Name: Análisis eucariotas perfil Polyribosome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a realizar el perfilado de polirribosomas en células eucariotas mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa. Este método permite separar monosomas y polirribosomas para estudiar la regulación de la traducción proteica.

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Los autores desean agradecer a John Woolford de la base inicial de este método, TGK es apoyado por el NIH GM057483 y AI076245 y la República Popular China se apoya en GM77073.

1. Preparación de los gradientes de sacarosa 7-47% <ol><li> Prepare gradientes de sacarosa un día antes de su uso para permitir que los gradientes de convertirse en permanente. Hacer estéril el 7% y un 47% las soluciones de sacarosa que contiene 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris-acetato de pH 7,0 y 12 mm de MgCl 2 y se almacenan a 4 ° C 1. </li><li> Para 6 gradientes mezcla del 7% y el 47% de sacarosa soluciones madre para 48 ml de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa. Añadir DTT (1M acciones) a cada solución de sacarosa a una concentración final de 1mM. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> La concentración final </td><td> 7% de sacarosa </td><td> 47% de sacarosa </td></tr><tr><td> 7% </td><td> 48 mL </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 17% </td><td> 36 ml </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> 27% </td><td> 24 ml </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td> 37% </td><td> 12 ml </td><td> 36 ml </td></tr><tr><td> 47% </td><td> 0 </td><td> 48 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Con el fin de verter los gradientes, adjunte una pipeta Pasteur a una jeringa de 20 ml de sujeción y cierre con Parafilm o usar una aguja larga. 7 ml de sacarosa al 7% a la parte inferior de 1 x 3.5 "tubo de ultracentrífuga polyallomer. A continuación 7 ml de solución de sacarosa al 17% en la solución de un 7% mediante la colocación de la punta de la pipeta Pasteur cerca del fondo del tubo y la pipeta no mayor a 0.3 mL / seg. Repita con 7 ml cada una de 27%, 37% y 47% soluciones de sacarosa. Usted debe observar las líneas claras entre las capas, lo que indica que un mínimo de mezcla se ha producido. tienda gradientes a 4 ° C durante la noche junto con los discos, botellas de y los tubos que se utilizarán para recoger muestras. </li></ol> 2. Preparación del extracto de levadura <ol><li> Crecen 125 ml de cultivo de levadura a una OD 600 de 0,8 a 1,0. Añadir cicloheximida a la cultura a una concentración final de 100 mg / ml y continuar agitación a 30 ° C durante 15 min. </li><li> Mientras tanto, preparar un tampón de lisis que contiene 80 mg / ml de cicloheximida, 200 heparina mg / ml, 0,2% DEPC, y 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30 mM MgCl 2. Mantenga todo en hielo a partir de ahora. </li><li> Vierta la cultura en una botella de 250 ml de centrífuga y se llenan de hielo. Centrifugar a 8000 xg (7.250 rpm en un rotor de SLA-1500) durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento una vez con 10 ml de solución amortiguadora de lisis fría y la transferencia de tubos de 15 ml de polipropileno. Centrifugar a 5900 xg (~ 6000 rpm en un rotor de SLA-600TC) durante 3 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de tampón de lisis, traslado al tubo de 1,5 ml y añadir 0,5 ml de cuentas refrigerados, horno de vidrio lavado con ácido. Vórtice de las células durante cuatro intervalos de 30 segundos, enfriar el tubo en hielo durante 30 segundos entre cada intervalo. Añadir otro 0,5 ml de solución amortiguadora de lisis en el tubo de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga (14.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5417R) por 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Retire 10 l de un tubo separado para determinar la DO 260 / DO 280 ratio (véase el paso 3.1). Extractos de almacenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Preparación de extractos de células de mamíferos <ol><li> Para células adherentes, crecer en un plato de 100 mm hasta la confluencia ~ 70%. Usted necesitará un plato de 100 mm por cada 11 ml de gradiente (rendimiento típico es de ~ 20 OD 260 unidades). Escala de la cantidad lineal para los tamaños de gradiente de mayor o menor. De las células no adherentes, de aproximadamente 1 x 10 7 células son necesarias por gradiente de 11 ml. </li><li> Antes de la lisis, añadir cicloheximida a 100 mg / ml. Se incuba a 37 ° C durante 15 min. Transferencia de las placas de hielo y lavar las células dos veces en PBS enfriado con hielo. Todos los pasos de futuro debe llevarse a cabo a 0-4 º C. </li><li> Eliminar todos los rastros de PBS por aspiración (que las placas de drenaje en una cama inclinada de hielo) y añadir una solución amortiguadora de lisis ml, raspar y la transferencia de pre-enfriado tubo de 1,5 ml. Componentes de tampón de lisis tendrá que ser optimizado para el tipo de célula y las condiciones de crecimiento. Un buffer de partida sería de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml de cicloheximida, 2 mM DTT, y 1 mg / ml de heparina. Las variables clave son las concentraciones de magnesio y cloruro de potasio, así como la inclusión o exclusión de los detergentes no iónicos para mejorar la extracción de polisomas obligado citoesqueleto o de la membrana. Lisis de las células, pasando al 27 de aguja de la jeringa de calibre o dos veces por golpes 10.5 de la homogeneización Dounce con el Tipo B maja. La