Name: Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a controlar patrones de expresión génica mediante optogenética en células C2C12 para estudiar la comunicación celular. Este método permite analizar la transferencia de información oscilatoria entre células con alta precisión.

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Este trabajo fue apoyado por JST, PRESTO (A.I.), núcleo investigación evolutiva de la ciencia y tecnología (JPMJCR12W2 (r)), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón 26119708 (e) y 16 H 06480 (R.K.)), científico (A) (sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) 24240049 (r)), de investigación y jóvenes científicos (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) y subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras "de la fluorescencia Vivo imagen"del MEXT, Japón y plataforma para enfoques dinámicos a vivos de MEXT, Japón.

1. generación de líneas celulares estables por el sistema de Tol2
<ol><li>
Transfectar vectores plásmido (figura 1A) de módulos basados en Tol2 optogenetic junto con el vector de expresión de la transposasa (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) en las células C2C12. En todas las etapas, células en cultivo con medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina a 37 ° C (tabla 1), en presencia de 5% CO2, denotada lo contrario.
	<ol>
<li>Contar células tripsinizaron con un contador de células y placa de 5 x 104 C2C12 células por pocillo en una placa de 12 pozos un día antes de la transfección.</li>
		<li>Co transfectar 0,375 μg de vectores basados en Tol2 optogenetic (pAI177 o pAI218), 0.125 μg de un vector de la selección de medicamentos (pAI170) y 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector utilizando reactivo lipofection.</li>
		<li>Trypsinize células transfected y les placa de en platos de cultivo de 100 mm un día después de la transfección.</li>
		<li>Cambio de medio de cultivo para células transfected a medio de cultivo suplementado con 100 mg/mL Higromicina.</li>
		<li>Células en cultivo durante 3 días eliminar transfected las células. Tenga en cuenta que medio cambio no es necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsinize células transfected y purificar una población de células que expresan proteínas fluorescentes para la selección. Para las células del receptor con pAI177, establezca la puerta de la clasificación en canal verde-PE para la purificación de la población de células mCherry-positiva. Para las células fotosensibles remitente llevar pAI218, establezca la puerta de la clasificación en canal APC para la purificación de la población de células iRFP713-positiva.</li>
	<li>(opcional) Establecer una población clonal de la célula por métodos estándar, tales como dilución limitada o unicelulares clasifica por FACS.</li>
</ol>2. evaluación de la foto-sensibilidad de las células de ingeniería a nivel de población
Nota: Esta parte describe un protocolo para comprobar la inducción dinámica de proteínas de ligando Dll1 con iluminación de luz azul por ensayos bioquímicos, tales como qPCR y Western blotting.
<ol><li>Establecer dos tipos de incubadoras con o sin fuentes de luz para una condición inducida por la luz o una afección oscurezca, respectivamente. Configuración-intensidad de la luz de un LED azul trans-iluminador, como se muestra en la figura 1B, utilizando un medidor de luz. Programa horarios y duración de iluminación de luz cargando un script de control a un micro-controlador de una placa que permite horarios programables para la iluminación (figura 1).</li>
	<li>Contar las células tripsinizaron con un contador de células y placa de 1.0 x 105 emisor fotosensible células con pAI218 y pAI170 en los platos de la cultura plástica de 35 mm de diámetro (más de 12 platos de condición de luz y 1 plato de condición oscura) y los platos en incubadoras para condiciones de luz/oscuridad se separan. Después de la creación de platos, mantenga las puertas de las incubadoras cerraron hasta recoger lysates de la célula.</li>
	<li>Uno y medio días después de la galjanoplastia, empezar a luz (las células se esperan que más del 80% confluente). No se exponga a la luz para evitar indeseable foto-estimulación de las células. Nota: Horarios de iluminación depende del propósito de los experimentos. Tenga en cuenta que una condición de iluminación continua (por ej. intervalos de duración y 10 minutos de 1 minuto con 40 μmol/m2/s-intensidad de la luz) es suficiente para un simple control de inducción de foto y esa iluminación luz fuerte es perjudicial para las células. Así, asegúrese de que se seleccionan parámetros inofensivos para la iluminación.</li>
	<li>Aproximadamente 2 días después de la galjanoplastia, preparar cell-lisado con intervalos de 30 min. Hacia platos muestra de incubadoras en hielo y comienza a preparar los lysates de la célula para su posterior análisis.</li>
</ol>3. dinámica de emisor y receptor ensayo a nivel de población: monitoreo en tiempo real de respuestas celulares al estímulo óptico por PMT
