 l del solvente HPLC (acetonitrilo: agua, 60:40, 1% de ácido fosfórico). </li><li> Ajustar el dispositivo HPLC (conectado a la columna Spherisorb) a un flujo constante del disolvente (1 ml / min) y presión (un valor en particular entre 1000 y 2000 psi), y colocar un colector de fracciones para cambiar un tubo de cada 1 minuto. </li><li> Cargar las muestras en el dispositivo HPLC e iniciar el colector de fracciones de forma simultánea. </li><li> Recoger 48 fracciones de 1 ml de cada corrida de muestras y de una carrera de una mezcla de oligosacáridos estándar. </li><li> Transferencia de 500 l de cada fracción a un vial de centelleo, y mezclar el contenido con 3 ml de líquido de centelleo soluble en agua. </li><li> La carga de los viales y leer en un contador de centelleo. </li><li> La lectura de la CPM se representa gráficamente como una función del número de fracciones. </li><li> Los valores de cpm en un pico de representar a una especie específica de glicanos de la siguiente manera: las fracciones 18-21 corresponden a M5, M6 a las fracciones 22-26, 27-31 fracciones de M7, M8 a las fracciones 32-35, 36-39 fracciones de M9, fracciones 40-42 a G1M9 y las fracciones 43-45 a G2M9. </li><li> La suma de los valores de CPM para las fracciones dentro de cada pico refleja la cantidad absoluta de una especie de glicanos específicos. Con el fin de compensar el hecho de que las especies que contienen más residuos de manosa adquirir más la etiqueta, la "cantidad relativa molar" de cada especie glicano se calcula como sigue: la cantidad absoluta de cada especie glicano se divide por el número de residuos de manosa que contiene . Este valor se divide por la suma de las cantidades molares relativas de todas las especies de glicano obtenidos para obtener el "por ciento del total" para cada especie de glicanos específicos. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Lanzado con endo H (cpm) una </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Lanzado con N-glucosidasa F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glicoproteínas en retenido (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosacáridos en retenido (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosacáridos en retenido (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Análisis de la liberación de las cadenas de azúcar en la N-vinculada con deglycosidases y de la presencia de dolichol-oligosacáridos en las muestras de la glicoproteína. Se aplicó el procedimiento de pulso perseguir a un lisado de células NIH 3T3. Después de la filtración Microcon, denominado N-oligosacáridos fueron puestos en libertad, principalmente con endo H después del pulso de etiquetado (tipo manosa alta) y con un tratamiento adicional con F N-glucosidasa después de un período de persecución, que corresponden al tipo complejo (Golgi procesados ​​glicanos), endo H resistente oligosacáridos. Este análisis cuantitativo determinó que dolichol-oligosacáridos, representaron una fracción insignificante de la etiqueta en el producto retenido inicial. Notas: <ol class="lalpha"><li> Células NIH 3T3 fueron pulso marcado con [2 - 3 H] manosa y persiguió con medio completo. Después de la lisis celular y la filtración a través de Microcon YM30 de alta manosa N-oligosacáridos fueron puestos en libertad de retenidos por la incubación con endo H. </li><li> Endo H-resistente material retenidos Microcon de (a) se incubó con F N-glucosidasa y puesto en libertad oligosacáridos se mide en un contador de centelleo. </li><li> Retenidos Microcon obtenido como en (a) antes del tratamiento endo H, se extrajeron cuatro veces con cloroformo: metanol: agua 10:10:03 para eliminar glicolípidos precursor, y el material no extraído disuelve en NaOH 1N y se cuentan en un contador de centelleo. </li><li> Dolichol-oligosacáridos fueron purificados a partir de extractos de (c) como se describe en 1 y en un contador de centelleo. </li><li> Promedio de 3 por ciento de los experimentos de dolichol-oligosacáridos (d) del total de cpm en retenido (c + d). </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pulso-caza análisis del total de las glicoproteínas NIH 3T3 en células no tratadas y la inhibición proteasomal Después de 1 hora de pulso con el etiquetado. [2 - 3 H] se obtuvo un perfil de espera con algunos glucosiladaprecursores restantes (Glc Man 9 GlcNAc 2 2 (G2M9) y G1M9), pero la mayor parte de la etiqueta presente en M9 y M8 especies, siendo este último el resultado de la poda de todos los niveles de glucosa y un residuo de manosa (Figura 1 A). No precursores libres pequeña manosa o de otro tipo se han detectado, lo que demuestra la minuciosidad de la purificación. Después de una larga persecución en vez 8h había más extensa de recorte para M7-6 y una pequeña cantidad de M5, pero las principales especies sigue siendo M9 y M8 (Figura 1 B). Si la persecución se hizo en presencia de un inhibidor de la proteasomal (30 M MG-132), sólo había una acumulación de menor importancia de estas mismas especies recortadas (Figura 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. El análisis cuantitativo de las cadenas de azúcar de un sustrato ERAD en comparación con las glicoproteínas total. (A) En un experimento similar a la de la Figura 1, en ​​relación cantidades molares de cada especie de oligosacáridos se calcularon con base en el contenido de manosa. Hemos convertido los valores de cpm obtenidos para cada especie de glicanos, el porcentaje de cada especie en relación con la suma total de las cantidades molares relativas de todas las especies presentes se representó posteriormente en función del tiempo de persecución por un promedio de dos experimentos. (B) similares (A), excepto que glicanos liberados de la ERAD sustrato ASGPR H2a fueron analizadas después de que el etiquetado de pulso y caza de hasta 4 horas, en la presencia o ausencia del inhibidor de la proteasomal MG-132. (C) Los valores de 4 horas de persecución en la presencia de MG-132 de (A) y (B) se comparan para ASGPR H2a y la piscina de la glicoproteína. (D) Esquema de la cadena de azúcar unidos a N procesos de corte en la sala de emergencias. Azúcar recortar los procesos que conducen a la M6-5 ligada a las proteínas (R) que se dirigen a ERAD en comparación con el M9-8 en los que salen al aparato de Golgi y más allá. Los resultados indican que el proceso de ERAD se asocia con la manosa corte de la N-glicanos para producir especies con 5-6 residuos de manosa restantes.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

