Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

El análisis de las cadenas de azúcares no ligadas en las glicoproteínas comienza con la marcación de los glicanos y las células con manosa tritiada. El cultivo de pulso se enfría sobre hielo mientras que el cultivo de caza se incuba sin marcador durante un período de caza deseado. A continuación, las muestras se lisan y una glicoproteína de interés se inmunopurifica, se desnaturaliza y sus glicanos se liberan enzimáticamente.

Los oligosacáridos se purifican adicionalmente mediante filtración molecular, que los separa de las proteínas y otros contaminantes mayores de 30 kilodaltons. Los glicanos se separan luego mediante HPLC. La cantidad de cada forma de glicano se determina midiendo la intensidad de la señal radiactiva en cada fracción eluida.

Hola, soy Edward Azo del laboratorio de Hi Geraldo Letter Kremer en el Departamento de Investigación Celular e Inmunología de la Universidad de Tel Aviv. También soy del bloque Gerardo Letter Kremer. Y hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento y análisis de oligosacáridos marcados metabólicamente y ligados.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la dinámica del procesamiento de cadenas de azúcar tanto en los pools totales de glicoproteínas celulares como en glicoproteínas individuales. Bien, ahora comencemos. Para iniciar este procedimiento, use células NIH 3T3 cultivadas durante la noche en un plato de 90 milímetros.

Para cada muestra, el cultivo está subconfluente para privar a las células de glucosa; prepare medio fresco sin glucosa dos veces concentrado, suplementado con 20% de SFC dializado y ocho milimolares de piruvato de sodio. Diluya un volumen de la cantidad deseada del medio 2X con un volumen de agua desionizada. Precaliente el medio, luego incube cada muestra celular en cinco mililitros del medio fresco precalentado durante cinco a 15 minutos. Si se requiere un periodo de caza superior a 12 horas, las células deben manipularse en condiciones estériles.

Al final del período de incubación, marque los cultivos correspondientes a las muestras de pulso y caza. Para etiquetar los glúcidos N para el análisis de glicoproteínas mediante inmunoprecipitación, sustituya el medio de privación por un mililitro de medio libre de glucosa precalentado, suplementado con 400 microcurios por mililitro de dos manos marcadas con tritio. Utilice 65 microcurios por mililitro para el etiquetado y análisis de glicoproteínas totales.

Después de reemplazar el medio de inanición, incubar las células en condiciones normales de cultivo celular durante una hora. Al final de la incubación de una hora, retirar el medio de marcado de todas las muestras. Añadir cuidadosamente dos mililitros de PBS a cuatro grados Celsius a las muestras correspondientes al pulso y colocarlas en hielo. Estas muestras se denominan pulsos.

Utilice dos mililitros de medio de cultivo completo normal precalentado. Enjuague las muestras de seguimiento tres veces. Luego agregue cinco mililitros del medio regular precalentado a las células.

Coloque las muestras de caza en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante los períodos de caza deseados. Durante la incubación de las muestras de caza, enjuague las muestras de pulso, que se dejaron en hielo, tres veces con dos mililitros de PBS frío con hielo. Luego, use un raspador celular para desprender las células de la placa.

En dos mililitros de PBS, coloque las células liberadas en un tubo EOR de dos mililitros. Centrifugue las células a 16.000 ×g durante seis a 10 segundos para separar el sobrenadante y congele el sedimento celular a menos 80 grados Celsius. Cuando finalice la incubación de las muestras de seguimiento, enjuáguelas.

Centrifugar y almacenar como se acaba de mostrar para las muestras de pulso. Una vez listo para continuar con la lisis celular, retire las células del congelador. Para el análisis de IP, lise las células añadiendo 300 microlitros de tampón.

Vortexéese brevemente e incúbese durante 20 minutos en hielo. Para el análisis de las muestras de glicoproteínas totales, utilícese 300 microlitros de tampón B. Incúbense las células durante 20 minutos en hielo, seguido de sonicación cuatro veces, 10 segundos cada vez a amplitud máxima. Luego, hiérvanse las muestras durante cinco minutos.

Finalmente, centrifugue todas las lisados a 16.000 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo EOR y deseche el sedimento. Proceda a la inmunoprecipitación (IP) para examinar una proteína de interés mediante la inmunoprecipitación de la glucoproteína H2A mostrada aquí.

Añada 20 µL por muestra de proteína A agro speeds y 3 µL por muestra del anticuerpo policlonal de conejo anti H2A del laboratorio al sobrenadante de las células lisadas. Incube las muestras durante cuatro a 16 horas a 4 °C, mezclando constantemente mediante rotación lenta. Al final de la incubación, centrifugue para sedimentar las perlas y retire cuidadosamente el sobrenadante utilizando vacío; lave las perlas cuatro veces añadiendo 500 µL de tampón T por cada lavado.