jeringa o un homogeneizador debe ser pre-enfriado antes de su uso. </li><li> Giran a 14.000 xg durante 5 minutos en microcentrífuga refrigerada. Transferencia de lisado fresco al gradiente de sacarosa (para células de mamíferos esto se hace en tampón de lisis que carecen de Triton X-100 y la heparina, pero de lo contrario como se describe en 1.2 y 1.3) o congelar flash en nitrógeno líquido para su uso posterior. </li></ol> 4. Centrifugación de gradientes <ol><li> Descongele los lisados ​​polyribosome en el hielo. Determinar la concentración de ácido nucleico en el lisado mediante la adición de la muestra de 10 l reservados a 1 ml de agua y la lectura de la DO 260 / DO 280 relación con un espectrofotómetro. Rendimiento típico de un cultivo de levadura de cerveza cultivada como se describe es de 50 unidades de DO. </li><li> Con una pipeta con la punta colocada contra la pared del tubo cerca de la superficie de la pendiente, suave capa de 25 OD 260 unidades del lisado en la parte superior de la pendiente. Para un gradiente de 35 ml 500 l de lisado se carga típicamente. Tampón de lisis se puede utilizar para asegurar que todos los gradientes están cargados con un volumen igual. Una cantidad menor de material de mejor rendimiento de resolución. Con unas pinzas, cuidadosamente baje los gradientes en los cubos de un rotor basculante. </li><li> Centrifugar los gradientes a 100.000 xg (23.000 rpm en un rotor Surespin 630) por 4 horas a 4 ° C. Este protocolo puede ser adaptado para los gradientes de menor volumen. </li></ol> 5. La recopilación de datos y las fracciones <ol><li> Aproximadamente 30 minutos antes de la finalización de la separación de 4 horas coloque la aguja de la perforación del tubo Modelo 184. Coloque el lápiz a la línea de modelo Isco UA-5 Absorbancia / Monitor de fluorescencia. Encienda el monitor de absorción para permitir que una línea de base estable para ser alcanzado antes de analizar las muestras. Electrónicos para la adquisición del perfil de polisomas se puede obtener fácilmente por colocar un dispositivo de DI-148U de adquisición de datos (DATAQ Instruments) para el registro gráfico. Perfiles se puede recoger en tiempo real y se guarda para su posterior anotación usando el software que acompaña WinDaq. </li><li> Llene la bomba de jeringa con 50 ml de Fluorinert utilizando el flujo inverso, de fraguado rápido. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Conecte la manguera de la jeringa en el tubo de perforación y brevemente a su vez en el flujo de Fluorinert a 3 ml / min en dirección hacia adelante para despejar el tubo de burbujas de aire. </li><li> Coloque un vaso de residuos o una serie de tubos de recogida de las fracciones, si debajo de la manguera en el extremo de la celda de flujo para recoger la muestra corriendo. </li><li> Retire con cuidado los tubos de centrifugación polyallomer que contiene el gradiente de sacarosa del rotor de la centrífuga y colocarlos en hielo (pre-forma de los pozos en el hielo con un tubo de vacío para evitar gradientes inquietante). </li><li> Para el análisis de extractos celulares, se coloca el tubo de gradiente en la perforación del tubo. Conecte la parte superior del tubo a la toma y seguro. Levante la etapa final para el tubo de centrífuga de modo que la aguja perfora el fondo del tubo. Una vez que la aguja ha sobresalido a través de la parte inferior del tubo de centrífuga, iniciar el flujo de Fluorinert en la dirección de avance en 6mL/min. </li><li> Una vez que el Fluorinert ha comenzado a fluir en el tubo, vigilar el movimiento de la aguja en el monitor de la absorbancia en línea. Una vez que la aguja comienza a moverse, a su vez en el movimiento gráfico a un ajuste de velocidad de 60. El monitor medirá el diámetro exterior 254 a partir del material libre seguido por la detección de la subunidad ribosómica 40S y continuando a través de complejos polyribosome. Si usted está recogiendo fracciones de ARN o el análisis de proteínas, por lo general 0,2 min se toman fracciones (1 ml). Para el análisis de ARN, las fracciones se deben recoger directamente en tubos con Trizol (Invitrogen), fenol o K SDS / proteinasa, dependiendo del método preferido de extracción. </li><li> Cuando el extremo del perfil polyribosome se ha alcanzado, a su vez el flujo de Fluorinert al tubo de centrífuga y detener el movimiento de la tabla de absorbancia / monitor de fluorescencia. </li><li> Retraer el Fluorinert desde el tubo de centrífuga con la jeringa de inicio del flujo en la dirección contraria a gran velocidad teniendo cuidado de no extraer la sacarosa de la sonda en la jeringa. Desenroscar el tubo de centrífuga de la perforación del tubo, bajar la aguja, y retirar el tubo. </li><li> Repita los pasos 5.5 a 5.8 por cada gradiente de sacarosa. </li><li> Cuando todos los gradientes de sacarosa se han analizado, retraer el Fluorinert de la manguera en la jeringa. Retire cada parte del fraccionador (perforación del tubo y la celda de flujo), incluyendo la manguera de residuos situado en la parte superior y enjuague bien con agua. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rastro Representante de extracto de ribosoma preparada con la cepa de levadura BY4741 (una estera his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) en presencia de cicloheximida. El extracto fue fraccionado ribosomal utilizando un gradiente de sacarosa 7 47% y se analizaron mediante un aparato de bomba de jeringa conectada a un detector de UV. Picos que contienen polirribosomas y 80S, 60S y 40S ribosomas se indican.