El análisis del pulso-caza de los glicanos en las células vivas con una separación de HPLC proporciona un método para el estudio de la dinámica de los oligosacáridos alteraciones estructurales a lo largo de la vida de una glicoproteína. Hay una creciente evidencia de que tales alteraciones están involucrados en la producción de las señales para doblar ER, control de calidad y sistemas de tráfico 2-5. El método se puede aplicar no sólo para una glicoproteína de interés específico, sino también para analizar la...

<table><tbody><tr><td>Controlador del sistema multisolvente 600E</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo LiChrosolv (grado gradiente para cromatografía líquida)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K o Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 o 4208</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador 5301, incl. rotor de ángulo fijo para 48 x 1,5 / 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>F dializado&amp;#8211;suero de ternera</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Águila modificada&amp;rsquo;s Medio</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modificado de Eagle&amp;rsquo;s Medio - sin glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>sal disódica de EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Kit Endo Hf (1.000.000 unidades/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;suero de feto bovino (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>colector de fracciones Frac-100</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de conteo por centelleo líquido LS 6500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Manosa, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (Actividad específica: 15-30 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-carbobenzoil-leucil-leucil-leucinal (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glicosidasa F (1000 unidades/ml)</td><td>Grupo Roche</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-octilglucósido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>Células NIH 3T3</td><td>Colección Americana de Cultivos Tipo</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido fosfórico (49-51 %, para HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de Sepharosa con proteína A</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo anti-H2 carboxi-terminal &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sodio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Columna Spherisorb NH2, 5 &amp;mu;m, 4,6 x 250 mm</td><td>Aguas</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Procesadores ultrasónicos Vibra-Cell VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;fuerte&gt;Tampón A:&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100, 0,5% p/v desoxicolato sódico, inhibidor de proteasas en cóctel al 2% v/v en PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;fuerte&gt;Tampón B:&lt;/strong&gt; 0,5% p/v SDS, cóctel de inhibidores de proteasas al 2% v/v en PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;fuerte&gt;Tampón C:&lt;/strong&gt; Tampón de reacción de N-glicosidasa F: 200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5 % N-octilglucósido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 que expresan establemente H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;fuerte&gt;Tampón D:&lt;/strong&gt; 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v desoxicolato sódico, 0,5% p/v SDS, inhibidor de proteasas en cóctel al 2% v/v en PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;fuerte&gt;Tampón E:&lt;/strong&gt; 0,5% p/v SDS, 1% v/v 2-mercaptoetanol&amp;#8211;etanol, coctel de inhibidores de proteasas al 2 % v/v en PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a n de glicoproteínas en células de mamífero

