Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células madre adultas de los tejidos blandos musculoesqueléticos, como el músculo esquelético. Esto se logra tomando primero una biopsia del tejido blando, desbridándolo y cortándolo finamente. El segundo paso del procedimiento es digerir enzimáticamente el tejido.

El tercer paso del procedimiento es aislar las células madre a través de repetidos pasos de presiembra. El paso final del procedimiento es la identificación de las células madre aisladas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los comportamientos morfológicos y celulares de las células mediante inmunofluorescencia, microscopía y/o citometría de flujo.

Hola, soy Lee del Laboratorio de Patología Molecular del Departamento de Cirugía Ortopédica de la Universidad de Pittsburgh. Hoy te mostraré cómo aislar una célula madre adulta de los tejidos blandos del sistema esquelético Mus, como el músculo esquelético. Hola, soy el Dr. Johnny Ward.

Soy profesor en la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh dentro del Departamento de Cirugía Ortopédica. He estado trabajando estrechamente con el Dr. Young Lee y estos procedimientos para aislar, ya sabes, diferentes tipos de células madre del músculo esquelético y alterar tejidos como el estándar. Utilizamos los procedimientos de nuestro laboratorio para aislar células madre para estudios de investigación básicamente sobre las aplicaciones de la medicina traslacional.

Así que vamos a estudiar. Los tejidos de los que se pueden aislar las células madre incluyen tendones y músculos esqueléticos extraídos de los músculos de la tibia o el sóleo de la extremidad trasera de ratones de tipo salvaje. Después de eliminar los restos de piel y hueso, coloque los pañuelos en un plato que contenga HBSS frío suplementado con 5% de FBS.

A continuación, coloque el pañuelo por separado en platos recubiertos de colágeno que contengan HBSS frío. Utilizaremos tejidos musculares esqueléticos para demostrar los procedimientos básicos para la disociación y digestión de tejidos. Utilice microtijeras y/o hojas de bisturí para picar los tejidos esqueléticos y convertirlos en una digestión enzimática de pH grueso de los tejidos.

Comience transfiriendo los lodos de tejido MIT a tubos separados de 15 mililitros en una centrífuga a aproximadamente 3.500 RPM a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire el lavado SANE de Resus suspendiendo un HBSS y repita la centrifugación. Después de retirar el supernat, digiera los lodos añadiendo 10 mililitros de colagenasa precalentada al 0,2%.

El tipo 11 incuba durante 60 minutos a 37 grados centígrados, agitando los tubos con la mano cada 10 minutos cuando se realiza la incubación de 60 minutos. Centrifugar y luego resuspender los lodos en 10 mililitros de solución espacial DYS. Incubar durante 45 minutos a 37 grados centígrados, agitando con la mano cada 10 minutos después de la centrífuga de incubación de 45 minutos y resus suspender los lodos en 10 mililitros de 0,2% en solución HBSS.

Por lo general, incubamos durante 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados mientras invertimos los tubos cada 10 minutos, la incubación es completa. Cuando se liberan suficientes células individuales de los tejidos, como se ilustra aquí, centrifugar las células resultantes y volver a suspender la célula en cinco mililitros de proliferación. Las PM medias disocian la suspensión celular haciendo pasar el extracto a través de una serie de agujas dos veces a través de una aguja de calibre 18, luego una vez a través de una aguja de calibre 23 y finalmente una vez a través de una aguja de calibre 27.

Por último, pase el extracto de células a través de un colador de células de 70 micras para comenzar la técnica de preparación. Centrifugar el extracto celular que se acaba de preparar y volver a suspender los gránulos en proliferación. Placa mediana cinco mililitros de la mezcla celular en un matraz T 25 recubierto de colágeno y comercializar como PP uno incubado a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante dos horas.

Después de dos horas. Transfiera las células no adherentes a un nuevo matraz T 25 recubierto de colágeno y comercialice como PP dos. Añada cinco mililitros de PM en el matraz T 25 anterior etiquetado como PP uno.

Regrese ambos matraces a la incubadora durante 24 horas. Después de 24 horas, transfiera las células no adherentes de PP dos a un nuevo matraz T 25 recubierto de colágeno ENC y márquelo como PP tres. Añada cinco mililitros de medio de proliferación en el matraz etiquetado como PP dos.

Regrese los matraces a la incubadora. Repita el procedimiento cada 24 horas hasta la población PP seis. Se crea la población de células madre.

Las seis células PP aisladas son muy pocas en número y necesitan ser mantenidas en un medio de proliferación rico en FBS. Eso ha cambiado a diario. Aunque la mayoría de las células en el cultivo PP six morirán durante las siguientes una o dos semanas de cultivo.

Por lo general, se crea una población grande y saludable de PP seis después de una o dos semanas adicionales de expansión. Mantenga también todos los demás grupos de células en suspensión, permitiéndoles proliferar y examinándolas regularmente con un microscopio invertido. Las células adheridas tempranas que se adhieren a los matraces PP uno y PP dos son en su mayoría células fibróticas.

Células que se adhieren a los matraces recubiertos de colágeno después de un período de tiempo más largo dentro de las 48 a 96 horas. Los PP tres y PP cuatro son en su mayoría mioblastos. Mientras que las células satélite musculares a menudo se ven principalmente en PP 5, las células prepl posteriores 96 horas o más PP seis se consideran células madre adultas y parecen pequeñas, redondas y translúcidas.

Al comienzo de su aislamiento, se pueden caracterizar aún más mediante inmunohistoquímica por su expresión de marcadores de células madre como célula madre, antígeno uno y CDC 34. Acabamos de mostrarte cómo aislar células madre de una segunda masa de ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener los esteroides durante todos los procedimientos.

Una vez que se haya aislado la célula madre, asegúrese de cultivar esas células como de baja densidad para mantener las características de las células madre. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tu experiencia Y te deseo buena suerte para intentar usar esto en tu experimento.

Gracias.