Cuatro centrifugaciones para sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante con el fin de liberar las proteínas unidas a las perlas. Añada 10 microlitros de tampón desnaturalizante del kit de endo H al sedimento de perlas y hierva las muestras durante cinco minutos. Centrifugue nuevamente las perlas y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo EOR.

Las proteínas ellu ya están listas para la desglicosilación. Los glúcidos se liberan de las muestras de proteínas IP y totales utilizando la enzima y OH. Para las muestras IP, agregue 0,5 microlitros de la enzima endo H a cada muestra junto con 10 microlitros del tampón de reacción endo H 2x. Incube las muestras a 37 grados Celsius durante tres horas.

Para las glucoproteínas totales, aplique el sobrenadante de los lisados celulares a un filtro MicroCon con un corte de 30 kilodaltones. Lave el extracto de proteína total tres veces con 100 microlitros de tampón E mediante centrifugaciones repetidas a 14.000 G durante tres minutos. Añada tres microlitros de tampón de reacción 10 x endo H y 1,5 microlitros de la enzima endo H al MicroCon, en el lugar donde permanecen las proteínas lavadas, e incube durante tres horas a 37 grados Celsius junto con las muestras de inmunoprecipitación.

Al finalizar la incubación de tres horas, diluya la muestra de IP cinco veces con agua desionizada y colóquela encima de un nuevo filtro MicroCon y centrifugue a 14.000 G durante tres minutos. Proceda a lavar las muestras de proteína total y de IP aplicando 50 microlitros de agua desionizada y centrifugando las muestras. Repita dos veces más. Mantenga el flujo que contiene los glicanos escindidos si se desea, a través de Tates que contienen glicoproteínas resistentes a la endo H. Luego, las glicoproteínas resistentes se incuban con 200 unidades milimétricas de N-glicosidasa F en 15 microlitros de tampón C a 37 grados Celsius durante 16 horas.

La elución con agua desionizada se realiza como se acaba de mostrar. Seque completamente las muestras utilizando un concentrador de vacío con calentamiento hasta 45 grados Celsius para acelerar el proceso. Re suspenda los pellets secos en 12 microlitros del disolvente de HPLC y cargue las muestras en una columna de sphe o amino instalada en el equipo de HPLC.

Analice las muestras según se describe en el protocolo escrito adjunto. Recopile 48 fracciones para cada corrida de muestra. Utilice un contador de centelleo para medir los valores de CPM de las fracciones recopiladas y represente gráficamente la lectura de CPM en función del número de fracción.

Calcule el porcentaje de residuos de manos de todas las especies de glicanos según se describe en el protocolo escrito adjunto. A continuación se muestran resultados representativos del análisis de cadenas de azúcares de glicoproteínas totales a partir de una muestra con marcaje pulsado de una hora. La lectura de CPM de las fracciones de HPLC se representa en función del número de fracción en el perfil resultante.

En cada pico se representa una especie específica de glicano identificada mediante una corrida de HPLC de patrones conocidos de glicanos. Para cada especie de glicano, su porcentaje molar respecto al total de glicanos se grafica como una función del tiempo de caza. El tiempo mostrado aquí corresponde a un análisis de una glicoproteína mal plegada específica, aislada por inmunoprecipitación a partir de una muestra tratada con el inhibidor del proteasoma MG 1 32.

La especie de glicano recortado M cinco seis se acumula durante el período de caza, lo que lleva a la conclusión de que los oligosacáridos presentes en una proteína mal plegada experimentan un extenso recorte de manosa antes de la degradación. Esto contrasta con los oligosacáridos presentes en las glicoproteínas totales de muestras tratadas de la misma manera. Aquí, M nueve ocho permanece como la especie mayoritaria de glicano durante el período de caza, con solo un ligero aumento en la cantidad de M cinco seis. Esto lleva a la conclusión de que solo una pequeña fracción del conjunto total de glicoproteínas es dirigida hacia la degradación de proteínas asociada al retículo endoplásmico.

Rad. abreviado. Como se explica más adelante en el protocolo escrito adjunto, acabamos de mostrarle cómo utilizar una combinación de palase en células vivas y análisis por HPLC para seguir la dinámica de la composición de oligosacáridos no unidos durante la vida del glicoproteína. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar contaminaciones de las muestras de reemplazo con trazas de medios radiactivos, lo que resultará en la marcación no deseada de los glicanos durante los períodos de reemplazo en la separación por tamaño.

También es importante ajustar el HPLC a una presión constante para garantizar la consistencia en la fraccionación de los glicoconjugados. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.