Análisis eucariotas perfil Polyribosome
15 de junio de 2010
En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.
El objetivo general de este procedimiento es separar y comparar las fracciones de monozona y polirribosoma de los lisados celulares. Esto se logra cultivando primero las células de interés. El segundo paso del procedimiento es preparar el lisado celular.
El tercer paso del procedimiento es centrifugar el lisado a través de un gradiente de sacarosa. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente y visualizar las diferentes poblaciones ribosómicas a través de una traza UV. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la traducción bajo diferentes condiciones experimentales a través del análisis del perfil de polirribosomas.
Hola, soy Anthony Esposito del laboratorio del Dr. Terry Goss Kinsey en el departamento de Genética Molecular, Microbiología e Inmunología de la UMD y la Escuela de Medicina J Robert Wood Johnson. Y yo soy Marcus Lewis. También de McKinsey Lab aquí en R-W-J-M-S.
Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para el análisis de polirribosomas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las alteraciones y la síntesis de proteínas que surgen de mutaciones o factores ambientales. Así que comencemos. Sacarosa.
Los gradientes deben prepararse un día antes de su uso para permitir que los gradientes se vuelvan continuos. Mezcle los volúmenes apropiados de soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% para hacer 48 mililitros de cada una de las siguientes concentraciones de sacarosa, 7%17%27%37% y 47%Agregue un DTT molar a cada solución de sacarosa hasta una concentración final de un milimolar. Para verter los degradados, conecte una pipeta de pasta a una jeringa de 20 mililitros asegurándola y sellándola con film para.
Agregue siete mililitros de sacarosa al 7% en el fondo de un tubo de centrífuga poly aamer ultra de una pulgada por 3.5 pulgadas. A continuación, agregue siete mililitros de solución de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7% colocando lentamente la punta de la pipeta para pasta cerca del fondo de la pipeta de tubo. No debería tomar menos de 20 segundos verter cada capa.
Repita con siete mililitros de soluciones de sacarosa al 27%37% y al 47% cuando se haya perforado el gradiente. Debe observar líneas claras entre las capas que indican que se ha producido una mezcla mínima. Almacene todos los gradientes de cuatro grados centígrados durante la noche, junto con los rotores, botellas y tubos que se utilizarán para recolectar muestras.
Para preparar extractos de células de levadura, comience cultivando cien 25 mililitros de cultivo de levadura hasta un OD 600 de 0,8 a uno. Agregue cyclo heide al cultivo hasta una concentración final de 100 microgramos por mililitro y continúe agitando a 30 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, vierta el cultivo en una botella centrífuga de 250 mililitros y llénela con hielo.
Mantenga todo en hielo a partir de este punto centrífuga a 8.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Resus, suspender el pellet en 10 mililitros de hielo, lisis en frío, tampón, y transferir a tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugar a 5.900 veces la gravedad durante tres minutos a cuatro grados Celsius Resus.
Suspender el pellet en 0,5 mililitros de tampón de lisis. Transfiera la suspensión a un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros y luego agregue 0,5 mililitros de perlas de vidrio lavadas con ácido horneadas frías. Agita las células durante cuatro intervalos de 32º, llamando al tubo a hielo durante 30 segundos entre cada intervalo.
A continuación, añada otros 0,5 mililitros de tampón de lisis en la centrífuga de tubo de 1,5 mililitros 5.000 veces. Gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a máxima velocidad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Por último, transfiera el supinato a un nuevo tubo micro centri de 1,5 mililitros. El extracto se puede almacenar a menos 80 grados centígrados para transferir el lisado al gradiente de sacarosa. Coloque la punta de la pipeta contra la pared del tubo cerca de la superficie del degradado y coloque suavemente el lisado sobre el degradado.
Para un gradiente de 35 mililitros, normalmente se cargan 500 microlitros de lisado. Con pinzas, baje con cuidado el gradiente en el cucharón de un rotor de cucharón oscilante. Centrifugar los gradientes a 100.000 veces la gravedad durante cuatro horas a cuatro grados centígrados.
Aproximadamente 30 minutos antes de la finalización del giro de cuatro horas. Conecte la aguja al perforador de tubos y conecte la pluma al monitor de fluorescencia de absorbancia en línea. Encienda el monitor de absorbancia para permitir que se alcance una línea de base estable antes de analizar las muestras.
La adquisición electrónica del perfil PolyZone se puede obtener fácilmente en tiempo real conectando una unidad de adquisición de datos DI 1 48 U. En el registrador gráfico, llene la bomba de jeringa con 50 mililitros de nueces de florín utilizando el ajuste rápido de flujo inverso. Asegúrese de que no haya burbujas de aire.
Conecte la manguera de la jeringa al perforador de tubos. Y encienda brevemente el flujo de Flo inerte a seis mililitros por minuto en la dirección de avance. Para limpiar la manguera de cualquier burbuja de aire, coloque una serie de tubos debajo de la manguera en el extremo de la celda de flujo para recolectar la escorrentía de la muestra.
Prepare una cubitera con un pocillo preformado para sujetar el tubo de centrífuga que contiene el gradiente de sacarosa. Cuando se complete la centrifugación de cuatro horas, retire con cuidado los tubos de centrífuga del rotor de la centrífuga y colóquelos en hielo. Teniendo cuidado de no perturbar los pendientes.
Para analizar los extractos de células, coloque el tubo de gradiente en el perforador de tubos y conecte la parte superior del tubo a la salida y asegúrelo. Eleve la etapa inferior hasta el tubo de centrífuga para que la aguja perfore la parte inferior del tubo. Comience el flujo de alerta de florín en la dirección de avance a seis mililitros por minuto.
