Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

El objetivo general de este experimento es observar la transferencia de información oscilatoria de célula a célula mediante el control optogenético y el monitoreo en vivo de la expresión génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo las células se comunican entre sí a través de la vía de señalización Notch, en particular sobre cómo las células transmiten la información oscilatoria entre sí. La principal ventaja de esta técnica es que podemos controlar y monitorizar la dinámica de la expresión génica con una precisión muy alta.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Akihiro Isomura, un investigador de mi laboratorio que desarrolló esta nueva tecnología. Para transfectar vectores plásmidos de módulos optogenéticos basados en Tol2 junto con el vector de expresión de la transposasa en células C2C12, primero se cuentan las células tripsinizadas con un contador de células. Coloque 50.000 células C2C12 por pocillo en una placa de 12 pocillos un día antes de la transfección.

A continuación, transfecte conjuntamente 0,375 microgramos de vectores optogenéticos basados en Tol2, 0,125 microgramos de un vector de selección de fármacos y 0,5 microgramos del vector de expresión de la transposasa mediante el reactivo de lipofección. Tripsinizar las células transfectadas y colocarlas en placas de cultivo de 100 milímetros un día después de la transfección. Cambie el medio de cultivo de las células transfectadas por un medio de cultivo suplementado con 100 miligramos por mililitro de higromicina.

Cultive las células durante tres días para eliminar las células no transfectadas. Tenga en cuenta que no es necesario cambiar el medio. A continuación, tripsinar las células transfectadas y purificar una población de células que expresan proteínas fluorescentes para su selección mediante la clasificación de las células receptoras y fotosensibles, como se detalla en el protocolo de texto.

Configure dos tipos de incubadoras con o sin fuentes de luz para una condición inducida por la luz o una condición oscura. Utilice un medidor de luz para configurar la intensidad de la luz de un transiluminador LED azul. Mida la intensidad de la luz después de cerrar la puerta.

Programe los tiempos y la duración de la iluminación de la luz cargando un script de control en un microcontrolador de placa única que permite horarios programables para la iluminación. Cuente las células tripsinizadas con un contador de células y coloque 100.000 células emisoras fotosensibles que transportan pAI218 y pAI170 en placas de cultivo de plástico de 35 milímetros de diámetro. Coloque los platos en incubadoras separadas para condiciones de oscuridad y luz.

Después de colocar los platos, mantenga las puertas de las incubadoras cerradas hasta recolectar los lisados celulares. Un día y medio después del enchapado, inicie la iluminación ligera. No expongas las células a luz incontrolada para evitar fotoestimulaciones indeseables.

Por lo tanto, realice este paso sin abrir la puerta. Tenga en cuenta que abrir la puerta aquí es solo para demostración. Aproximadamente dos días después de la siembra, mueva las placas de muestra de las incubadoras al hielo en intervalos de 30 minutos y comience la preparación de los lisados celulares para su posterior análisis.

Para monitorizar en tiempo real las respuestas celulares a la estimulación óptica por PMT, primero se tripsiniza y se cuenta el número de células emisoras y receptoras con métodos estándar. Prepare una suspensión de volumen total de un mililitro de 25.000 pilas receptoras y 125.000 pilas emisoras. Coloque las células mezcladas en cada pocillo de placas negras de 24 pocillos con medio de cultivo que contenga luciferina un milimolar.

Analice las celdas en un lector de placas para el ensayo de luciferasa para confirmar que las señales de salida no son demasiado altas para el sistema de registro. A continuación, coloque la placa en el sistema de grabación e inicie un programa de grabación. Por ejemplo, inicie la iluminación de la luz a las 18 horas después de configurar la grabación.

Para obtener imágenes en tiempo real de las respuestas de una sola célula bajo el control de la perturbación optogenética, primero coloque 50.000 células receptoras y 250.000 células emisoras en placas de 27 milímetros de diámetro con base de vidrio y 35 milímetros de diámetro. Asegúrese de que las proporciones de mezcla y el número total de celdas estén correctamente ajustados. Un día después del enchapado, cambie el medio por dos mililitros del medio de grabación.

Coloque el plato con base de vidrio en un microscopio invertido equipado con una cámara ambiental a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Configura una cámara CCD refrigerada. Asegúrese de que la temperatura del sensor CCD se enfríe hasta el valor de destino.

Establezca los parámetros para la ventana de lapso de tiempo multidimensional en el software de adquisición automática para capturar imágenes con intervalos de cinco minutos y más de 288 veces. En la ventana de lapso de tiempo multidimensional, seleccione un canal de luminiscencia. Asegúrese de que el modo de lectura esté configurado en el modo de lectura lento de 50 kilohercios, que es fundamental para reducir los ruidos de lectura y detectar la luz bioluminiscente que emite débilmente.

En la ventana de lapso de tiempo multidimensional, seleccione los canales de fluorescencia. Asegúrese de que el modo de lectura esté configurado en el modo rápido de un megahercio para reducir el tiempo necesario para la obtención de imágenes de fluorescencia. Por último, configure el agrupamiento de dos por dos con una exposición de 400 milisegundos.

A continuación, seleccione una pestaña de diario para configurar horarios para estimular las células con iluminación periódica de luz azul. Haga clic en el botón más para agregar una nueva configuración de diario. Seleccione un archivo de diario de un cuadro de diario, elija varios puntos de tiempo y establezca valores en los cuadros de punto inicial e intervalo para programar la estimulación.

Asegúrese de que el archivo de diario especificado incluya protocolos secuenciales para seleccionar la iluminación, la apertura del obturador, el retardo, el cierre del obturador y el retardo. A continuación, establezca horarios para estimular las células con iluminación periódica de luz azul. Finalmente, inicie la grabación de lapso de tiempo haciendo clic en el botón Adquirir.

Por último, extraiga trazas de una sola celda de los canales de luminiscencia de las películas time-lapse, como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestran los resultados representativos de los ensayos optogenéticos emisor-receptor. Las células emisoras fotoinducibles produjeron patrones oscilatorios de expresión del ligando Delta en presencia de iluminación periódica con luz azul, como se esperaba.

Cuando las células receptoras se cultivan conjuntamente con las células emisoras fotosensibles y se exponen a una iluminación de luz repetitiva, un sistema de registro de bioluminiscencia en tiempo real detecta las respuestas cíclicas de las células receptoras en diversas condiciones de relaciones de mezcla. Además, la microscopía de lapso de tiempo con iluminación de luz repetitiva también revela las respuestas sincronizadas de las células receptoras a nivel de una sola célula. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran cómo se transfiere la información dinámica de la expresión génica en las interacciones célula-célula.