<ol><li>Trypsinize y cuenta el número de remitente y el receptor las células con métodos estándar. Preparar un volumen total de 1 mL de la mezcla de suspensión de 2.5 x 104 receptor y 1.25 x 105 células de remitente (proporción 1:5). Nota: 2:1, 1:1, o 1:2 relación de emisor-receptor también funciona con un número total de células de 1.5 x 105. 10
</li>
	<li>Placa mixta células en cada pocillo de las placas de 24 pocillos negras con medio de cultivo con luciferin 1 mM.</li>
	<li>Analizar las células en el lector de placas para ensayo de luciferasa y confirmar que las señales de salida no son demasiado altas para el sistema de grabación. Nota: Si las señales de salida son mayores que 1 x 106 fotones cuenta/s, puede estar saturados. En ese caso, disminuir la concentración de luciferin valores óptimos para que las señales de salida son menores que 1 x 106 fotones cuentas/s.</li>
	<li>Coloque la placa en el sistema de grabación y comenzar un programa de grabación (figura 1). Por ejemplo, iniciar la iluminación de la luz a las 18 h después de configurar la grabación. Nota: Filtrado Temporal, tales como señales robustos con móviles promedio y Savitzky-Golay filtrado, son útil para la visualización de formas de onda y las detecciones de pico.</li>
</ol>4. dinámica de emisor y receptor análisis a nivel unicelular: en tiempo real imágenes de unicelular respuestas bajo el Control de perturbación Optogenetic
<ol><li>Placa de 0,5 x 105 receptor y 2.5 x 105 células de remitente en platos de base 27 mm vidrio diámetro 35 mm de diámetro. Asegurarse de que proporciones de mezcla y un número de celular total (una densidad de la célula) están ajustadas correctamente.</li>
	<li>Un día después de la galjanoplastia, intercambio medio con 2 mL de medio de grabación (rojo de fenol libre DMEM suplementado con 5% FBS, penicilina-estreptomicina y luciferin de 1 mM) y el plato base de cristal en el microscopio. Si es necesario, eliminar restos de células muertas con PBS (-). Nota: Es preferible hacer este paso en una condición oscura.</li>
	<li>Configurar un microscopio invertido, dotado de una cámara a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Configurar una cámara CCD refrigerada. Asegúrese de que se haya enfriado la temperatura del sensor CCD en el valor de destino (normalmente,-90 ° C).</li>
	<li>
Establecer parámetros para la ventana de "Lapso de tiempo multidimensional" en el software de adquisición automática para capturar imágenes con intervalos de 5 min y más de 288 veces (más de una grabación durante la noche).
	<ol>
<li>Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione un canal de la luminiscencia y un modo de lectura lenta de 50 kHz en el menú desplegable y ajuste binning 4 x 4 con 4 min de exposición. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo lento de 50 kHz, que es crítico para la reducción de ruidos de lectura para detectar la débil emisión luz bioluminiscente.</li>
		<li>Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione canales de fluorescencia y un modo rápido de lectura de 1 MHz en el menú desplegable y sistema 2 x 2 binning con exposición de 400 ms. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo rápido de 1 MHz para reducir el tiempo necesario para la proyección de imagen de la fluorescencia.</li>
		<li>Start Time-lapse de grabación haciendo clic en "Adquirir".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraiga el unicelular rastros de canales de luminiscencia de películas Time-lapse por software de análisis de imagen, como sigue. En primer lugar, hacer imágenes de pila de luminiscencia y fluorescencia mediante la importación de los datos de imagen a software de análisis de imagen. Imágenes de luminiscencia, quitar píxeles calientes derivados de los rayos cósmicos mediante la comparación de las intensidades de los píxeles de imágenes temporal adyacentes, reemplazando los valores de píxel para el promedio temporal de los fotogramas anteriores y siguientes (implementado como filtro"SpikeNoise"), Estas imágenes procesadas se aplica un filtro espacial suavizado y restar valores de píxeles de fondo de out-field vistas de cada fotograma. A continuación, determinar una "región de interés" (ROI) para cada celda en una imagen fluorescente en cada momento, el retorno de la inversión se aplica a imágenes luminiscentes, y medir la intensidad luminiscente de cada retorno de la inversión.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
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<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
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<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mostramos un método para controlar la dinámica de expresión de genes con una periodicidad de 2 a 3 h. Esta escala de tiempo es mucho más corta que los de otros sistemas convencionales, incluyendo el sistema Tet y el original sistema de LightOn. Parámetros clave para llegar a las escalas de tiempo ultradianos son la vida media de productos molecular inducida por la foto, mRNAs y proteínas. Estos parámetros cinéticos pueden depender de las especies y tipos celulares. Para afinar la cinética, sustituir secuencias de Hes1 3'...

