DNA-Extraktion aus dem Schwanzclip: eine Methode zur Genotypisierung von Zebrafischen

- Beginnen Sie die Prozedur, indem Sie einen betäubten erwachsenen Fisch auf einen Stapel saugfähigem Papier legen. Schneide nun mit einer sterilen Rasierklinge die Schwanzflosse ab und setze den Fisch schnell in ein Aquarium mit Süßwasser zur Erholung. Übertragen Sie den Schwanzclip in ein sauberes Röhrchen, das einen Lysepuffer enthält. Der Lysepuffer enthält nichtionische Detergenzien, die die Plasmamembran und die Kernmembran einer Zelle solubilisieren. Der Puffer enthält auch ein Enzym namens Proteinase K, das Proteine abbaut und die Freisetzung von DNA in das Lysat ermöglicht. Es baut auch Nukleasen ab und schützt die DNA vor der Nukleaseverdauung.

Lassen Sie nun die Röhrchen mit den Schwanzklammern über Nacht in einem Inkubator, um das Gewebe bei 55 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation vollständig aufzubrechen. Erhitzen Sie anschließend das Röhrchen 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um die Proteinase K zu inaktivieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um unverdautes Material zu pelletieren, und übertragen Sie den Überstand mit der DNA in ein anderes Röhrchen. Fügen Sie Alkohol hinzu, um die DNA auszufällen, und zentrifugieren Sie erneut, um die DNA in einem Pellet zu sammeln. Im folgenden Protokoll werden wir DNA aus dem Schwanzclip eines erwachsenen Zebrafisches und aus einem ganzen Embryo isolieren.

- Am Tag der DNA-Aufbereitung dem Lysepuffer frische Proteinase K in einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter zusetzen. Gewebe kann von einem erwachsenen Fisch mit einer Flossenklammer oder von einem embryonalen Fisch entnommen werden.

Zuerst wird der Fisch in Tricainlösung betäubt. Warten Sie, bis sich die Kiemenbewegungen verlangsamen. Dann legst du den Fisch auf einen Stapel Taschentücher und schneidest mit einer sterilen Rasierklinge ein kleines, etwa 2 bis 3 Millimeter langes Stück der Schwanzflosse ab. Setze den Fisch schnell in ein beschriftetes Aquarium mit frischem Wasser zur Erholung.

Nehmen Sie den Flossenclip mit einer sterilen Pipettenspitze auf und geben Sie ihn in ein Röhrchen, das mit einhundert Mikrolitern DNA-Lysepuffer gefüllt ist. Achten Sie darauf, sowohl das Aquarium des Tieres als auch den Schlauch zu beschriften. Inkubieren Sie das gesamte gesammelte Gewebe mindestens vier Stunden lang und bis zu Nacht bei 55 Grad Celsius.

Nach der Inkubation inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen. Diese Proben sollten sofort für die PCR verwendet werden, können aber auch bis zu drei Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.