Transgénesis del pez cebra mediada por transposones Tol2: un procedimiento para generar peces cebra transgénicos tras la coinyección del sistema Tol2 en embriones fertilizados de pez cebra

Comience con embriones viables de pez cebra en etapa unicelular colocados en los pocillos de un molde de microinyección.

Cargue una aguja de microinyección con una solución que contenga ARNm que codifica para la transposasa Tol2 y plásmidos donantes de transposones. Los plásmidos comprenden un promotor ubicuo del pez cebra y un gen codificante de proteínas fluorescentes flanqueado por brazos de transposones Tol2.

Inyecte con cuidado la solución de microinyección en el citoplasma del embrión de pez cebra. Dentro de la célula, los ARNm de la transposasa Tol2 se traducen en proteínas de la transposasa Tol2 y se transportan activamente al núcleo.

Los sitios Tol2 en el plásmido donante comprenden repeticiones terminales invertidas específicas, o ITR, que flanquean el gen reportero. Los RTI están flanqueados por repeticiones cortas y directas. Las proteínas transposasas reconocen y se unen a los sitios ITR, formando una horquilla en el ADN flanqueante. Las transposasas escinden aún más la construcción del transposón del ADN flanqueante, liberándolo del plásmido y dejando atrás repeticiones cortas y directas.

Las transposasas crean una rotura escalonada de doble cadena en el genoma de la célula somática e insertan la construcción del transposón en el sitio del genoma. El relleno de los espacios de los extremos escalonados por la ADN polimerasa seguido de la ligadura de las muescas crea repeticiones cortas y directas.

La ligadura provoca la integración estable de la construcción de transposones en el genoma de la célula somática, y el promotor facilita la expresión de proteínas fluorescentes. Incubar los embriones inyectados. Durante el desarrollo embrionario, las células somáticas dan lugar a diferentes tipos de células y crean peces cebra transgénicos.