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

La unión de la Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Hombre<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</subPrecursor&gt; oligosacáridos a polipéptidos nacientes en la sala de emergencia es una modificación común para proteínas secretoras. A pesar de esta modificación fue implicado en numerosos procesos biológicos, otros aspectos de su función están surgiendo, con la evidencia reciente de su papel en la producción de señales para el control de la calidad de la glicoproteína y la trata. Por lo tanto, fenómenos relacionados con la N-glicanos ligados y su tratamiento están siendo intensamente investigados. Los métodos que se han desarrollado recientemente para el análisis de proteómica han mejorado mucho la caracterización de la glicoproteína N-glicanos ligados. Sin embargo, no proporcionar información sobre la dinámica de la cadena de elaboración de azúcar en cuestión. Para ello, el etiquetado y el pulso-caza protocolos de análisis que se utilizan suelen ser complejos y dan rendimientos muy bajos. Se describe aquí un método sencillo para el aislamiento y el análisis de metabólicamente etiquetados N-oligosacáridos. El protocolo se basa en el etiquetado de las células con [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] manosa lisis, la desnaturalización y la liberación enzimática de los oligosacáridos de cualquiera de una proteína específica immunoprecipitated de interés o de la piscina glicoproteína en general por los tratamientos secuenciales con endo H y N-glucosidasa F, seguido por filtración molecular (Amicon). En este método, los oligosacáridos aislados servir como insumo para el análisis por HPLC, que permite la discriminación entre las diversas estructuras de glicanos en función del número de unidades de monosacáridos que los componen, con una resolución de un monosacárido individual. El uso de este método hemos sido capaces de estudio de alta manosa unidos a N perfiles de oligosacáridos de glicoproteínas total de células después del pulso de la Caza en condiciones normales y en la inhibición del proteosoma. Estos perfiles fueron comparados con los obtenidos de una ER-immunoprecipitated asociados degradación (ERAD) sustrato. Nuestros resultados sugieren que la mayoría de los celulares NIH 3T3 glicoproteínas son relativamente estables y que la mayoría de los oligosacáridos se recortan para el hombre<sub&gt; 9.8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. En contraste, los sustratos inestables ERAD se recortan para el hombre<sub&gt; 5.6</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Y glicoproteínas teniendo estas especies se acumulan en la inhibición de la degradación proteasomal.

Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

La unión del oligosacárido precursor Glc3Man9GlcNAc2 a las polipéptidos nacientes en el RE es una modificación común para las proteínas secretoras. Aunque...

El análisis de las cadenas de azúcares no ligadas en las glicoproteínas comienza con la marcación de los glicanos y las células con manosa tritiada. El cultivo de pulso se enfría sobre hielo mientras que el cultivo de caza se incuba sin marcador durante un período de caza deseado. A continuación, las muestras se lisan y una glicoproteína de interés se inmunopurifica, se desnaturaliza y sus glicanos se liberan enzimáticamente.Los oligosacáridos se purifican adicionalmente mediante filtración molecular, que los separa de las proteínas y otros contaminantes mayores de 30 kilodaltons. Los glicanos se separan luego mediante HPLC. La cantidad de cada forma de glicano se determina midiendo la intensidad de la señal radiactiva en cada fracción eluida.Hola, soy Edward Azo del laboratorio de Hi Geraldo Letter Kremer en el Departamento de Investigación Celular e Inmunología de la Universidad de Tel Aviv. También soy del bloque Gerardo Letter Kremer. Y hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento y análisis de oligosacáridos marcados metabólicamente y ligados.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la dinámica del procesamiento de cadenas de azúcar tanto

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Biología

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Se describe un método modificado para el aislamiento de la fracción de membrana a partir de células humanas y de preparación de muestras para la detección de -glycosylation SCAP N y la proteína total mediante el uso de transferencia Western. Se introduce además un método de GFP-etiquetado para monitorear el tráfico de SCAP mediante microscopía confocal. Este protocolo se puede utilizar en los laboratorios de biología regulares.

Análisis de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Y el tráfico en las células humanas

Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) cambian las estructuras y funciones de las proteínas. Los métodos para el enriquecimiento simultáneo de múltiples tipos de PTM pueden maximizar la cobertura en los análisis. Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad seguida de espectrometría de masas para el enriquecimiento y análisis simultáneo de la proteína N-glicosilación y fosforilación en tejidos pancreáticos.

Una estrategia de enriquecimiento de spin-tip para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Aprende el análisis de pulso-caza de glicanos unidos a N en células de mamífero mediante marcaje metabólico con manosa tritiada, liberación enzimática y separación por HPLC. Este método permite estudiar la dinámica temporal de los glicanos en glicoproteínas.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

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