Extracción de ADN de la pinza de la cola: un método utilizado en el genotipado del pez cebra

- Comience el procedimiento colocando un pez adulto anestesiado sobre una pila de papel absorbente. Ahora use una hoja de afeitar estéril para cortar la aleta caudal y transfiera rápidamente el pez a un tanque que contenga agua dulce para su recuperación. Transfiera la pinza de cola a un tubo limpio que contenga un tampón de lisis. El tampón de lisis contiene detergentes no iónicos, que solubilizan la membrana plasmática y la membrana nuclear de una célula. El tampón también contiene una enzima llamada proteinasa K que descompone las proteínas y permite la liberación de ADN en el lisado. También degrada las nucleasas, protegiendo el ADN de la digestión de las nucleasas.

Ahora, deje los tubos con pinzas de cola en una incubadora durante la noche para descomponer completamente el tejido a 55 grados centígrados con rotación continua. A continuación, caliente el tubo a 95 grados centígrados durante 15 minutos para inactivar la proteinasa K. Centrifugue el tubo para pellizar el material no digerido y transfiera el sobrenadante que contiene ADN a otro tubo. Agregue alcohol para precipitar el ADN y vuelva a centrifugar para recolectar el ADN en un gránulo. En el siguiente protocolo, aislaremos el ADN de la pinza de la cola de un pez cebra adulto y de un embrión entero.

- El día de la preparación del ADN, agregue proteinasa K fresca al tampón de lisis a una concentración de 1 miligramo por mililitro. El tejido se puede recolectar de un pez adulto usando un clip de aleta o de un pez embrionario.

Primero, anestesiar al pez en una solución de tricaína. Espere hasta que los movimientos branquiales sean más lentos. Luego, coloque el pescado en una pila de pañuelos y, con una hoja de afeitar estéril, corte un pequeño trozo de la aleta caudal de unos 2 a 3 milímetros de largo. Colocó rápidamente los peces en un tanque etiquetado con agua dulce para su recuperación.

Tome la pinza de aleta con una punta de pipeta estéril y transfiérala a un tubo lleno de cien microlitros de tampón de lisis de ADN. Asegúrese de etiquetar tanto el tanque del animal como el tubo. Incubar todos los tejidos recolectados durante al menos cuatro horas y hasta toda la noche a 55 grados centígrados.

Después de la incubación, inactive la proteinasa K calentando los tubos a 95 grados centígrados durante 15 minutos. Estas muestras deben usarse para PCR de inmediato, pero también se pueden almacenar a menos 20 grados Celsius durante un máximo de tres meses.