Análisis eucariotas perfil Polyribosome
15 de junio de 2010
En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.
El objetivo general de este procedimiento es separar y comparar las fracciones de monozomas y polirribosomas provenientes de lisados celulares. Esto se logra primero cultivando las células de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el lisado celular.
El tercer paso del procedimiento consiste en centrifugar el lisado a través de un gradiente de sacarosa. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente y visualizar las diferentes poblaciones ribosomales mediante un trazado de UV. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cambios en la traducción bajo distintas condiciones experimentales mediante el análisis del perfil de polirribosomas.
Hola, soy Anthony Esposito del laboratorio de la doctora Terry Goss Kinsey en el departamento de Genética Molecular, Microbiología e Inmunología en UMD y en la Escuela de Medicina J Robert Wood Johnson. Y yo soy Marcus Lewis, también del laboratorio McKinsey aquí en R-W-J-M-S.
Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis de polirribosomas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar alteraciones en la síntesis de proteínas que surgen de mutaciones o factores ambientales. Comencemos. Sacarosa.
Los gradientes deben prepararse un día antes de su uso para permitir que se vuelvan continuos. Mezcle los volúmenes adecuados de las soluciones madre de sacarosa al 7 % y al 47 % para obtener 48 mililitros de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa: 7 %, 17 %, 27 %, 37 % y 47 %. Añada DTT 1 M a cada solución de sacarosa hasta alcanzar una concentración final de 1 milimolar. Para verter los gradientes, conecte una pipeta tipo espagueti a una jeringa de 20 mililitros asegurando y sellando con película de parafina.
Agregue siete mililitros de sacarosa al 7% en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga de poliamida de una pulgada por 3,5 pulgadas. A continuación, agregue siete mililitros de solución de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7% colocando la punta de la pipeta Pasteur cerca del fondo del tubo e introduciendo lentamente la solución. Debe tardar no menos de 20 segundos en verter cada capa.
Repita con siete mililitros de cada solución de sacarosa al 27%, 37% y 47% cuando el gradiente haya sido formado. Debe observar líneas nítidas entre las capas, lo que indica que ha ocurrido una mezcla mínima. Almacene todos los gradientes a cuatro grados Celsius durante la noche, junto con los rotores, botellas y tubos que se utilizarán para recolectar las muestras.
Para preparar extractos a partir de células de levadura, comience por cultivar cien de 25 mililitros de cultivo de levadura hasta un OD 600 de 0,8 a 1,0. Añada cicloheida al cultivo hasta una concentración final de 100 microgramos por mililitro y continúe agitando a 30 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, vierta el cultivo en un frasco para centrífuga de 250 mililitros y llénelo con hielo.
Mantenga todo en hielo a partir de este momento; centrifugue a 8.000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda el precipitado en 10 mililitros de tampón de lisis frío con hielo y transfiera a tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 5.900 × g durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda.
Suspenda el sedimento en 0,5 mililitros de tampón de lisis. Transfiera la suspensión a un tubo microfuga de 1,5 mililitros y luego agregue 0,5 mililitros de perlas de vidrio ácido-lavadas y horneadas frías. Vortexee las células durante cuatro intervalos de 32 segundos, enfriando el tubo en hielo durante 30 segundos entre cada intervalo.
Luego, agregue otros 0,5 mililitros de tampón de lisis al tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 5.000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.
Por último, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcéntrifugo de 1,5 mililitros. El extracto puede almacenarse a menos 80 grados Celsius para transferir el lisado al gradiente de sacarosa. Coloque la punta de la pipeta contra la pared del tubo cerca de la superficie del gradiente y depósitelo suavemente encima del gradiente.
Para un gradiente de 35 mililitros, normalmente se carga 500 microlitros de lisado. Utilizando pinzas, baje cuidadosamente el gradiente en la cubeta de un rotor de cabezal oscilante. Centrifugue los gradientes a 100.000 veces la gravedad durante cuatro horas a cuatro grados Celsius.
Aproximadamente 30 minutos antes de finalizar la centrifugación de cuatro horas, coloque la aguja en el perforador de tubos y conecte el bolígrafo al monitor en línea de absorbancia y fluorescencia. Encienda la alimentación del monitor de absorbancia para permitir que se alcance una línea base estable antes de analizar las muestras.
La adquisición electrónica del perfil PolyZone puede obtenerse fácilmente en tiempo real conectando una unidad de adquisición de datos DI 1 48 U. Al registrador de gráficos, llene la bomba de jeringa con 50 mililitros de nueces de florina utilizando la configuración rápida de flujo inverso. Asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes.
Conecte la manguera de la jeringa al perforador de tubos. Encienda brevemente el flujo de Flo inert en dirección directa a seis mililitros por minuto. Para eliminar cualquier burbuja de aire de la manguera, coloque una serie de tubos debajo de la manguera al final de la celda de flujo para recoger el exceso de muestra.
Prepare un recipiente con hielo que tenga un hueco preformado para sostener el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa. Cuando finalice la centrifugación de cuatro horas, retire cuidadosamente los tubos de centrífuga del rotor de la centrífuga y colóquelos sobre hielo, teniendo cuidado de no alterar los gradientes.
Para analizar los extractos celulares, coloque el tubo de gradiente en el perforador de tubos y conecte la parte superior del tubo a la salida y asegúrelo. Eleve la plataforma inferior hacia el tubo de centrífuga para que la aguja atraviese la base del tubo. Inicie el flujo de Florin alert en dirección directa a seis mililitros por minuto.