<ol><li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li>
<li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA%3A+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA%2Fselenocysteine+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li>
<li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuan%2C+HJ+%22Analysis+of+mRNA+formation+and+function%22">Analysis of mRNA formation and function</a>. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).</li>
<li>Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li>
<li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li>
</ol>

La información obtenida a partir del perfil polyribosome puede proporcionar información valiosa sobre el estado de traslación de la célula. Además, el estado de la asamblea de las subunidades ribosómicas se puede determinar 2. Por ejemplo, la presencia de halfmers y 80 años y mayores picos con un hombro ligeramente a la derecha en el perfil indica una subunidad 40S unido a la espera de unirse subunidad 60S. Realizar el experimento en la ausencia de cicloheximida o inhibidores añadidos otros de elongación permite el análisis de la tasa de escurrimiento, que indica si la elongación se altera 3. Las mismas fracciones son una rica fuente de reactivos para la determinación posterior de la asociación de un ARNm o proteína ribosomal con las subpoblaciones por transferencia de Northern o Western de las fracciones. El número total de mRNAs asociados con los ribosomas activos puede ser determinada a través de un asociado de microarrays 4 o profundo análisis de secuenciación 5. Las asociaciones de proteínas también puede ser estabilizada por la adición apropiada de un entrecruzamiento reactivo 6. Polyribosome análisis de las células de la pena mencionar también como un protocolo distinto en términos de las aparentes dificultades en el establecimiento de las condiciones necesarias para obtener polisomas estable. Los sistemas de amortiguación en la literatura son muy variables 70 a 10, por lo tanto no puede ser un requisito para la optimización del tipo de células específicas de la solución amortiguadora de lisis, o también es posible que el sistema de amortiguación no es tan importante como la atención de interesados ​​en trabajar con lisados ​​frescos se mantienen a temperaturas bajas. A nuestro entender una evaluación sistemática de los parámetros que afectan la formación de polisomas mamíferos no se ha informado.

