Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Este protocolo permite la detección de una beta maltasa en tejido cortical humano. Primero, el tejido homogenizado se sonicó con sonda y se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, las muestras se redujeron, se hirvieron en tampón SDS y se cargaron en un poli acrilamida.

Las proteínas del gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y la membrana se calienta al vapor en solución salina tamponada con fosfato. Finalmente, en un agitador orbital, la membrana se incuba durante la noche en anticuerpo primario, seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP y luego con reactivo de luminol y peróxido antes de exponerse a una película de rayos X. Hola, soy Rebecca Rosen del laboratorio de Larry Walker en el Departamento de Neurociencia del Centro Nacional de Investigación Primatológica Yerkes en la Universidad Emory.

Hoy les mostraremos cómo detectar multímeros de Abeta y homógenos corticales mediante electroforesis en gel de SDS e inmunodetección con recuperación de antígenos inducida por calor. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los niveles y la distribución de distintos multímeros de Abeta en tejidos corticales sin fijar de humanos con enfermedad de Alzheimer y primates no humanos de edad avanzada. Así que comencemos.

Comience con alrededor de cien miligramos de tejido cortical sin fijar y homogenice hacia abajo en aproximadamente 400 microlitros de tampón frío con hielo, utilizando aproximadamente 30 movimientos completos del pistilo. Para una concentración del 20% peso por volumen, la relación entre el peso del tejido y el volumen del tampón debe ser de un miligramo por cada cuatro microlitros. Después de la homogenización, transfiera los homogenados a un tubo de polipropileno de cuatro mililitros y someta a sonicación con sonda tres veces durante cinco segundos a potencia cinco.

Después de la sonicación, transfiera los homogenatos a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 3000 ×g; retire cuidadosamente los sobrenadantes clarificados y almacene alícuotas de 50 microlitros de estos extractos a menos 80 grados Celsius hasta su uso. A continuación, determine la concentración total de proteína en alícuotas recién descongeladas de homogenatos clarificados utilizando un ensayo ácido pirogálico o BCA según las instrucciones del fabricante. Los homogenatos corticales al 20% clarificados deben tener una concentración de proteína mayor a cinco microgramos por microlitro y, por lo tanto, pueden diluirse de uno a 10 para estar dentro del rango del lector de placas. Para el ensayo BCA, prepare reacciones de muestras desnaturalizantes con las mismas alícuotas de homogenatos clarificados.

Utilice aproximadamente de 50 a 60 microgramos de proteína total y ajuste el volumen de los homogenados corticales en consecuencia, de modo que cada uno contenga la misma cantidad total de proteína. Prepare las muestras hasta un volumen total de 25 microlitros para cada gel del 10 al 20 % trice que se vaya a correr. Para cada gel, prepare un control positivo de 10 a cien nanogramos de péptido sintético a beta 40 o a beta 42 diluido en 1 X PBS hasta 10 microlitros, con 12,5 microlitros de tampón muestral 2 X SDS y 2,5 microlitros de agente reductor 10 X.

Después de preparar todas las muestras, incluido un vórtex de control beta durante cinco a 10 segundos y calentar en un baño seco a 100 grados Celsius durante cinco minutos, centrifugar rápidamente todos los tubos para eliminar la condensación en la tapa. Cargar las muestras en un gel sumergido en tampón de electroforesis SDS al tris en una cámara de electroforesis y cargar al menos un pocillo con 10 microlitros de un marcador de peso molecular sin diluir. Correr el gel a un voltaje constante de 125 voltios durante aproximadamente 90 minutos o hasta que el marcador de cuatro kilo Daltons esté a cerca de un centímetro del fondo del gel.

Retire cuidadosamente los geles de los estuches de plástico y arme el sándwich de transferencia según las instrucciones del fabricante. Humedezca previamente las almohadillas de transferencia y señale las membranas de nitrocelulosa de micrómetro con tampón de tris-glicina. Transfiera el tampón y elimine cualquier burbuja de las almohadillas de transferencia o del sándwich formado por papel de filtro y membrana.

Llene la cámara interna del aparato de transferencia con tampón de transferencia y la cámara externa con agua destilada. Realice la transferencia durante dos o tres horas a una amperaje constante de 25 miliamperios. Cuando la transferencia haya finalizado, desarme el sándwich y coloque los geles en un recipiente lleno de agua destilada y las membranas en un recipiente con un XPBS para todos los pasos del protocolo.

Asegúrese de que los geles y las membranas estén completamente cubiertos con líquido para evitar que se sequen. Para visualizar la eficiencia de la transferencia de proteínas, tiña los geles con tinte azul seguro sin diluir durante aproximadamente una hora de tiempo de incubación y las membranas con tinte rojo PON S al uno x durante unos cinco minutos. Según las instrucciones del fabricante, este tinción no interferirá con el inmunotransferido.