Una vez que la ranura haya comenzado a fluir hacia el tubo, controle el movimiento de la aguja en el monitor de absorbancia UV en línea. Una vez que la aguja comience a moverse, encienda el movimiento del gráfico a una velocidad de 60. Cuando se haya alcanzado el final del perfil de polirribosoma, corte el flujo de Flo inerte al tubo de centrífuga y detenga el movimiento del gráfico en el monitor de fluorescencia de absorbancia.
Retraiga el Flo inerte del tubo de centrífuga hacia la jeringa comenzando el flujo en la dirección inversa a una velocidad rápida, asegurándose de no extraer sacarosa del tubo a la jeringa. Desenrosque el tubo de centrífuga del perforador de tubos, baje la aguja y retire el tubo. Aquí se muestra una traza representativa de un extracto de ribosoma preparado a partir de levadura en presencia de cicloheide.
Se indican picos de absorbancia UV que contienen polirribosomas y ribosomas A TS 60 s y 40 s. Acabamos de mostrarle cómo realizar el análisis de polirribosomas al realizar este procedimiento. Es importante recordar que hay que trabajar rápidamente, manteniendo las muestras frías y libres de ARN.
Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte en tus experimentos.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para extraer ribosomas en proceso de traducción de células eucariotas, lo que permite el análisis de diferentes poblaciones ribosomales. El método consiste en separar los ribosomas en monosomas y polirribosomas mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa, lo cual es esencial para estudiar la regulación de la traducción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética
Antecedentes
- Comprender la función del ribosoma es fundamental para estudiar la síntesis de proteínas.
- El perfilado de polirribosomas proporciona información sobre la regulación de la traducción.
- Las técnicas de extracción de ribosomas son fundamentales en la investigación de biología molecular.
- Los factores ambientales y las mutaciones pueden alterar la síntesis de proteínas.
Objetivo del estudio
- Separar y comparar fracciones de monorribosomas y polirribosomas provenientes de lisados celulares.
- Visualizar diferentes poblaciones ribosomales mediante rastreo con UV.
- Analizar cambios en la traducción bajo diversas condiciones experimentales.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células eucariotas y preparación de lisados celulares.
- Centrifugación mediante un gradiente de sacarosa.
- Faccionamiento del gradiente para aislar poblaciones ribosomales.
- Visualización de perfiles ribosomales mediante monitoreo de absorbancia UV.
Resultados principales
- Separación exitosa de monosomas y polirribosomas.
- Visualización clara de las poblaciones ribosomales mediante rastreo de UV.
- Análisis de la regulación de la traducción bajo diferentes condiciones.
- Información sobre el impacto de las mutaciones en la síntesis de proteínas.
Conclusiones
- El protocolo es un estándar de oro para estudiar la regulación de la traducción.
- Permite a los investigadores analizar eficazmente la dinámica ribosómica.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos moleculares de la traducción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis del perfil de polirribosomas permite a los equipos de biofármacos investigar los mecanismos de control traduccional y detectar defectos en la síntesis de proteínas en puntos críticos de inflexión del descubrimiento. Este método proporciona información cuantitativa sobre la traducción global y específica de transcritos, respaldando la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista. Su adaptabilidad a diversos sistemas eucariotas garantiza una relevancia amplia para carteras en investigación y desarrollo de etapa temprana e investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación directa de la regulación traduccional bajo perturbaciones genéticas o ambientales.
- Apoya la desestimación mecanicista al distinguir defectos en la iniciación frente a la elongación/terminación.
- Facilita la validación funcional del blanco al cuantificar cambios en las relaciones polirribosoma-a-monosoma.
- Proporciona una plataforma para evaluar el impacto de intervenciones candidatas sobre la síntesis de proteínas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona lecturas cuantitativas validadas del compromiso ribosómico para la estandarización de ensayos.
- Permite la fraccionamiento reproducible y la detección basada en UV de poblaciones ribosómicas.
- Prepara extractos biológicos adecuados para flujos de trabajo de análisis de ARNm o proteínas posteriores.
- Facilita la cribado de compuestos que modulan la maquinaria de traducción o las vías reguladoras.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relaciona el descubrimiento de biomarcadores traducibles con conocimientos mecanicistas sobre la regulación de la síntesis proteica.
- Asegura la continuidad desde modelos celulares hasta sistemas preclínicos mediante la adaptación de protocolos en especies eucariotas.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al revelar defectos traduccionales asociados a modelos de enfermedad.
- Proporciona un contexto mecanicista para los fenotipos observados en estudios preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El perfilado de polirribosomas se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la interrogación guiada por hipótesis de la traducción, apoyando tanto la validación de objetivos como la identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la producción traduccional y aclara los mecanismos reguladores específicos de la vía.
- Selección: Ofrece fraccionamiento robusto y cuantitativo y salidas de absorbancia UV listas para ensayos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas en tiempo real de poblaciones ribosomales para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta modelos celulares y preclínicos mediante la adaptación de protocolos y la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para diversos estudios traduccionales y mecanicistas en múltiples programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de control traduccional.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de extracción, fraccionamiento y detección para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al revelar cuellos de botella traduccionales y apoyar la selección eficiente del portafolio desde el punto de vista financiero.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y modelos basada en la fidelidad traduccional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de ribosomas y técnicas de fraccionamiento en gradiente.
- Exige acceso a instrumentación de ultracentrifugación y de absorbancia UV.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para obtener resultados reproducibles.
- Adaptable a sistemas de levadura y mamíferos con modificaciones del protocolo según sea necesario.
- La integridad de la muestra y condiciones libres de RNasas son fundamentales para obtener resultados confiables.
