Knockout de múltiples genes mediado por concatemeros CRISPR: una técnica para eliminar simultáneamente múltiples genes mediante una vía de unión de extremos no homóloga en células intestinales de ratón

Para eliminar simultáneamente varios genes utilizando el sistema CRISPR-concatemer-Cas9, comience con un tubo que contiene la suspensión de células intestinales de ratón. Complemente el tubo con vectores concatemeros CRISPR que contengan el casete de expresión para múltiples ARN guía, o ARNg, integrados adyacentes entre sí.

Cada casete de ARNg está diseñado a medida para eliminar individualmente el gen previsto. Agregue vectores de expresión que codifican la endonucleasa Cas9 al mismo tubo. Electroporar la mezcla de plásmidos y células: una técnica que utiliza corriente eléctrica para facilitar la entrada de plásmidos en la célula. Dentro de la célula, la coexpresión del concatemero CRISPR y el vector Cas9 forma secuencias de ARNg y nucleasas Cas9, respectivamente.

Cada secuencia de ARNg se une a la enzima Cas9 correspondiente, formando múltiples complejos de ARNg Cas9 que se unen a los sitios objetivo en el genoma del huésped. Esta unión activa la enzima Cas9, que produce una muesca en ambas hebras de ADN aguas arriba del sitio del motivo adyacente del protoespaciador, o PAM. Esto da como resultado una rotura de doble cadena, o DSB, en el ADN objetivo.

En ausencia de cualquier secuencia homóloga al gen objetivo, se activa el mecanismo de reparación endógeno de la célula, llamado unión de extremos no homólogos, lo que permite que las proteínas de reparación y las moléculas de quinasa se unan en el sitio de ruptura. Más tarde, la enzima ligasa repara el DSB, lo que da lugar a modificaciones de la secuencia del gen diana. Estas modificaciones interrumpen la función de los genes, lo que resulta en la eliminación de múltiples genes.