Una vez que el flujo haya comenzado a entrar en el tubo, supervise el movimiento de la aguja en el monitor de absorbancia UV en línea. Cuando la aguja comience a moverse, active el movimiento del registro a una velocidad de 60. Cuando se haya alcanzado el final del perfil de polirribosomas, detenga el flujo de Flo inert hacia el tubo de centrífuga y pare el movimiento del registro en el monitor de absorbancia y fluorescencia.
Retraiga el Flo inerte desde el tubo de centrífuga hacia la jeringa iniciando el flujo en dirección inversa a una velocidad rápida, asegurándose de no aspirar sacarosa del tubo hacia la jeringa. Desenrosque el tubo de centrífuga del perforador de tubos, baje la aguja y retire el tubo. A continuación se muestra un trazado representativo de un extracto de ribosomas preparado a partir de levadura en presencia de cicloheximida.
Se indican los picos de absorbancia UV que contienen polirribosomas y ribosomas A TS 60 s y 40 s. Acabamos de mostrarle cómo realizar el análisis de polirribosomas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente, manteniendo las muestras frías y libres de ARN.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte en sus experimentos.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para extraer ribosomas en proceso de traducción de células eucariotas, lo que permite el análisis de diferentes poblaciones ribosomales. El método consiste en separar los ribosomas en monosomas y polirribosomas mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa, lo cual es esencial para estudiar la regulación de la traducción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética
Antecedentes
- Comprender la función del ribosoma es fundamental para estudiar la síntesis de proteínas.
- El perfilado de polirribosomas proporciona información sobre la regulación de la traducción.
- Las técnicas de extracción de ribosomas son fundamentales en la investigación de biología molecular.
- Los factores ambientales y las mutaciones pueden alterar la síntesis de proteínas.
Objetivo del estudio
- Separar y comparar fracciones de monorribosomas y polirribosomas provenientes de lisados celulares.
- Visualizar diferentes poblaciones ribosomales mediante rastreo con UV.
- Analizar cambios en la traducción bajo diversas condiciones experimentales.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células eucariotas y preparación de lisados celulares.
- Centrifugación mediante un gradiente de sacarosa.
- Faccionamiento del gradiente para aislar poblaciones ribosomales.
- Visualización de perfiles ribosomales mediante monitoreo de absorbancia UV.
Resultados principales
- Separación exitosa de monosomas y polirribosomas.
- Visualización clara de las poblaciones ribosomales mediante rastreo de UV.
- Análisis de la regulación de la traducción bajo diferentes condiciones.
- Información sobre el impacto de las mutaciones en la síntesis de proteínas.
Conclusiones
- El protocolo es un estándar de oro para estudiar la regulación de la traducción.
- Permite a los investigadores analizar eficazmente la dinámica ribosómica.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos moleculares de la traducción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis del perfil de polirribosomas permite a los equipos de biofármacos investigar los mecanismos de control traduccional y detectar defectos en la síntesis de proteínas en puntos críticos de inflexión del descubrimiento. Este método proporciona información cuantitativa sobre la traducción global y específica de transcritos, respaldando la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista. Su adaptabilidad a diversos sistemas eucariotas garantiza una relevancia amplia para carteras en investigación y desarrollo de etapa temprana e investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación directa de la regulación traduccional bajo perturbaciones genéticas o ambientales.
- Apoya la desestimación mecanicista al distinguir defectos en la iniciación frente a la elongación/terminación.
- Facilita la validación funcional del blanco al cuantificar cambios en las relaciones polirribosoma-a-monosoma.
- Proporciona una plataforma para evaluar el impacto de intervenciones candidatas sobre la síntesis de proteínas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona lecturas cuantitativas validadas del compromiso ribosómico para la estandarización de ensayos.
- Permite la fraccionamiento reproducible y la detección basada en UV de poblaciones ribosómicas.
- Prepara extractos biológicos adecuados para flujos de trabajo de análisis de ARNm o proteínas posteriores.
- Facilita la cribado de compuestos que modulan la maquinaria de traducción o las vías reguladoras.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relaciona el descubrimiento de biomarcadores traducibles con conocimientos mecanicistas sobre la regulación de la síntesis proteica.
- Asegura la continuidad desde modelos celulares hasta sistemas preclínicos mediante la adaptación de protocolos en especies eucariotas.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al revelar defectos traduccionales asociados a modelos de enfermedad.
- Proporciona un contexto mecanicista para los fenotipos observados en estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El perfilado de polirribosomas se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la interrogación guiada por hipótesis de la traducción, apoyando tanto la validación de objetivos como la identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la producción traduccional y aclara los mecanismos reguladores específicos de la vía.
- Selección: Ofrece fraccionamiento robusto y cuantitativo y salidas de absorbancia UV listas para ensayos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas en tiempo real de poblaciones ribosomales para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta modelos celulares y preclínicos mediante la adaptación de protocolos y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para diversos estudios traduccionales y mecanicistas en múltiples programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de control traduccional.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de extracción, fraccionamiento y detección para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al revelar cuellos de botella traduccionales y apoyar la selección eficiente del portafolio desde el punto de vista financiero.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y modelos basada en la fidelidad traduccional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de ribosomas y técnicas de fraccionamiento en gradiente.
- Exige acceso a instrumentación de ultracentrifugación y de absorbancia UV.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para obtener resultados reproducibles.
- Adaptable a sistemas de levadura y mamíferos con modificaciones del protocolo según sea necesario.
- La integridad de la muestra y condiciones libres de RNasas son fundamentales para obtener resultados confiables.