<table><tbody><tr><td>tubo de ultracentrífuga de polialómero</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td>1 x 3,5 in. (25x89 mm)</td></tr><tr><td>Fluorinert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td>Otras cepas funcionan igual de bien</td></tr></tbody></table>

análisis eucariotas perfil polyribosome

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

La síntesis de proteínas es un proceso complejo celular que está regulada en muchos niveles. Por ejemplo, la traducción global puede ser inhibido en la fase de iniciación o de la fase de alargamiento por una variedad de estreses celulares, tales como aminoácidos hambre o la retirada del factor de crecimiento. Por otra parte, la traducción de ARNm individuales pueden ser reguladas por la localización del ARNm o la presencia de micro ARN afines. Los estudios sobre la síntesis de proteínas a menudo utilizan el análisis polyribosome para arrojar luz sobre los mecanismos de regulación de la traducción o defectos en la síntesis de proteínas. En este ensayo, el ARNm / ribosoma complejos están aislados de las células eucariotas. Un gradiente de densidad de sacarosa separa ARNm unido a los ribosomas múltiple conocido como polirribosomas de ARNm unido a un ribosoma único o monosome. El fraccionamiento de los gradientes permite el aislamiento y la cuantificación de las diferentes poblaciones ribosomal y sus asociados ARNm o proteínas. Las diferencias en la proporción de polirribosomas a monosomes en unas condiciones determinadas puede ser indicativo de los defectos de iniciación de la traducción sea o elongación / terminación. El examen de los ARNm presentes en las fracciones polyribosome puede revelar si la cohorte de ARNm individuales se traducen los cambios en las condiciones experimentales. Además, el montaje de los ribosomas se puede controlar mediante el análisis de los picos de la subunidad ribosomal pequeñas y grandes que también se separan por el gradiente. En este video, se presenta un método para la preparación de extractos crudos de células de levadura ribosomal, la separación del extracto por gradiente de sacarosa y la interpretación de los resultados. Este procedimiento es fácilmente adaptable a las células de mamíferos.

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

La síntesis de proteínas es un proceso celular complejo que se regula en múltiples niveles. Por ejemplo, la traducción global puede inhibirse en la fase de iniciación...