Si la tinción revela una transferencia ineficiente de proteínas, modifique el tiempo de transferencia en el paso tres para la recuperación del antígeno. En un vaporizador, selle térmicamente la membrana en una bolsa plástica CapEx de alta resistencia llena con aproximadamente 50 mililitros de un XPBS a temperatura ambiente. Coloque la bolsa en posición plana dentro de un vaporizador precalentado a 100 grados Celsius; una vez que la bolsa comience a expandirse, incube durante 15 minutos adicionales antes de retirarla del vaporizador.

Deje que la membrana se enfríe lentamente antes de retirarla del sobre para evitar arrugas excesivas a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente la membrana del sobre y enjuáguela durante cinco minutos con un XPBS en un agitador orbital, seguido de un enjuague de cinco minutos en TBST en un agitador orbital. A continuación, incube la membrana en solución bloqueante durante una hora en un agitador orbital sin enjuagar, y luego transfiera la membrana a un recipiente que contenga el anticuerpo primario seis E 10, que es específico para la región terminal A beta, diluido de uno a 1000 hasta uno a 5.000 en solución bloqueante.

Incubar en un agitador orbital a temperatura ambiente durante una hora y luego de 24 a 48 horas con agitación a cuatro grados Celsius. Después de un enjuague rápido, lavar la membrana durante 30 minutos. En TBST, realizar tres enjuagues de 10 minutos cada uno en un agitador orbital.

Incube la membrana en anticuerpo secundario conjugado con HRP diluido al uno a 10,000 en solución bloqueante durante 90 minutos en agitador a temperatura ambiente. En este protocolo utilizamos anticuerpo anti-US de oveja. Nuevamente, enjuague la membrana durante 30 minutos en TBST, comenzando con un enjuague rápido seguido de tres enjuagues de 10 minutos cada uno en un agitador orbital.

Después del último lavado, incube la membrana en reactivo ECL Super Signal West Pico recién preparado y sin diluir durante cinco minutos. En el agitador a alta velocidad, retire la membrana y elimine el exceso de reactivo. Utilizando papel filtro libre de pelusas o toallitas Kim, coloque la membrana en una cubeta de película entre protectores plásticos, y elimine el exceso adicional de reactivo Super Signal con toallitas Kim sin polvo.

Si es necesario, exponer la película Kodak Biomax MR a intervalos de 30 segundos, hasta un máximo de 30 minutos, y revelarla en un revelador para películas. Transcurridos cinco minutos, las bandas del monómero A beta probablemente estarán saturadas en este experimento. Se analizaron homogenados clarificados que contenían 50 microgramos de proteína total procedentes de siete sujetos humanos, para detectar la presencia de beta amiloide multimérica o A beta, así como de la proteína precursora de amiloide o APP, la proteína transmembrana de la cual se escinde el péptido A beta.

Aquí mostramos imágenes representativas de un experimento de inmunotransferencia A beta a PP con exposiciones de 30 minutos y cinco minutos. Una exposición de 30 minutos permite visualizar el dímero, trímero, tetrámero y las bandas de mayor peso molecular u oligómeros de Abeta, mucho más tenues, pero sobreexpone las otras bandas con un tiempo de exposición de cinco minutos. La misma banda de tetrámero está presente, aunque débil, y permite visualizar claramente las otras bandas.

Los homogenados corticales de sujetos con enfermedad de Alzheimer o EA se observan en las bandas uno a tres; un sujeto humano diagnosticado con demencia con cuerpos de Lewy o DCL y enfermedad de Alzheimer se observa en la banda cuatro; casos de demencia con cuerpos de Lewy se observan en las bandas cinco y seis; y un caso control humano anciano no demenciado, en la banda siete. La inmunodetección con el anticuerpo 6C10 reveló monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros y APP en todos los casos de Alzheimer, así como abundantes formas de peso molecular más alto de agregados de Aβ en dos casos de EA, lo que indica la heterogeneidad de la beta-amiloidogénesis entre sujetos humanos sintéticos.

Una beta 40 en la banda derecha confirma la identidad de las bandas de menor peso molecular. Acabamos de mostrarle un experimento de inmunotransferencia SDS-PAGE para identificar multímeros de beta en homogenatos de tejido no fijado provenientes de cerebros de humanos con enfermedades neurodegenerativas. Al realizar este procedimiento, es importante preparar homogenados corticales altamente concentrados para su separación mediante electroforesis en gel, con el fin de revelar multímeros de Abeta de baja abundancia.

También es importante realizar la recuperación de epítopos de antígenos inducida por calor antes de la inmunodetección con un anticuerpo contra el péptido Abeta. La recuperación de antígenos ayuda a revelar epítopos de Abeta oscurecidos para lograr una unión óptima del anticuerpo durante la inmunodetección. Cualquier vaporizador, microondas o baño de agua que mantenga 100 grados Celsius será suficiente.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.