Comunicación de célula a célula juega papeles críticos en modelar embrionario en procesos de desarrollo. En embriones de vertebrados, las estructuras metaméricos, llamadas somitas se forman a lo largo del eje corporal antero-posterior con una precisa exactitud temporal bajo el control de un reloj de tiempo, llamado el reloj de segmentación1. Durante este proceso, un grupo de células del mesoderm presomitic (PSM) se convierten periódicamente en somitas en forma sincrónica. Este proceso implica la expresión génica oscilatoria sincronizada y forma de las células PSM que oscilan en fase el mismo somitas. El período de la expresión génica oscilatoria es alrededor de 2 a 3 h en ratones y unos 30 min en el pez cebra. Cuando disociado, PSM células pierden la sincronía2,3, pero cuando son nuevamente agregadas, puede auto-organizarse y recuperar la población sincronía4, sugiriendo que el acoplamiento de la célula es una clave para la sincronización oscilaciones.
Esfuerzos extensos revelaron que moléculas de señalización en la vía de Notch Delta están conectadas firmemente a las oscilaciones sincronizadas de los genes de reloj de segmentación. Inhibidores farmacológicos o mutaciones genéticas de la señalización de Notch desincronizando la población de los osciladores. En el pez cebra, mutantes de la muesca señalización componentes como DeltaC, DeltaD y Notch1a, Mostrar oscilaciones asincrónicas5,6. En embriones de pollo o el ratón, el ligando de Notch Delta-like1 (Dll1), sino también el muesca modulador Lunatic fringe (Lfng) se requiere para oscilaciones sincronizadas7,8,9. Sin embargo, ha sido difícil para poner a prueba la capacidad funcional de estas moléculas para la transferencia de información dinámica de célula a célula, porque las resoluciones temporales de perturbación convencional de la dinámica de regulación gen no eran suficientes para investigar la procesos de escalas de tiempo de 2-3 h (Ritmos ultradianos).
Recientemente hemos desarrollado un método integrado para controlar y supervisar patrones de expresión de genes en células de mamíferos10. Esta tecnología permite la inducción de pulsos de expresión del gene por iluminación de luz periódica en escalas de tiempo ultradianos. Este protocolo representa los métodos para establecer líneas de células fotosensibles y observar respuestas dinámicas de las células de reportero por luminiscencia de células vivas en los contextos de la comunicación de célula a célula. Este método es aplicable para el análisis de muchas otras vías de señalización.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>dispositivo Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador LED azul</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (placa negra de 24 pocillos)</td> <td>Alta tecnología</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina Potasio Sal</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de luz</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A anticuerpo</td> anti-HA-peroxidasa <td></td></tr><tr><td></td><td>clon de Roche 3F10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-actina-peroxidasa</td><td>clon de wako</td><td>2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Células deben responder correctamente al cambio temporal de entornos, que están influidos por varios factores desde que rodea las células. La muesca que se vía de señalización es una de dichas máquinas moleculares esenciales para la comunicación de célula a célula, que juega un papel clave en el desarrollo normal de embriones. Esta vía consiste en una transferencia de célula a célula de información oscilatoria con Ritmos ultradianos, pero a pesar de los avances en técnicas de biología molecular, ha estado desafiando a dilucidar los efectos de interacciones multicelulares gen oscilatoria dinámica. Aquí, presentamos un protocolo que permite optogenetic control y seguimiento directo de los patrones de expresión génica de manera temporal precisa. Este método con éxito reveló que entradas periódicas intracelulares e intercelulares de la señalización de Notch arrastrar las oscilaciones intrínsecas por sintonización de frecuencias y fase de cambio en la resolución de unicelulares. Este enfoque es aplicable para el análisis de las características dinámicas de varias vías de señalización, ofreciendo una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Adaptamos el LightOn sistema11,12, que permite la expresión del gen foto-inducida en células de mamíferos, el estudio de los osciladores genéticos con periodicidad de 2 - 3 h. Este sistema consta de dos partes: el hGAVPO activador transcripcional inducible por la foto y un cassette de promotor de UAS a transcripción unidad arbitraria genes de interés. Para acelerar la cinética pulsátil de la expresión génica inducida por la foto, ...