El objetivo general de este procedimiento es separar y comparar las fracciones de monozona y polirribosomas provenientes de lisados celulares. Esto se logra primero cultivando las células de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el lisado celular.El tercer paso del procedimiento consiste en centrifugar el lisado a través de un gradiente de sacarosa. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente y visualizar las diferentes poblaciones ribosomales mediante un trazado de UV. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cambios en la traducción bajo distintas condiciones experimentales mediante el análisis del perfil de polirribosomas.Hola, soy Anthony Esposito del laboratorio de la doctora Terry Goss Kinsey en el departamento de Genética Molecular, Microbiología e Inmunología en UMD y en la Escuela de Medicina J Robert Wood Johnson. Y yo soy Marcus Lewis, también del laboratorio McKinsey aquí en R-W-J-M-S.Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis de polirribosomas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar alteraciones en la síntesis de proteínas que surgen de mutaciones o factores ambientales. Así que comencemos. Sacarosa.Los gradientes deben prepararse un día antes de su uso para permitir que se vuelvan continuos. Mezcle los volúmenes adecuados de las soluciones stock de sacarosa al 7 % y al 47 % para obtener 48 mililitros de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa: 7 %, 17 %, 27 %, 37 % y 47 %. Añada DTT 1 M a cada solución de sacarosa hasta una concentración final de 1 milimolar. Para verter los gradientes, fije una pipeta tipo espagueti a una jeringa de 20 mililitros asegurándola y sellándola con película de parafina.Agregue siete mililitros de sacarosa al 7% en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga de poliamida de una pulgada por 3,5 pulgadas. A continuación, agregue siete mililitros de solución de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7% colocando la punta de la pipeta Pasteur cerca del fondo del tubo e introduciendo lentamente la solución. Debe tardar no menos de 20 segundos en verter cada capa.Repita con siete mililitros de soluciones de sacarosa al 27%, 37% y 47% cuando el gradiente haya sido preparado. Debe observar líneas nítidas entre las capas, lo que indica que ha ocurrido una mezcla mínima. Almacene todos los gradientes a cuatro grados Celsius durante la noche, junto con los rotores, botellas y tubos que se utilizarán para recolectar las muestras.Para preparar extractos a partir de células de levadura, comience por cultivar cien cultivos de 25 mililitros de levadura hasta alcanzar una DO 600 de 0,8 a 1. Añada cicloheximida al cultivo hasta una concentración final de 100 microgramos por mililitro y continúe agitando a 30 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, vierta el cultivo en un frasco para centrífuga de 250 mililitros y llénelo con hielo.Mantenga todo en hielo a partir de este momento; centrifugue a 8.000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda el precipitado en 10 mililitros de tampón de lisis frío con hielo y transfiera a tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 5.900 × g durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda.Suspenda el precipitado en 0,5 mililitros de tampón de lisis. Transfiera la suspensión a un tubo microfuga de 1,5 mililitros y luego agregue 0,5 mililitros de perlas de vidrio lavadas con ácido y horneadas frías. Vortexee las células durante cuatro intervalos de 32 segundos, colocando el tubo sobre hielo durante 30 segundos entre cada intervalo.Luego, agregue otros 0,5 mililitros de tampón de lisis al tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 5.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Por último, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. El extracto puede almacenarse a menos 80 grados Celsius para transferir el lisado al gradiente de sacarosa. Coloque la punta de la pipeta contra la pared del tubo cerca de la superficie del gradiente y depósito suavemente el lisado encima del gradiente.Para un gradiente de 35 mililitros, normalmente se carga 500 microlitros de lisado. Utilizando pinzas, introduzca cuidadosamente el gradiente en la cubeta de un rotor de cubeta oscilante. Centrifugue los gradientes a 100.000 × g durante cuatro horas a cuatro grados Celsius.Aproximadamente 30 minutos antes de finalizar la centrifugación de cuatro horas, coloque la aguja en el perforador de tubos y conecte el bolígrafo al monitor en línea de absorbancia y fluorescencia. Encienda la alimentación del monitor de absorbancia para permitir que se alcance una línea base estable antes de analizar las muestras.La adquisición electrónica del perfil PolyZone puede obtenerse fácilmente en tiempo real conectando una unidad de adquisición de datos DI 1 48 U. Al registrador de gráficos, llene la bomba de jeringa con 50 mililitros de nueces de florina utilizando la configuración rápida de flujo inverso. Asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes.Conecte la manguera de la jeringa al perforador de tubos. Encienda brevemente el flujo de Flo inert en dirección directa a seis mililitros por minuto. Para eliminar cualquier burbuja de aire de la manguera, coloque una serie de tubos debajo de la manguera al final de la celda de flujo para recoger el exceso de muestra.Prepare un cubo de hielo con un hueco preformado para sostener el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa. Cuando finalice la centrifugación de cuatro horas, retire cuidadosamente los tubos de centrífuga del rotor de la centrífuga y colóquelos sobre hielo. Tenga cuidado de no perturbar los gradientes.Para analizar los extractos celulares, coloque el tubo de gradiente en el perforador de tubos y conecte la parte superior del tubo a la salida y asegúrelo. Eleve la plataforma inferior hacia el tubo de centrífuga para que la aguja atraviese la base del tubo. Inicie el flujo de Florin alert en dirección directa a seis mililitros por minuto.Una vez que el flujo haya comenzado a entrar en el tubo, supervise el movimiento de la aguja en el monitor de absorbancia UV en línea. Cuando la aguja comience a moverse, active el movimiento del registro a una velocidad de 60. Cuando se haya alcanzado el final del perfil de polirribosomas, detenga el flujo de Flo inert hacia el tubo de centrífuga y pare el movimiento del registro en el monitor de absorbancia y fluorescencia.Retraiga el Flo inerte desde el tubo de centrífuga hacia la jeringa iniciando el flujo en dirección inversa a una velocidad rápida, asegurándose de no aspirar sacarosa desde el tubo hacia la jeringa. Desenrosque el tubo de centrífuga del perforador de tubos, baje la aguja y retire el tubo. A continuación se muestra un trazado representativo de un extracto de ribosomas preparado a partir de levadura en presencia de cicloheximida.Se indican los picos de absorbancia UV que contienen polirribosomas y ribosomas A TS 60 s y 40 s. Acabamos de mostrarle cómo realizar el análisis de polirribosomas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente, mantener las muestras frías y libres de ARN.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte en sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

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Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

La traducción de ribosomas decodifica tres nucleótidos por codón en péptidos. Su movimiento a lo largo del ARNm, capturado por el perfil de ribosomas, produce las huellas que exhiben una periodicidad de triplete característica. Este protocolo describe cómo usar RiboCode para descifrar esta característica prominente a partir de los datos de perfiles de ribosomas para identificar marcos de lectura abiertos traducidos activamente a nivel de transcriptoma completo.

De novo Identificación de marcos de lectura abiertos traducidos activamente con datos de perfil de ribosomas

Aprende a realizar el perfilado de polirribosomas en células eucariotas mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa. Este método permite separar monosomas y polirribosomas para estudiar la regulación de la traducción proteica.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

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