Monitorización del microambiente tumoral basada en PTM: un método para rastrear los cambios en la rigidez de la MEC mediante esferoides tumorales

- En la invasión tumoral, las células tumorales periféricas experimentan una transición epitelial a mesenquimal o EMT, lo que resulta en la degradación local de la matriz extracelular o MEC. Podemos estudiar in vitro la interacción de las células tumorales con la MEC.

Para estudiar estas interacciones, transfiera un esferoide preformado derivado de células tumorales pancreáticas a una placa que contenga andamio de colágeno junto con sondas trazadoras fluorescentes integradas y medios de cultivo. El esferoide tumoral libera proteasas, que degradan el colágeno y reducen la rigidez de la MEC, lo que resulta en el libre movimiento de las sondas trazadoras en la MEC.

Incube la placa durante el tiempo deseado. Observe la muestra bajo un microscopio óptico para observar la cuadrícula de puntos de muestra en el andamio de colágeno y grabar datos de video a partir de ellos. La región de la matriz cerca del esferoide muestra la máxima degradación del colágeno. Por lo tanto, ha aumentado el movimiento de la sonda. Por el contrario, el área más alejada del esferoide muestra una menor degradación del colágeno, lo que resulta en un movimiento restringido de las moléculas de la sonda.

Esta técnica de examinar las propiedades reológicas de la MEC mediante la medición de las trayectorias de las partículas trazadoras se conoce como microrreología de seguimiento de partículas o PTM. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de formación de esferas para identificar las células madre del cáncer de páncreas y evaluar el efecto de la metformina.

Para empezar, prepare una estación de trabajo dentro de una campana de flujo laminar con dos viales de 2 mililitros. El vial 1 contendrá el esferoide tumoral y el vial 2 será un control libre de células. Prepare una mezcla diluida de sondas trazadoras fluorescentes de 1 micra de diámetro modificadas con carboxilato agregando 2 partes de sondas de culata a 25 partes de agua estéril.

Saca un frasco de 3,1 miligramos por mililitro de colágeno bovino del refrigerador y colócalo sobre hielo. Alícuota 125 microlitros de colágeno seguidos de 50 microlitros de solución diluida de sonda trazadora en el vial 1. Vórtice brevemente para distribuir las sondas.

A continuación, añada 235 microlitros de medios de cultivo celular apropiados que contengan rojo de fenol para un volumen total de 410 microlitros y vórtice brevemente antes de retirar 205 microlitros y colocarlos en el vial 2. A continuación, agregue aproximadamente 2 microlitros de hidróxido de sodio 1 molar al vial 1 para que la solución vuelva a tener un pH neutro. Vórtice brevemente para mezclar. Luego, regrese a la rejilla de hielo inmediatamente para que la mezcla no comience a curarse.

Retire suavemente 40 microlitros de medio del pocillo que contiene el esferoide tumoral. Conserve estos 40 microlitros mientras realiza el siguiente paso. Revise el pozo para ver si el esferoide se eliminó en el paso anterior. Si no es así, vuelva a colocar los 40 microlitros en el pozo y repita el paso anterior.

Si es así, agregue los 40 microlitros que contienen el esferoide al vial 1. Revuelva suavemente el frasco 1 antes de transferir la mezcla en porciones de 60 microlitros a tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccione cada pocillo con un microscopio después de agregar la mezcla para determinar qué pocillo contiene el esferoide.

A continuación, añada aproximadamente 2 microlitros de hidróxido de sodio 1 molar y 40 microlitros de medios de cultivo celular al vial 2 y al vórtice antes de alícuota 60 microlitros de esta mezcla en un pocillo vacío en la placa de 96 pocillos y etiquetarla como un control libre de células. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados para que se cure durante al menos una hora.

Para construir una cuadrícula de puntos de muestreo, primero, transfiera la placa de muestra de la incubadora a la etapa del microscopio. Espere 10 minutos para que la muestra se equilibre a temperatura ambiente si no se dispone de una etapa calentada. Observe la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que esté intacta y lista para la obtención de imágenes. Determine la posición del tumor dentro del pocillo y documéntelo con una imagen de luz transmitida para su posterior corregistro espacial.

Por lo general, 20 puntos de muestra en cada pocillo distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide producirán resultados adecuadamente detallados. Mueva la platina a cada posición deseada y utilice el software de interfaz del microscopio para registrar las coordenadas x e y.

Cambie el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia y seleccione el cubo de filtro adecuado para la longitud de onda de excitación de las sondas trazadoras. Con la lista de puntos creados, desplácese hasta el primer punto de la cuadrícula. Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo antes de moverse hacia arriba para encontrar un campo de visión que contenga varias sondas trazadoras enfocadas.

Observe el histograma de intensidad y ajuste la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible y asegurarse de que la imagen no se sature. Obtenga una secuencia de vídeo a una velocidad de fotogramas de 20 a 30 milisegundos por fotograma y guárdela con una convención de nomenclatura adecuada. Durante la grabación, no toque el microscopio ni la mesa.

Repita la grabación para cada punto de muestra de la cuadrícula. A continuación, proceda a repetir el proceso para construir una cuadrícula para cada pozo del experimento y repita todo el proceso para cada punto de tiempo durante la duración del seguimiento longitudinal.