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

El objetivo general de este experimento es observar la transferencia de información oscilatoria de célula a célula mediante el control optogenético y el monitoreo en vivo de la expresión génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las células se comunican entre sí a través de la vía de señalización Notch, en particular sobre cómo las células transmiten la información oscilatoria entre sí. La principal ventaja de esta técnica es que podemos controlar y monitorizar la dinámica de la expresión génica con una precisión muy alta.La demostración del procedimiento estará a cargo de Akihiro Isomura, un investigador de mi laboratorio que desarrolló esta nueva tecnología. Para transfectar vectores plásmidos de módulos optogenéticos basados en Tol2 junto con el vector de expresión de la transposasa en células C2C12, primero se cuentan las células tripsinizadas con un contador de células. Coloque 50.000 células C2C12 por pocillo en una placa de 12 pocillos un día antes de la transfección.A continuación, transfecte conjuntamente 0,375 microgramos de vectores optogenéticos basados en Tol2, 0,125 microgramos de un vector de selección de fármacos y 0,5 microgramos del v

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

La luz de bioluminiscencia emitida por una enzima luciferasa que oxida un sustrato de molécula pequeña, una luciferina, se puede aprovechar para activar proteínas fotosensoriales, agregando así otra dimensión a la estimulación de la luz y permitiendo la manipulación de una multitud de funciones mediadas por la luz en las células a través de escalas temporales y espaciales.

Optogenética bioluminiscente 2.0: Aprovechamiento de la bioluminiscencia para activar proteínas fotosensoriales in vitro e in vivo

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Este protocolo implica la transfectación de sensores de cAMP y bPAC-nLuc, una proteína optogenética, para rastrear con precisión su distribución celular y su respuesta a la estimulación lumínica. El enfoque innovador de crear un mapa de respuesta de AMPc utilizando un sistema de escaneo de puntos tiene el potencial de avanzar en la investigación con proteínas optogenéticas en diferentes campos.

Mapeo de la distribución celular de una proteína optogenética mediante una rejilla de estimulación lumínica

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende a controlar patrones de expresión génica mediante optogenética en células C2C12 para estudiar la comunicación celular. Este método permite analizar la transferencia de información oscilatoria entre células con alta precisión.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

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